有关FITC标记的事项.docx

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有关FITC标记的事项

免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。

在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

应用范围：

其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。

根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。

荧光的基本知识

一、荧光现象

（一）荧光的产生

　　一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。

　　荧光发射的特点是：

可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。

　　可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为光致荧光。

由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。

荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。

（二）荧光效率

　　荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。

荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。

　　荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）

　　发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。

各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。

选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。

（三）荧光的猝灭

　　荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。

一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。

因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。

在荧光抗体技术中常用一些非荧光的色素物质如亚甲蓝、碱性复红。

伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染，以减弱非特异性荧光本质，使特异荧光更突出显示。

常见荧光色素

许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。

只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。

常用的荧光色素有：

（一）荧光色素

1．异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。

分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：

有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。

其主要优点是：

①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

2．四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。

性质稳定，可长期保存。

结构式如下：

最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。

3．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）结构式如下：

最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。

与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。

其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。

（二）其他荧光物质

1．酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。

例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。

其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。

2．镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。

Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。

荧光素标记抗体的方法

（一）FITC标记抗体的方法

　　1．Marsshall氏法

（1）材料：

抗体球蛋白溶液、0.5mol/lpH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（25～50ml）、冰及冰槽（或1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500ml）、pH7.2或8.0的0.01mol/LPBS等。

（2）方法及步骤：

　　①抗体的准备：

取适量已知球蛋白浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。

　　②荧光素的准备：

根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。

　　③结合（或称标记）：

边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约5～10min内加完），加毕后，继续搅拌12～18h。

结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故须及时添冰去水；亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中。

　　④透析：

结合完毕后，将球蛋白的溶液离心（2500r/min）20min，除去其中少量之沉淀物，装入透析袋中后再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（0～4℃）过夜。

　　⑤过柱：

取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定）。

洗脱液：

0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）;过滤量:

12ml标记全球蛋白液（过滤前未透析）;收集量:

20ml（稀释1.7倍）。

　　分别以1mgFITC溶于2份1mol0.5mol/L碳酸重碳酸盐缓冲液（分别为pH9.5和pH9.0），于2℃下搅拌将其各加入100mg家兔IgG生理盐水溶液中，搅匀后立即将每份分为两半。

一半保留于2℃下，另一半置25℃下。

间隔一定时间后各取出0.5ml通过sephadexG-25去游离FITC，由上计算出5mg家兔IgG结合的FITC量。

　　2．Chadwick氏法

（1）材料：

抗原球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、0.01mol/lPh8.0磷酸盐缓冲盐水、1%硫柳汞、离心机及离心管、三角烧瓶（25ml）、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）、透析袋、棉线、玻棒等。

（2）方法及步骤：

　　①抗体准备：

用0～4℃pH8.0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg/ml，置入三角烧瓶内，放于冰槽中。

　　②荧光色素准备：

按每毫克蛋白加入荧光素0.01mg计算，称取所需之荧光素量，用3%重碳酸钠水溶液溶解。

　　③将准备之抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在0～4℃，冰箱中结合18～24h。

　　④透析和柱层析：

方法同Marshall氏法。

　　3．改良法（1963年）　根据Marshall氏法取高价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水（0.15mol/lNaCl）及缓冲液（0.15mol/lNaHCO3–Na2CO3PH9.0）稀释使每毫升内含蛋白10mg,缓冲液为总量的10%，降温至4℃，加入异硫氰酸盐荧光素，（蛋白：

荧光素=50～80mg:

1mg），在0～4℃下电磁搅拌12～14h。

然后用半饱和和硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵（用Nessler氏试剂测验至隔夜透析之盐水无氨离子及荧光色素为止）。

将制备好的荧光抗体加叠氮钠0.01%,分装在1ml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，-20℃保存可达2年以上。

　　【附一】0.01mol/LpH7.2PBS配法：

NaCl18g、Na2HPO41.5g、KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸馏水中，校定pH至7.2。

　　【附二】0.5mol/LpH9.0碳酸盐缓冲液配法：

取0.5mol/lNa2CO3（5.3%）10ml加入0.5mol/lNaHCO3（4.2%）90ml,混合后，校定pH至9.0。

　　【附三】3%重碳酸钠水溶液配法：

称1.5g无水重碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。

　　4．透析标记法　　此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。

（1）用0.025mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0，将欲标记免疫球蛋白稀释成1%浓度，装入透析袋中。

（2）用同一缓冲液将FITC配成0.1mg/ml的溶液，按1%球蛋白液体积的10倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。

容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4℃电磁搅拌下，透析标记24h。

取出透析袋中标记液，即刻用sephadexG-50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装、贮存于4℃中。

（二）四乙基罗达明标记抗体方法

　　取1gRB200及PCL52g放在乳钵中研磨5min（在通风橱中）。

然后加入10ml无水丙酮，放置5min，不断搅拌。

过滤，用滤液进行标记抗体。

剩余部分吸附在滤纸上，4℃干燥保存。

取抗体（20mg/ml）每毫升加入生理盐水和0.5mol/lpH9.0的碳酸盐缓冲液各1ml稀释。

逐滴加入0.1mlRB200溶液，边加入边搅拌，在0～4℃中结合12～18h，再用生理盐水透析5～7h，经葡聚糖凝胶G-50柱层析，除去游离荧光素，分装，贮存于4℃备用。

　　（三）四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法

（1）Igg10ml（6mg/ml）在0.01mol/lpH9.5碳酸盐缓冲液中透析过夜。

（2）将四甲基异硫近氰酸罗达明（每毫克IgG加入5～20μg）溶于二甲亚砜（1mg/ml）,取此溶液300μl，一滴一滴加入蛋白质溶液中，同时电磁搅拌。

　　（3）在室温中搅拌2h，避光。

　　（4）把结合物移入直径3cm,高30cm大小的Bio–GelP-6层析柱（用0.01mol/lpH8.0的PBS平衡过），流速为1.5ml/min。

（5）收集先流出的红色结合物，即为标记抗体，分装，4℃保存备用。

　　（四）藻红蛋白标记抗体的方法

　　1．巯基化藻红蛋白（phycoerthrinPE）的制备，600μl的15.5mg/ml盐酸巯醇亚胺（iminothiolanehydrochloride）加到1.2ml的3.6mg/ml的PE中，和1.2mlPB、pH6.8混合，装入透析袋置入50mmol/lpH6.8PB中透析，4℃过夜，再换用pH7.5PB透析6h。

每个PE分子中可结合8个巯基。

2．PE-IgG制备　　异双功能试剂SPDP[n-Succ-inimdyl3-（2-pyridyldlthio）propinate]30μl（1.1mg/ml）的乙醇溶液，加入700μl的4.2mg/mlIgGPB溶液（50mmol/lpH7.5），在室温中反应2.5h。

再加入巯基化Pe400μl（1.7mg/ml）加到500μl反应混合液中，室温反应12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基，用PB透析过夜，4℃。

加入0.01%Na3N3分装，4℃保存半年。

　　（五）PE-标记蛋白A方法

（1）取4.08mgPE溶于0.1mol/lpH7.4PB（含0.1mol/lNaCl）1ml中，溶解后，取出0.5ml，再加入10μlSPDP无水甲醇液（2.65mg/ml）,SPDP/蛋白摩尔比为10，22℃反应5min，过SephadexG-50（1×17cm）,用100mmol/lpH7.4PBS（含0.1mol/lNaCl）平衡和洗脱。

（2）0.5ml蛋白（2mg/ml）100mmol/lPB（含有100mmol/lNaCl）pH7.4，加入2.6μl上述SPDP甲醇液，SPDP：

蛋白=9.5,22℃,40min,加入25μmol/L二硫苏糖醇（DTT）pH7.4缓冲液，22℃，25min，同上过SephadexG-50，收集蛋白A峰。

　　（3）取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22℃反应6h，混合物4℃保存备用。

以上两种PE标记制品，可最后溶于0.01mol/lpH7.4PB（含有0.1mol/lDETA、1mol/L碘乙酰胺、1%BSA和0.1%NaN3）,0～5℃保存。

　　（六）蓝色荧光素标记抗体方法

　　Kbaffan等（1986）首先创立了蓝色荧光素标记和染色技术，可进行双标记或多标记。

（1）取7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin,AMC）260μg溶于二甲亚砜25μl中。

（2）将上液加入10mlIgG的巴比妥缓冲液（0.5mol/L,pH8.5,内含50～100mgIgG）中，室温反应2h，过SephadexG-50除去游离荧光素。

　　AMC呈黄色结晶固体，最大吸收波长354nm,最大荧光波长430nm。

荧光素标记抗体Protocal回目录

（一）　原理

目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocynate,FITC）或罗达明（LissaminerhodamineB200,RB200）。

在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。

在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。

（二）　操作步骤

　　　　将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，

　　　　透析后抗体液移入小烧杯中

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　称取适量IFTC，加入二甲亚砜（DMSO）（FITC～1mg/1mlDMSO）

　　　　使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO

　　　　FITC／IgG比例:

如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFITC／mgIgG；

　　　　如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／mlIgG

　　　　在10ml小烧杯中先放入抗体

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中

　　　　　　　　　　　↓

　　　　将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h

　　　　　　　　　　　↓

　　　　用PD10柱（SephadexG25柱）除去游离荧光素，先用25mlPBS淋洗G25柱

　　　　　　　　　　　↓

　　　　收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P

　　　　比值。

第二个荧光素峰为游离荧光素

　　　　计算:

　　　　　　　　　2.87×A495

　　　　F／P＝────────

　　　　　　　　A280-0.35×A495

　　　　合适的F／P值为2～4。

（三）　试剂器材

　　1.纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。

　　2.FITC（Fluorescein-5-Lsothiocyanalte）或其它荧光色素。

　　3.PBS、DMSO

　　4.PH9～9.5碳酸盐缓冲液:

Na2CO34.3g，NaHCO38.6g加蒸馏水至500ml。

5.PD10柱（SephadexG25柱）

6.拌器，紫外分光光度计等

（四）　注意事项

　　1.　FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。

　　2.　FITC-DMSO液要临用时配制。

　　3.　碳酸盐缓冲液要新鲜配制。

荧光抗体的制备回目录

（一）免疫球蛋白的提取

（二）荧光素

1．荧光色素的基本条件

（1） 具有化学活性基团，如异硫氰基（-NCS）等，易与免疫球蛋白结合形成共价键。

（2）对免疫球蛋白无毒性，不影响抗体活性。

（3）荧光效应高，与蛋白结合需要量少。

（4）荧光素性能稳定，结合物性能稳定，容易贮藏。

（5）结合物的颜色必须与背景组织有良好的反衬作用，易于观察判定。

   到目前为止，基本符合上述要求的荧光素只有异硫氰酸荧光素（FITC），丽丝胺罗丹明B200（RB200）。

2．常用的荧光色素

（1）异硫氰酸荧光素：

又称异硫氰酸荧光黄，纯品为橙黄色粉末。

分有结晶型与粉末型两种,结晶型荧光强度大、稳定、优于粉末型。

分子式C21H11O2N5、分子量389，溶于水，易溶于pH8-9.5碳酸盐缓冲液中。

最大吸收波长为495nm。

最大发射波长520nm。

异硫氰酸荧光黄性质稳定，于低温下可保存二年以上，但久置标记抗体能力弱，荧光亮度差，故应采用新产品。

异硫氰酸荧光素借助异硫氰基与蛋白中氨基酸（主要是赖氨酸）的氨基结合。

一个IgG分子有86个氨基酸残基，一般最多能标记16～20个荧光素分子。

（2）丽丝胺罗丹明：

为褐色粉末，不溶于水、易溶于酒精和丙酮。

荧光为桔红色。

性质稳定，可长期保存。

分子式C23H29O7NaS2，分子量为580，最大吸收波长570nm，最大发射波长为600nm。

由于丽丝胺罗丹明荧光效能较低，一般不单独使用，多用于与FITC标记抗体的反衬染色或双标记配合使用。

此染料不能直接与蛋白质结合，必须先用五氯化磷（PCl5）处理，使染料的-SO3Na基变为-SO3Cl基后，才能在碱性条件下与赖氨酸的氨基结合，形成稳定的硫氨键。

（三）标记方法

异硫氰酸荧光素常用的标记法有以下两种：

1．搅拌法

（1）取一定量的纯IgG液，用0.5Mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液稀释至20mg/ml。

（2）按荧光素与蛋白质比1︰20～1︰100（一般用1︰100）称取异硫氰酸荧光素，用pH9.5碳酸盐缓冲液溶解。

（3）将球蛋白液置于电磁搅拌器上，启动开关，轻轻搅拌，以不起沫为准。

逐滴加入荧光素液（约10min～15min加完）。

加完后，随时用试纸测定搅拌液的pH值，若低于9.0，则应以碳酸钠溶液调整。

置4℃搅拌6h～12h即可。

2．透析法

（1）将IgG液以0.5Mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液稀释成1%浓度，装入透析袋中。

（2）将荧光素配成0.1mg/ml，其量为1%蛋白液的10倍，装入烧杯中。

（3）将透析袋置于烧杯中，放电磁搅拌器上4℃搅拌24即可。

透析法的优点是标记均匀，非特异性荧光少，但所标记的时间长，荧光素的用量多，约比搅拌法多10倍。

3．影响标记的因素

（1）荧光素与蛋白质的比值：

这也取决于荧光素的质量与保存期。

一般而言，粉末状荧光素以0.025mg/mg～0.05mg/mg蛋白质为宜，而结晶型则只需0.006mg/mg～0.008mg/mg蛋白质即可。

蛋白含量以20mg～25mg/ml为宜，浓度过低标记过慢。

浓度过高，标记效果不好。

不过在实践中，以稍高一些蛋白浓度为好。

（2）pH值：

以pH9.0～9.5为最好。

过低标记速度慢，过高蛋白质容易变性。

（3）温度和时间：

温度4℃～25℃均可。

温度与时间是成正比的，温度低，反应慢，温度高，反应快。

4℃需要6h～12h，7℃～9℃需要3h～4h，20℃～25℃只需要1h～2h。

实践中可自选。

透析法还是以4℃较长时间反应为好。

（4）荧光素的质量及有效期。

（四）标记抗体的纯化

标记后溶液是一个混合体，它包括蛋白质与荧光素的结合体，还有游离的荧光素、游离的蛋白质以及结合过多的蛋白质。

对于某些细菌性的诊断荧光抗体，则只要去除游离的荧光素即可。

对于一般组织染色荧光抗体，则要去除过度标记的抗体即可。

只是对某些特殊要求的组织染色试剂，则必须经过仔细的处理，包括具有特异性交叉反应或非特异性反应性的除去。

1．去除游离的荧光素

（1）透析法：

将标记好的抗体放入透析袋中于0.01Mol/LpH7.6PBS中或生理盐水中4℃透析数天，每天换液数次，直至透析液中无游离色素为止。

通常约需5～7天才能透析完毕。

（2）凝胶过滤：

以G25或G50葡聚糖凝胶装柱进行过滤。

次法速度快，一般1h～2h即可完成。

也可以先透析4h～5h，让大部分游离荧光素除去，再过G25或G50柱。

2．去除过度标记的蛋白质分子 可采用DEAE—纤维素过柱法。

利用阶梯洗脱法进行，具体方法如下：

（1）以0.01Mol/LpH7.6PB液洗脱。

（2）以0.01Mol/LpH7.6PBS液（0.05Mol/LNaCl）洗脱。

（3）以0.01Mol/LpH7.6PBS（0.1Mol/LNaCl）洗脱。

（4）以0.01Mol/LPH7.6PBS（0.2Mol/LNaCl）洗脱。

收集每部分有荧光抗体的洗脱液管，于495nm测荧光素的OD值，再于280nm测蛋白的OD值，查标准曲线，算出各管荧光素和蛋白质的浓度，并计算出F/P比值（见后介绍），将合格者合并，浓缩后分装小瓶备用。

 层析柱上滞留的过度标记的蛋白质，可用1Mol/L的NaCl洗脱。

3．去除交叉反应等非特异性染色因素 非特异性染色的干扰因素，包括免疫血清的不纯、类属抗原以及荧光色素的质量不高、标本处理不当等。

可以以脏粉进行吸收。

具体做法如下：

于每ml标记抗体中加入脏器干粉（脏粉制法见附录）100mg，充分混合，于室温中振荡约1h，然后以10000r/min离心30min，吸取标记抗体。

必要时可减半脏粉用量再处理一次。

经过脏粉吸收后的荧光抗体必须加0.1%叠氮钠防腐（注意不能加硫柳汞，因为重金属对荧光素有影响）。

分装小瓶冷冻保存。

（五）标记抗体的鉴定

1．F/P比值鉴定 荧光色素与球蛋白的结合率即为F/P比值。

分别制备荧光色素与蛋白质的标准曲线。

异硫氰酸荧光素的标准曲线是以0.5Mol/LpH9.5的碳酸盐缓冲液分别配成0.25μg/ml、0.5μg/ml.、0.75μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml……10.0μg/ml的浓度，在495nm波长测其OD值，按重量与OD值在坐标上制成标准曲线。

蛋白的标准曲线是将牛血清蛋白分别配成0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml…1.6mg/ml，在280nm测其OD值，并绘制成曲线。

按以下公式计算F/P比值：

             1．6×104         FITCμg/ml             FITCμg/ml

F/P（克分子比值）=          ×              =0.41×

               390        抗体mg/ml            抗体mg/ml           

式中1•6×104为抗体蛋白质的分子量，390为异硫氰酸荧光素分子量。

F/P克分子比值以1～2为合适，1～3.5为合格。

比值过低敏感性差，比值过高，易出现非特异性反应。

用于检查组织细胞抗原成分，F/P以1～2为好；用于检查细菌涂片时，F/P以2