破伤风梭菌.docx

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破伤风梭菌

实验四厌氧菌

一、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌

（一）目的要求

1.掌握破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌的形态特点、培养特性和鉴别要点。

2.熟悉破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌的分离培养过程、鉴别的一般原则和常用方法。

3.解破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌的外毒素毒性动物实验。

（二）器材和试剂

1．菌种　破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌菌种及其形态示教片。

2．培养基　疱肉培养基、血琼脂培养基、牛乳培养基、五糖（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）发酵管、牛心脑浸液肉汤与琼脂、脂酶培养基。

卵黄琼脂、溴甲酚紫牛乳培养基。

3.试剂　革兰染色液（一套）、芽胞染色液（石炭酸复红、95％酒精、碱性美蓝）、焦性没食子酸、100g/L氢氧化钾、溴甲酚紫；产气荚膜梭菌抗血清、肉毒梭菌多价抗血清、索氏梭菌抗血清；2０g／L尿素L-色氨酸、硝酸盐还原试剂、欧氏试剂、美蓝指示剂。

4.其他小白鼠、家兔、无菌注射器、无菌吸管、滴管、中、小试管、消毒纱布块；固体石蜡或凡士林、酒精灯、三角架、碘酒、酒精、生理盐水、蒸馏水；剪刀、镊子、玻片、药勺、钯粒；厌氧袋、厌氧罐、离心机、水浴锅等。

（三）步骤和方法

1．破伤风棱菌

（1）形态观察　观察破伤风梭菌示教片，其繁殖体型为革兰阳性细长杆菌，散在排列，芽胞型的芽胞呈正圆形，位于菌体顶端，直径大于菌体，使芽胞和菌体呈鼓槌状；该菌鞭毛为周身鞭毛。

（2）培养物观察　破伤风梭菌在疱肉培养基中生长缓慢，厌氧培养2～7天后其生长现象为培养液变混浊，产酸，肉渣部分消化微变黑，有少量气体。

生成的甲基硫醇、H２S等使培养物变臭。

破伤风梭菌在血琼脂平板上形成圆形、扁平的菌落。

菌落中心结实，周边疏松似“羽毛状”。

菌落周围有α溶血环，培养时间延长可变为β溶血环。

（3）生化反应将五糖发酵管与牛乳培养基置水浴锅中加热。

热煮沸10min，迅速冷却。

以无菌吸管吸取破伤风梭菌纯培养物，分别滴加。

于牛乳培养基与五糖发酵管中，接种毕，在液面上加一薄层熔化的石蜡。

经37℃孵育24～48h，观察结果。

结果破伤风梭菌五糖（葡乳麦甘蔗）均不分解，牛乳培养基无变化。

”

（4）破伤风梭菌芽胞染色法

①原理芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上后又难以脱色的特点设计的。

所以芽胞染色法都基于同一个原则，采用

着色力强的染料，并加热以促进标本着色，然后使菌体脱色，而芽胞上的染料仍保留，经复染后，菌体和芽胞呈现不同的颜色。

②方法：

a.用破伤风梭菌培养物涂片，干燥，火焰固定；b.滴加石炭酸复红液于涂片上，用微火加热至染料冒蒸汽（切勿煮沸）维持3～5min，加热过程要随时添加染液，勿让标本干涸，待玻片冷却后，水洗；c.用95％酒精脱色30s～1min，水洗：

④滴加碱性美蓝液复染30s～lmin，水洗。

⑤干燥后，镜检。

③结果：

芽胞染呈红色，菌体染呈蓝色。

2.产气荚膜梭菌

（1）形态观察产气荚膜梭菌镜下检查为革兰染色阳性粗大杆菌，两端钝圆，散在或短链状排列；荚膜染色法可见肥厚荚膜；芽胞卵圆形，与菌体等宽，位于菌体中央或次未端。

（2）培养物观察　产气荚膜梭菌在疱肉培养基中呈现混浊生长，肉渣呈粉红色，不被消化，产气甚多；在血琼脂平板上多数株有双层溶血环；高层葡萄糖琼脂培养管中，可见气体产生，使琼脂有断裂分层现象。

（3）生化反应

①五糖发酵试验：

将五糖发酵管置水浴中加热煮沸10rnin，迅速冷却。

以无菌吸管吸取产气荚膜梭菌纯培养物，分别滴加于五糖发酵管中，接种后，在液面上加一薄层熔化的石蜡。

经35℃孵育24～48h，观察结果。

结果葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖均分解，产酸产气。

1汹涌发酵现象

a.原理：

产气荚膜梭菌能迅速分解乳糖产酸，使酪蛋白凝固，并产生大量气体，将凝固的酪蛋白冲散形成分散的海绵状碎块，并将培养基表面的石蜡冲至试管塞处。

此为汹涌发酵现象。

b.方法：

甩无菌吸管（或接种环）取产气荚膜梭菌疱肉培养物接种于溴甲酚紫牛乳培养基，置35℃孵育18～24h，观察结果。

c.结果和意义：

一般于孵育6h后即可发生，产气荚膜梭菌迅速分解乳糖，产酸产气，酪蛋白被酸凝固，形成凝块与乳清，凝块被产生的大量气体冲击，形成分散的海绵状碎块，将部分培养基冲至试管口塞处。

这种气势凶猛现象，为本菌的重要特征之一。

③卵磷脂酶试验和奈格尔试验

a.原理：

产气荚膜梭菌能产生卵磷脂酶，在卵黄琼脂平板上，能将培养基中可溶性的磷脂酞胆碱分解生成磷酸胆碱和不溶性的二脂酞甘油酯，后者在菌落周围形成不透明区（有乳白色环），此为卵磷脂酶试验阳性。

奈格尔（Naglar）试验是抗原抗体中和试验用产气荚膜梭菌抗血清，实际是卵磷脂酶抗血清（抗体）涂在琼脂上，由于抗原（卵磷脂酶）抗体中和反应，使菌落周围不形成不透明区，即无乳白色环，则为奈格尔（Nag1ar）试验阳性。

这样可确证该菌能产生卵磷脂酶。

b.方法：

将卵黄琼脂平板底部划分两个区，琼脂的一半均匀涂上产气荚膜梭菌抗血清，置37℃待干后，将待检细菌先在未涂抗血清区划线接种，然后在有血清区划线接种，置37℃厌氧孵育24～48h、观察结果。

c.结果：

未涂抗血清的一半平板，菌落周围形成较大的混浊不透明区，表示卵磷脂酶试验阳性；涂抗血清的一侧，菌落周围无不透明区（无乳白色环），表示卵磷脂酶活性已被抗毒素所中和，为奈格尔试验阳性；如两侧菌落周围均无不透明区，表示该菌不产生卵磷

脂酶。

产气荚膜梭菌卵磷脂酶试验为阳性，破伤风梭菌、肉毒梭菌为阴性。

（4）动物实验

①原理：

产气荚膜梭菌接种小白鼠腹腔后，可使小白鼠各脏器肿胀、并有许多气泡，

尤以肝脏为甚，故又称为海绵肝或泡沫肝。

②方法：

将产气荚膜梭菌培养液0．2～1．0ml注射小白鼠腹腔，5min后断髓处死，置37℃孵育5～8h，观察小白鼠腹腔是否膨胀有气肿现象，然后解剖小白鼠，观察各脏器，尤其是肝脏的变化。

③结果：

剖检可见各脏器肿胀，并有许多气泡，尤以肝脏为甚，称海绵肝或泡沫肝。

如果取内脏组织涂片，革兰染色、镜检，可见具有荚膜的革兰阳性梭菌。

3.肉毒梭菌

（1）形态观察肉毒梭菌为革兰染色阳性、两端钝圆的粗大杆菌，单独或成双排列；菌

体的芽胞为卵圆形，宽于菌体，位于菌体次未端，使细菌呈“网球拍”状；鞭毛染色可见周鞭。

（2）培养物观察肉毒梭菌在扈肉培养基中生长旺盛，呈均匀混浊，产生少量气体，肉渣被消化变黑色，看腐败性恶臭；在血琼脂平板上呈现半透明、有光泽、边缘薄、弥散而不规则的菌落，有β溶血环。

（3）生化反应

①五糖发酵试验：

将五种糖发酵管与牛乳培养基置水浴中加热煮沸10rnin，迅速冷却。

以无菌吸管吸取肉毒梭菌培养液，分别滴加于五糖发酵管与牛乳培养基中，接种后在液面上加一薄层熔化的石蜡。

经35C孵育24～48h，观察结果。

结果：

肉毒梭菌能分解葡萄糖，麦芽糖与蔗糖，不分解乳糖与甘露醇，牛乳培养基一般无变化。

②脂酶试验

a.原理：

肉毒梭菌能产生脂酶，它作用于卵黄中游离脂肪，产生甘油和不溶性游高脂肪酸，在菌落的周围形成局限的不透明区，并于菌落表面产生一层珠光层。

为一薄层脂肪酸，可与卵磷脂的分解产物（二脂酰甘油酯）区别。

b.方法：

将肉毒梭菌接种于卵黄平板，置35℃厌氧孵育48～72h，观察结果。

c.结果：

菌落表面有珠光层，菌落的周围有不透明区者为脂酶阳性，各型肉毒梭菌（G型除外）脂酶试验阳性，破伤风与产气荚膜梭菌该试验为阴性。

（4）动物试验

①原理：

肉毒梭菌培养液注入小白鼠腹腔后其毒素作用于颅脑神经核、外周神经肌接头以及植物神经末梢，使小白鼠出现四肢麻痹、呼吸困难，眼睑下垂，瞳孔散大、流涎，最后因心力衰竭或呼吸困难而死亡。

②方法

a.准备滤液：

取培养5天的肉毒梭菌液体培养物，离心3000r／min，30min，取上清经滤菌器除菌，取滤液作试验。

b.将动物分为三组：

1组：

取上述滤液0.5m1，注入小白鼠腹腔。

2组：

同法注入加热100℃30mm的滤液于第二只小白鼠，3组：

第三只小白鼠在注射肉毒梭菌多价抗毒素的同时再。

注射不加热的滤液。

c.结果：

注射后1小时（也有延至3～7天），第1组小白鼠出现四肢麻痹、呼吸困难、眼睑下垂、瞳孔散大、流涎等中毒症状，最后因心衰或呼吸困难而死亡。

剖检，内脏可见明显充血，大量出血与血栓形成等，第2乃组动物不发病，存活。

4.临床意义：

破伤风芽胞梭菌又称破伤风杆菌，广泛存在于自然界，在土壤和人与动物的肠道中都有存在。

当机体受创伤时或新生儿接生时使用不洁用具断脐带，破伤风梭菌可侵入伤口生长繁殖，分泌外毒素，引起机体痉挛性抽搐，称为破伤风，新生儿破伤风又称为脐带风。

产气荚膜梭菌是气性坏疽的主要病原菌。

本菌可产生外毒素及多种侵袭性酶类。

此菌的致病条件与破伤风梭菌相同，主要是大面积创伤、局部供血不足，组织缺氧坏死，氧化还原电势下降）菌体产生芽胞，产生毒素和侵袭性酶，引起感染致病。

所致疾病主要是气性坏疽，某些型别也可引起食物中毒和坏死性肠炎，也常与兼性厌氧菌混合感染，引起深部脓肿，腹腔、盆腔、胸腔感染、败血症、心内膜炎以及胆道、泌尿道、女性生殖道感染等。

肉毒梭菌广泛存在于自然界，土壤中常可检出，偶尔存在于动物粪便中。

在厌氧环境中，此菌分泌极强烈的肉毒毒素，引起特殊的神经中毒症状，病死率极高。

本毒素尚可使婴幼儿感染与中毒。

本病与典型的食人肉毒毒素引起的食物中毒不同，属于感染性中毒。

5.注意事项

（1）对预采集标本部位应首先清除污物、再用2％～2．5％碘酒75％酒精消毒，防止皮肤表面污染菌（需氧菌）混入标本而影响检测结果；所盛容器必须在用前进行灭菌。

（2）对不同部位的标本采集，应分别采取，如系瘘管应取部分坏死碎片，对闭锁性脓肿应以无菌注射器穿刺抽取脓汁和分泌物，取材后尽量排出注射器内空气，并将针头插入无菌橡皮塞内，避免空气进入。

（3）对厌氧菌的分离培养、鉴定的全过程中均应防止氧气进入。

二、艰难梭菌

（一）目的要求

1.掌握艰难梭菌的形态特点及培养特性。

2.熟悉鉴别艰难梭菌的一般原则和常用方法。

3.了解艰难梭菌毒素对动物的毒性试验。

（二）器材和试剂

1.菌种艰雅梭菌。

2.培养基疱肉培养基、CCFA（环丝氨酸、头孢甲氧噻吩、果糖、琼脂）平板培养基、卵黄琼脂培养基、五糖发酵管、七叶灵柠檬酸铁琼脂、20％胆汁心脑浸液、明胶培养基。

3.试剂芽胞染色液、焦性没食子酸、100g／L氢氧化钾、索氏梭菌抗血清、20g／L尿素、L一色氨酸、硝酸盐还原试剂、欧氏试剂、美蓝指示剂。

4.其他家兔、无菌注射器及针头、无菌吸管、滴管、中小试管、消毒纱布块；固体石蜡、酒精灯、三角架、消毒用碘酒、酒精、生理盐水、蒸馏水、剪刀、镊子、钯粒、产气袋、厌氧罐、水浴锅等。

（三）步骤和方法

1.形态观察艰难梭菌为革兰阳性粗长杆菌；芽胞为卵圆形或长方形，位于次极端或极端、运动性菌株为周鞭毛。

2.培养物观察在CCFA平板上，经48h厌氧培养后，产生特征性马厩（horsestable）气味，菌落直径3～5rnm，圆形、略凸起、白色或淡黄、不透明、边缘不整齐、表面粗糙或毛玻璃样菌落。

在紫外线照射下，可见黄绿色荧光；在血琼脂平板上不溶血；在卵黄琼脂平板上不形成乳浊环或珠光层。

3.生化反应将五糖发酵管与牛乳培养基置水浴中加热煮沸10rnin，迅速冷却。

以

无菌吸管吸取艰难梭菌培养液，分别滴加于五糖发酵管与牛乳培养基牛，接种后，在液面上加一薄层熔化的石蜡。

经37℃厌氧孵育24～48h后，观察结果。

结果艰难梭菌能分解葡萄糖和甘露醇产酸；不分解乳糖、麦芽糖和蔗糖；在牛乳培养基上，不凝固和不消化牛乳。

4.动物试验（家兔肠拌试验）

（1）原理：

艰难梭菌的毒素注人家兔小肠后可使肠腔积有大量暗红色棍浊液甚至坏死。

（2）方法：

①准备滤液：

用于毒性检测的腹泻粪便标本，先经1000r／min，10min离心沉淀后，取上清液过滤除菌；疱肉培养基经37℃四天的培养液，离心沉淀，取上清液过滤除菌。

②家兔肠拌试验：

取断食两天的家兔，剖腹后取出小肠扎成四段，分别注入a待测标本滤液；b经56℃30min加热灭活的滤液；c索氏梭菌抗毒素和标本滤液；d生理盐水。

24h后再行剖腹、观察各肠段内的液体贮积量。

若只有注入未经任何处理的待测标本滤液的肠段内积有大量暗红色的混浊液；而其它肠段先变化者，判为阳性皮应.

表3-1-1厌氧芽胞梭菌生化反应

葡萄乳麦芽甘露蔗牛吲硫化七叶明硝酸盐卵磷脂

糖糖糖醇糖乳哚氢灵胶还原脂酶酶

破伤风梭菌一一一一一d十一十一一十一一一

产气荚膜梭菌十十十一十cd一十d十＋一十一

肉毒梭菌十一十一一d一十一十一一十

艰难梭菌十一一十一一一一十十一一一

注：

＋：

阳性；一：

阴性；＋一：

多数阳性；

牛乳：

d消化；c：

凝固；cd：

既消化又凝固；一：

不消化，不凝固

5.临床意义

艰难棱菌是人和动物肠道寄生菌。

本菌与假膜性结肠炎有关。

近年来，该菌已成为医院内感染的病原菌之一。

除假膜性结肠炎外，艰难梭菌可引起肾盂肾炎、脑膜炎、腹腔及肠道感染，菌血症和气性坏疽等。

6.注意事项

（1）艰难梭菌需要严格的厌氧条件，因此，从标本采集到培养鉴定全在无氧环境下进行。

（2）艰难梭菌培养需特殊培养基（CCFA），不能用一般培养条件进行培养。

（3）CCFA培养基按要求制成平板后装人塑料袋内2～8℃保存，最长不要超过8周。

三、弱类杆菌和产黑色素类杆菌

（一）目的要求

1.掌握脆弱类杆菌和产黑色素类杆菌的形态特点及培养特性。

2.熟悉鉴别脆溺类杆菌和产黑色素类杆菌的一般原则和常用方法。

（二）器材和试剂

1.菌种脆弱类杆菌、产黑色素类杆菌。

2.培养基血琼脂平板培养基、七叶灵柠檬觎琼脂、z0％LHfr心脑浸液、明胶培养

基、五糖发酵管、醋酸铅琼脂。

3.试剂革兰染色液、100g／L氢氧化钾、20g／L尿素、澳甲酚紫、L色氨酸、硝酸盐还原试剂、欧氏试剂、美蓝指示剂。

、

4.其他无菌吸管、蒸馏水、剪刀、镊子、药勺、把粒、厌氧袋、厌氧袋、水浴锅、真空泵等。

（三）步骤和方法

1.形态观察脆弱类杆菌为革兰阴性短杆菌、两端圆而浓染、常并排存在或3～4个菌体排成短链。

菌体有时细长，弯曲，含一个以上淡染区，易误为芽胞；多数株有荚膜。

产黑色素类杆菌为革兰阴性短杆菌，呈球形，以球杆状多见，菌体笔直或略弯曲，有时呈多形性，菌体较长，两端浓染，着色不均匀，可见短丝状。

2.培养物观察脆弱类杆菌在血平板上生长良好，菌落圆形，直径1～3mm，中心略。

凸起，半透明，灰白色，表面光滑，边缘整齐，多数菌株不溶血。

产黑色素类杆菌在血平板上生长良好，缓慢生长，经2～3天孵育后菌落直径0.5～3mm，圆形凸起，灰色或棕黑色，进而呈黑色，不透明）呈β溶血。

3.生化反应

（1）七叶灵水解试验：

七叶灵（eseulin）的分子式为C15H16O9，化学名称为6β葡萄糖甙–7-二羟基香豆素，是一种葡萄糖甙。

①原理：

细菌产生七叶灵水解酶，能水解七叶灵（苷），产生七叶亭和葡萄糖，加入5g／L柠檬酸铁后，使铁结合在七叶亭的酚羟基上，生成棕黑色化合物。

②方法：

a斜面法：

将脆弱类杆菌和产黑色素类杆菌分别接种在含七叶灵柠檬酸铁的琼脂斜面上，经24～48h厌氧培养，培养基变黑表示七叶灵已经水解，为阳性。

b微量斑点法：

将七叶灵0．2g／L（W／V）水溶液（淡蓝色）滴加于微孔板中（透明板）三孔，分别加脆弱类杆菌和产黑色素类杆菌的菌液与蒸馏水（对照）37℃30～60min后，置360nm紫外灯下照射，进行观察。

对照孔呈淡蓝色荧光。

试验孔，无荧光者为阳性、说明被水解后荧光消失。

与对照相同者则为阴性。

c.结果：

脆弱类杆菌能水解七叶灵为阳性反应；产黑色素类杆菌一般不水解七叶灵为阴性反应。

（2）20％胆汁（2％胆盐）刺激生长试验

①原理：

胆汁能抑制许多厌氧菌的生长，眉为胆盐可降低细胞膜表面张力，损伤细胞膜。

但脆弱类杆菌群和少数其它厌氧菌，却能利用胆汁作为其营养物质，放生长旺盛

②方法（试管法）：

将脆弱类杆菌和产黑色素类杆菌分别以相同菌量接种至胆汁的心脑浸液（BHI）培养基中和不含胆汁的BHI对照管。

也可用2％胆盐BHI试验。

③结果：

含胆汁的BHi管中，生长旺盛者，为阳性：

抑制生长者为阴性。

不含胆汁管对照，多为一般生长，为十。

脆弱类杆菌胆汁试验阳性，产黑色索类杆菌胆汁试验为阴性。

（4）明胶液化试验

①原理：

明胶是一种动物蛋白，能在20℃凝固，高于20℃时液化；某些细菌有明胭能使明胶分解为多肽和氨基酸，即不再凝固。

②方法：

将脆弱类杆菌和产黑色素类杆菌分别接种于明胶管中，另外放一未接种的明胶管对照，缉37℃2～5天孵育，取出置冰箱（4℃）中30ini山仍不凝固者为阳性，凝固者为阴性；而对照管37℃时呈液化状态，4℃冰箱中应凝固。

③结果：

脆弱类杆菌明胶液化试验为阴性，产黑色素类杆菌明胶液化试验为阳性。

4.临床意义

脆弱类杆菌群存在于人及动物的大肠中，是健康人粪便中的正常菌群，每克粪便中约有1010~12个，为大肠埃希菌的100～1000倍。

是厌氧菌感染中最常见的菌之一。

主要为内源性感染。

也可见于女性生殖系统、脓胸、颅内感染及菌血症等。

产黑色素类杆菌群可单独引起感染，但更常见与其它厌氧菌、需氧菌或兼性厌氧菌引起的混合感染。

在正常情况下，本群细菌存在于人体口腔、大肠和阴道，组成这些部位的正常菌群。

女性生殖道及口腔感染较为多见。

是仅次干脆弱类杆菌群的常见菌。

5.注意事项

（1）在采集标本时应注意标本的特征，如恶臭；这是厌氧菌终末代谢产物所产生的，尤其是梭杆菌和产黑色素类杆菌；砖红色荧光，这是产黑色素类杆菌产生的原叶琳所致；黑色坏死组织或黑色分泌物，一般是由产黑色素类杆菌所造成的。

（2）BBE琼脂平板有利于快速分离和初步鉴定脆弱类杆菌群，KVLB可用以选择带色素的或其他类杆菌。

（3）胞外酶快速生化试验，由于细菌不需要再繁殖，故亦不需厌氧培养，只需在有氧条件下置35℃孵育4h，即可观察结果

附录

常用培养基

1．疱肉培养基

牛肉渣0．5g牛肉汤7m1

取制备牛肉浸液剩下的并经过处理的肉渣，装于15mm×150mm试管，每管0．5g，并加入pH7．6的肉汤培养基7m1，上盖3～4mm厚的融化凡士林，经103．43kPa高压灭菌15min后备用。

2．卵黄琼脂

胰酪胨40g葡萄糖2g

磷酸氢二钠59琼脂20g

氯化钠2g500g/L硫酸镁0．2m1

蒸馏水1000ml

将以上成分加热溶解，调pH7．3至7．4，103．43kPa高压灭菌15min，冷至60℃加入500g/L蛋黄盐水100m1，混匀倾注平板。

4℃保存备用。

3．溴甲酚紫牛乳培养基

新鲜牛奶（脱脂）100m116g/L溴甲酚紫溶液0．1ml

将澳甲酚紫指示剂加入牛奶中，分装试管，每管约5m1，于表面加已融化的凡士林，厚约5mm。

55.16kPa高压灭菌20min后经37℃24～48h，若无细菌成长即可使用。

4．糖发酵培养基

胰蛋白胨15g维生素C0．1g

酵母浸出粉7g硫乙醇酸钠0.5g

L一半胱氨酸0．5g溴甲酚紫0．01g

氯化钠2．5g蒸馏水1000nll

上述基础培养液按10g／L加入所需的糖，即成各种糖发酵管。

分装后，经68．95kPa高压灭菌20min后备用。

5．心脑浸液（BHI）及心脑浸液血琼脂

牛脑浸出液200ml磷酸氢二钠2．5g

牛心浸出液250ml半胱氨酸0．5g

琼脂10g氯化血红素（5g／L）1ml

酵母浸出物（粉）5g维生素K10g／L溶液0．1ml

葡萄糖2g氯化钠5g

蒸馏水1000m1

牛心脑浸出液的制备：

将去筋膜并绞碎的牛脑和牛心各500g分别置于两只2000ml的三角烧瓶中，各加1000ml蒸馏水。

4℃置冰箱过夜。

次日撇去浮油，分别置45℃水浴中加温1h，再煮沸30min，用纱布过滤。

不易滤清时，再置冰箱待杂质沉降，吸取上清液。

各补足水分至1000m1，103．43kPa高压灭菌15min，后备用。

将已制备的牛心脑浸液和上述成分加入容器内，加蒸馏水至1000ml加热溶解，冷却后调pH至7．6～7.8。

分装后103．43kPa高压灭菌15min。

牛心脑浸液琼脂与血琼脂：

上述牛脑浸液基础培养基加入2％琼脂，即为心脑琼脂。

在心脑琼脂中加入5％～10％脱纤维羊血，即成心脑血琼脂。

6．七叶灵琼脂培养基

糖发酵基础液（无指示剂）1000m1柠檬酸铁0.5g

七叶灵1g琼脂15g

7．20％胆汁培养基及其对照管

胆汁管：

蛋白胨酵母葡萄糖（PYG）或硫乙醇酸盐基础液100m1

牛胆粉（或胆汁）2g

去氧胆酸钠0．1g

对照管：

PYG或硫乙醇酸盐基础液100mI

胆汁管的各成分混合，加热溶解，调整pH至7．5分装小试管，每管2m1。

对照管中培养基也调整pH至7．5。

68．95kPa高压灭菌15min后备用。

8．硫乙醇酸盐（TH10）培养基

胰酶解酪蛋白17g半肮氨酸0.25g

植物胨或大豆胨3g亚硫酸钠0.1g

葡萄糖6g0.5％氯化血红素溶液1m1

氯化钠2.5g10g／L维生素K1溶液0.1m1

硫乙醇酸钠0.5g琼脂0.7g

蒸馏水1000ml

混合上述各成分加热至完全溶解，煮沸1～2min，冷却后调整pH至7．2～7．4。

分装后置103.43kPa高压灭菌15min，4℃保存备用。

9.CDC厌氧血琼脂

胰酶解酪蛋白1510g／L氯化血红素0．5m1

植物胨或木瓜酶消化豆粉5g10g／L维生素K1m1

氯化钠5g半腕氨酸400mg

琼脂20g脱纤维羊血或兔血50m1

酵母浸出粉5g蒸馏水1000ml

①将上述成分（除血液外）混合，加热溶解，冷却后调整pH至7．4。

②103．43kPa高压灭菌15min，冷却至50℃，加入无菌脱纤维羊血或兔血50m1，混匀后倾注平板。

10．明胶培养基硫乙醇酸盐及其他基础培养基加50g/L明胶即成。

11.L-色氨酸基质10g／L色氨酸加5ml0.025mol／LpH7.4的磷酸盐缓冲液100ml,过滤除菌，分装每管0．5m1，4℃保存。

12．糖发酵缓冲液

磷酸氢二钾0.04g磷酸二氢钾0．01g

氯化钾0．8g10g/L酚红水溶液0.2m1

将上述成分加蒸馏水至100m1，过滤除菌，4℃保存备用。

13．0.025mol／L磷酸盐缓冲液

（1）原液：

A液：

Na2HPO4·2H2035．6g加蒸馏水至1000ml；B液：

NaH2P04·H2O27.6g加蒸馏水至1000m1.

（2）应用液：

①0．025molpH6．0酚红磷酸盐缓冲液A液6.15ml＋B液43.85m1十蒸馏水350ml＋1g／L酚红0.8m1，混匀，过滤除菌，4℃保存。

②0.025mol／LpH6.8磷酸盐缓冲液：

A液24．5ml＋B液25．5ml＋蒸馏水350m1，混匀，过滤除菌,4℃保存。

③0．025mol／LpH7．4磷酸盐缓冲液:

A液40．5ml＋B液9.5ml＋蒸馏水350ml，混匀，过滤除菌，4℃保存。

14．CCFA培养基（环丝氨酸-头孢甲氧噻吩-