猪蓝耳病活疫苗免疫效果实验观察.docx
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猪蓝耳病活疫苗免疫效果实验观察
猪蓝耳病活疫苗免疫效果试验观察
周志平1，2，陈火光2，田同军2，孙仁华2，徐学平2，郑立栋2，金晓林2，周继勇1
（1．浙江大学农业部疫病病原学与免疫控制重点开放实验室；2．杭州灯塔养殖总场）
摘要：
共选择杜大长仔猪约3452头分成4组，分别在19日龄免疫蓝耳病活疫苗（R98株）2批，9日龄免疫一批、7日龄或15日龄分别免疫一批，其中免疫仔猪共1188头，非免疫对照2264头。
选61头大长母猪在怀孕80～90d免疫蓝耳病活疫苗，48头不免疫对照，观察产仔及哺乳期健康状况。
并抽取部分试验猪血样检测PRRS血清ELISA抗体。
结果显示，19日龄1组、19日龄2组、9日龄1组保育猪僵病仔率分别是1.38%、1.08%、1.66%，对照组分别是30.7%、14.5%、15.82%；出栏健仔率试验组分别是91.72%、96.77%、97.35%，对照组分别是67.54%、84.72%、82.64%；日增重试验组分别是293.4g、274.6g、304.7g，对照组分别是241.9g、236.9g、256.9g；差异很明显。
对1-2胎母猪比率达46.8%～71.1%的产后哺乳仔猪分别在7日龄、15日龄免疫对比试验表明，2组仔猪窝发病率分别为23.4%、50.0%，出栏健仔率分别为97.19%、76.14%，说明对1-2胎母猪产后仔猪7日龄免疫比15日龄免疫更好。
母猪免疫组胎产活仔、死胎、初生仔猪头均重分别为10.11头、0.98头、1.482kg，对照组分别为10.15头/胎、0.90头/胎、1.483kg，2组差异不显。
试验组产后母猪不正常发生率为16.67%，比对照组40.43%要低23.76个百分点，差异明显。
哺乳仔猪精神不佳窝发生率分别为10.0%、17.02%，差异明显。
说明母猪怀孕80～90d接种PRRS活疫苗对母猪及胎猪尚未产生不良影响，且对产后母猪和仔猪临床健康情况有明显改善。
2周、4周、6周、8周血清ELISA抗体检测结果显示19日龄1组抗体阳性率分别为92.86%、85.71%、78.57%、92.86%，19日龄2组分别为100.0%、93.33%、86.67%、100.0%，9日龄免疫组分别为100.0%、100.0%、92.86%、100.0%，对照组分别为73.33%、93.33%、86.67%、100.0%，说明免疫组和对照组升降曲线较一致，以9日龄免疫组阳性率最高，对照组和19日龄免疫组差异不大。
总体说明活疫苗在阳性场并不能抵抗野毒攻击而影响血清学抗体转化，但在减少野毒临床致病性上有较明显改善作用。
关键词：
蓝耳病活疫苗；母猪；免疫；抗体；效果
猪繁殖与呼吸综合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的高度接触性传染病，以妊娠母猪的繁殖障碍及各年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征[1]。
该病1987—1988年在美国北卡罗来纳州、明尼苏达州及衣阿华州首先发生，随后开始流行，短短几年几乎席卷了整个北美和欧洲大陆。
该病曾称为“神秘猪病”、“猪生殖与呼吸综合征”、“猪流行性流产和呼吸综合征”、“新猪病”、“蓝耳病”等，1991年欧洲学者提出命名为“猪繁殖与呼吸综合征”，1992年在美国的明尼苏达州召开的第1届国际研讨会上正式采用，世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类传染病[2]。
我国大陆于1995年首先在华北地区规模化猪场发生，1996年郭宝清首次分离到PRRSV进而证实[3]，1999年2月12日我国农业部第96号公告将其列为二类传染病。
2007年4月，农业部正式确定“无名高热病”为高致病性蓝耳病，并定义为是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株引起的一种急性高致死性疫病，仔猪发病率可达100%、死亡率可达50%以上，母猪流产率可达30%以上育肥猪也可发病死亡是其特征。
10多年来，人们对猪蓝耳病免疫学的研究开展了大量的工作，促使人们开发了多种类型的疫苗，中国市场上获农业部批准的有蓝耳病灭活疫苗如CH-1a株、NVDC-JXA1株，蓝耳病活疫苗有CH-1R株、R98株、JXA1-R株、ATCCVR-2332株。
依其毒力来源不同，存在二种，美洲株疫苗、变异株疫苗。
但猪蓝耳病疫苗的免疫效果至今尚未得到一致公认，还存在着很多的争论。
为探索蓝耳病活疫苗的临床免疫效果，我们也进行了仔猪和母猪的免疫试验，现报告如下。
1材料与方法
1.1试验疫苗
国产猪蓝耳病活疫苗（R98株，瑞普保定）。
1.2试验猪
7日龄-80日龄杜大长仔猪3452头。
大长二元怀孕母猪109头。
1.3观察
临床发病情况观察、生产技术参数统计。
1.4血样采集和处理
在2、4、6、8周龄抽样，在前腔静脉或耳静脉采集3-4mL血液，冷藏保存一夜或室温静置12h后，3000r/min离心5-10min取上清液置于1.5mL小试管内，贴标签标记后冷冻保存，等各次跟踪血清抽取处理完成后一起检测血清ELISA抗体。
1.5主要仪器设备
酶标测定仪（BioTek®），猪繁殖与呼吸综合征ELISA检测试剂盒（为美国IDEXX公司产品）。
96孔平底微量反应块，微量移液器、恒温箱、洗板机（BioTek®）等。
1.6检测方法
猪蓝耳病抗体检测参照美国IDEXX公司ELISA诊断试剂盒说明书进行。
待检血清做1∶40稀释，取血清5μL,加入稀释液195L。
取稀释好的待检血清100μL加入包被好的96孔聚苯乙烯诊断试剂盒中，置室温作用30min，取出，用洗涤液充分洗涤3-5次，甩尽残留液体，拍净于吸干纸。
每孔加入辣根过氧化物酶标记抗体100uL，室温作用30min，洗涤拍干。
再在每孔中加入TMB底物溶液100uL，室温作用15min，加入终止液100uL，立即置Bio-rad550型酶标仪上650nm处测定。
分别按所附计算公式判定是否为血清抗体阳性。
1.7结果判定
猪蓝耳病抗体阳性对照平均值（PC:
PRRS）减去阴性对照平均值（NC:
PRRS）必须≥0.150。
NHC孔阳性对照平均值（PC:
NHC）必须≤0.120，NHC孔阴性对照平均值（NC:
NHC）必须≤0.25。
另外，阴性对照平均值（NC）必须≤0.150，试验条件成立有效，否则重做。
通过计算样品与阳性对照（S/P）的比值进行抗体的阳性和阴性判定，即S/P＝[（样品A650:
PRRS）－（样品A650:
NHC）]/[（PC:
PRRS）－（PC:
NHC）],如S/P＜0.4判为阴性、≥0.4判为阳性。
1.8分组设计
试验1组为仔猪19日龄免疫组，试验2组为仔猪19日龄免疫重复批次组，试验3组为7日龄和15日龄同批分别免疫组，试验4组为9日龄免疫组，试验5组为母猪怀孕80-90d免疫组。
不管猪大小均肌肉注射1头份蓝耳病活疫苗（文易舒，R98）。
2试验结果
2.11组结果
2.1.1临床疾病情况观察（见表1）
2.1.2生产技术参数统计（见表2）
2.2试验2组结果
2.2.1发病情况观察（见表3）
表1试验1组临床观察登记表
发病
日龄
试验组发病症状
发病
日龄
对照组发病症状
45
呈现明显气急2头，15头腹泻（舍内温度15℃）
37
转入时呈现关节肿胀，神经症状，拉黄色稀便30头，作为淘汰猪，整个猪群呈现不正常趋势，被毛粗乱和关节肿胀占很大比率
47
多数发病猪腹泻有一定好转
45
神经症状进一步增加，气喘症状加重，转出一部分严重病猪，主要目的减少感染压力
48
舍内温度较低，存在扎堆现象，导致1头猪脱肛
50
猪群有一定好转，但整体观察不是特别乐观，关节肿胀和被毛粗乱占很大的比率
53
严重气喘3头，其余猪群健康状况良好
55
气喘症状有一定增加
60
基本正常，个别由于拉稀因素导致消瘦，但未出现气急症状，最终导致营养不良
60
因转出有相当大的比例，感染压力有所减轻
80
整个猪群基本上无发病
80
整个猪群不健康猪20头
表2试验1组生产技术参数统计表
技术参数
试验组
对照组
试验头数
145
801
初总重/kg
1241
6904
初头均重/kg
8.56
8.62
末总重/kg
2944
15091
末头均重/kg
21.81
19.18
净总增重/kg
1703
8187
净头增重/kg
12.61
10.40
日增重/g
293.4
241.9
饲养期/d
43
43
出栏健仔头数
133
541
死亡率/%
6.9
1.75
死亡头数
10
14
转走病僵仔头数
2
246
转走病僵仔率/%
1.38
30.7
出栏健仔率/%
91.72
67.54
表3试验2组临床观察登记表
发病
日龄
试验组发病症状
发病
日龄
对照组发病症状
43
拉稀8头，占2.9%被毛粗乱7头，占2.5%
43
17头病猪，其中4头气喘症状十分严重
46
病猪15头，1头神经症状，占5.7%
46
隔离出28头病猪，4头气喘症状严重
55
基本上不存在病猪，整体情况良好
52
2头神经症状
61
5头病猪，其中有2头拉稀导致营养不良症状
55
2头神经症状
66
转群工作，转群时2头拉稀严重，无气喘症状
56
1头神经症状
59
2头神经症状
61
1头神经症状
66
2头神经症状转群时10头明显病猪
2.2.2生产技术参数统计（见表4）
表4试验2组生产技术参数统计表
技术参数
试验组
对照组
试验头数
279
635
初始/日龄
32
32
初总重/kg
2070
4483
初头均重/kg
7.42
7.06
末总重/kg
4544
9408
末头均重/kg
16.64
14.93
净总增重/kg
2474
4925
净头增重/kg
9.06
7.82
日增重/g
274.6
236.9
饲养期/d
33
33
出栏健仔头数
270
538
死亡头数
6
5
死亡率/%
2.15
0.79
转走病僵仔头数
3
92
转走病僵仔率/%
1.08
14.5
出栏健仔率/%
96.77
84.72
2.3试验3组结果
生产技术参数统计如表5
表5试验3组生产技术参数统计表
7日龄接种
15日龄接种
接种窝数
47
38
接种头数
462
373
出栏头数
449
284
出栏率/%
97.19
76.14
出栏总重/kg
3377
2101
出栏头均重/kg
7.52
7.40
病僵猪头数
31
49
病僵猪比率/%
6.90
17.25
发病窝数
11
19
发病窝数比率/%
23.4
50.0
1-2胎母猪胎数
22
27
1-2胎母猪比率/%
46.8
71.1
1-2胎母猪发病窝数
8
16
1-2胎母猪发病窝数比率/%
36.36
59.26
1-2胎母猪窝总发病比率/%
61.5（24/49）
3胎以上母猪窝总发病比率/%
16.7（6/36）
2.4试验4组结果
2.4.1发病情况观察（见表6）
表6试验4组临床观察登记表
发病
日龄
试验组发病症状
发病
日龄
对照组发病症状
32
没有病猪转入隔离舍
32
猪群病僵猪严重，转出12头严重病猪
35
基本上不存在病猪
35
1头神经症状和13头气喘
44
拉稀开始增加，大致在40头，占13.2%
40
2头神经症状和18头关节肿胀、被毛粗乱症状的病猪
47
拉稀好转，下降至10头，占3.3%
43
拉稀增加，有50头，占12.3%
49
病猪数在20头，表现被毛粗乱，但没有气急症状表现。
47
拉稀好转，第8—9栏发病十分严重，主要是呈现关节肿胀，被毛粗乱和个别气急症状，79头，占2栏发病率的49.6%。
55
症状不严重病猪10头。
55情况好转
65
转群工作65转群工作开始
2.4.2生产技术参数统计（见表7）
2.5试验5组结果
2.5.1生产技术参数统计（见表8）
2.5.2症状评判
母猪不正常主要指吃料不好、有发热、背部皮肤毛孔有出血点或出血点连成条状、后躯皮肤、耳朵及阴户发紫等。
仔猪主要是毛耸、发热、精神不好、喜卧、行走无力、耳朵、腹下奶头、肛周、去势伤口皮肤发绀发蓝等。
表7试验4组生产技术参数统计表
技术参数
试验组
对照组
试验头数
302
455
初总重/kg
2431
3590
初头均重/kg
8.05
7.89
末总重/kg
6439
8217
末头均重/kg
21.54
18.34
净总增重/kg
4008
4627
净头增重/kg
13.40
10.33
日增重/g
304.7
256.9
饲养期/d
44
40.21
出栏健仔头数
296
380
死亡头数
3
7
死亡率/%
0.99
1.54
转走病僵仔头数
5
68
转走病僵仔率/%
1.66
15.82
出栏健仔率/%
98.01
83.52
表8试验5组生产技术参数统计表
技术参数
试验组（单号）
对照组（双号）
母猪头数
61
48
总产仔头数
677
530
胎产仔头数
11.1
11.04
总活仔头数
617
487
胎活仔头数
10.11
10.15
死胎头数
1（转走代哺）
1（本舍代哺）
总死仔头数
60
43
胎死仔头数
0.98
0.90
初生头均重/kg
1.482
1.483
产后母猪不正常/头
10
19
母猪不正常发生率/%
6.67%
140.43%
哺乳仔猪毛耸不佳窝数
6
8
哺乳仔猪不佳窝发率/%
10.0
17.02
2.6抗体检测结果
2.6.1血清ELISA抗体检测结果统计（见表9）
表9血清ELISA抗体检测结果统计表
采血时间/周
组别
9日龄免组
19日龄免组1
19日龄免组2
对照组
样本数
14
14
15
15
2
阳性数
14
13
15
11
阳性率%
100
92.86
100
73.33
平均S/P值
3.27
2.32
3
2.86
4
阳性数
14
12
14
14
阳性率%
100
85.71
93.33
93.33
平均S/P值
3.29
2.59
3.09
1.91
6
阳性数
13
11
13
13
阳性率%
92.86
78.57
86.67
86.67
平均S/P值
1.354
0.973
0.975
1.188
8
阳性数
14
13
15
15
阳性率%
100
92.86
100
100
平均S/P值
2.85
2.95
1.63
2.75
2.6.2抗体检测结果图示
PRRS抗体阳性率
3小结与讨论
3.1结果分析
1）表1说明试验1（19日龄免疫）组在45日龄开始有呼吸急促和腹泻出现，主要以腹泻为主，第3天即开始好转，到80日龄转群时统计正常。
对照组则在37日龄就有明显拉黄色稀便及明显神经症状病猪出现，1周后不得不转出部分严重病猪，到80日龄转群时统计还有20头病猪，整体临床发病明显是免疫组好。
表2显示试验组转出病猪率为1.38%，对照组为30.7%，相差29.32个百分点，差异十分明显。
同时试验组日增重293.4g，比对照组241.9g高出21.29%，差异也很显著。
从表3可以看出试验2组重复试验也是明显好于对照组，表4显示试验组僵病猪转出率为1.08%，明显低于对照组14.5%，日增重试验组为274.6g，比对照组236.9g要高出15.91%。
综合说明19日龄免疫后对保育阶段仔猪临床呼吸急促、神经症状、拉黄色稀便等疾病预防效果确切，僵病猪比率降低13.42到29.32个百分点，日增重分别提高21.29%、15.91%。
2）表5显示了7日龄免疫组和15日龄免疫的试验3组的不同结果，即到34日龄转群时，7日龄接种组出栏率为97.19%，比15日龄接种组出栏率（76.14%）要高出21.05个百分点，病僵猪分别为6.90%、17.25%，要相差10.35个百分点，说明7日龄接种免疫组明显比15日龄接种免疫组要好。
另外，1～2胎母猪所带仔猪窝发病率也差异明显，分别为36.36%、59.26%，同时1～2胎母猪总体窝发病率为61.5%，远高于2胎以上母猪窝发病率16.67%，说明1～2胎母猪所哺乳仔猪更易感。
3）表6、7是9日龄接种免疫组和不免疫对照组转到保育舍的跟踪观察结果，9日龄接种免疫组44日龄开始腹泻增加，发生率约13.2%，3日龄后开始好转，到65日龄无明显呼吸道疾病出现。
对照组转进后第8天即32日龄已开始转出12头重病猪，以呼吸急促为主，到43日龄腹泻增加，占12.3%，4日龄后腹泻好转，这和试验组相似，可能受饲养管理影响。
但对照组表现气急、关节肿胀、被毛粗乱病猪明显多，到55日龄发病才好转。
试验组僵病猪转出率为1.66%，比对照组15.82%要低14.16个百分点，日增重304.7g比对照组256.9g高出18.61%。
说明9日龄免疫组到保育段临床健康状况及生产性能明显好于不免疫组。
4）表8是统计怀孕母猪重胎期免疫后对产仔情况的影响，试验组母猪产61胎，对照组48胎，各有一窝整窝产死霉胎，母猪均正常哺乳。
试验组胎活仔、胎死霉仔、初生仔头均重依次为10.11头、0.98头、1.482kg，对照组分别为10.15头、0.90头、1.483kg，2组差异不显著。
试验组产后母猪不正常发生率为16.67%，比对照组40.43%要低23.76个百分点，差异明显。
哺乳仔猪精神不佳窝发生率分别为10.0%、17.02%，差异明显。
由此说明母猪怀孕80～90d接种PRRS活疫苗对母猪及胎猪尚未产生不良影响，且对产后母猪和仔猪临床健康情况有明显改善。
5）表9和图1显示了2周、4周、6周、8周时4个组PRRS血清ELISA抗体检测结果，试验1组抗体阳性率分别为92.86%、85.71%、78.57%、92.86%，试验2组分别为100.0%、93.33%、86.67%、100.0%，试验4组分别为100.0%、100.0%、92.86%、100.0%，对照组分别为73.33%、93.33%、86.67%、100.0%，各组抗体阳性率折线图较一致，除对照组2周阳性率最低外，均是2周、8周最高，6周最低。
且以试验4组阳性率偏高，比试验1组要分别高出7.14、14.29、14.29、7.14个百分点。
试验2组和对照组抗体阳性率在4周、6周、8周都一样。
说明免疫组和未免疫组升降曲线较一致，以试验4组阳性率最高，对照组和试验1组差异不大。
3.2小结
综合上述各组试验结果，说明各个试验组和对照组的差异都是比较明显的，对断奶后至60日龄阶段的保育仔猪呼吸道疾病复合征控制有明显效果，大大降低了猪的发病率和淘汰率，对整体猪群的健康改善比较理想，特别是临床难治愈的神经症状和黄色水样腹泻发病的比率比较低。
其中19日龄重复两批、9日龄一批共3个跟踪至保育猪的试验组的淘汰率分别是1.38%、1.08%、1.66%，对照组分别是30.7%、14.5%、15.82%，出栏健仔率试验组分别是91.72%、96.77%、97.35%，对照组分别是67.54%、84.72%、82.64%，日增重试验组分别是293.4g、274.6g、304.7g，对照组分别是241.9g、236.9g、256.9g，差异很明显。
对1～2胎母猪比率高达46.8%～71.1%的产后哺乳仔猪分别在7日龄和15日龄一次免疫试验表明，2组仔猪窝发病率分别为23.4%、50.0%，出栏健仔率分别为97.19%、76.14%，说明对1～2胎母猪产后仔猪7日龄免疫比15日龄免疫更好。
3.3讨论
1）对免疫效果的分析主要推测免疫蓝耳病活疫苗能减轻蓝耳病的感染压力，使猪群的抵抗力较正常，降低了继发疾病的风险。
同时说明正常胎龄结构母猪群所产仔猪在2-3周龄免疫较好，1-2胎母猪所产仔猪在1周龄免疫较好，这可能和初胎母猪对蓝耳病的敏感性相对较高有关。
为什么每个试验组和对照组都有明显差异，分析是不是免疫组猪群存在排毒现象，对不免疫组猪群带来了不利影响？
同时免疫母猪试验正处于气温较适宜季节，可能在冬季免疫结果就会有不同，因为一般情况下冬季寒冷季节母猪更易表现PRRS症状。
据李永友[4]（2009）通过检测4种免疫进口蓝耳病弱毒苗程序的免疫效果，认为实行超免0.2头份和14日龄免疫0.3头份的免疫效果较好，14日龄免疫的相对较差。
据日本SayokoIshizeki[5]对没有表现出病毒血症或其他任何临床症状的1日龄仔猪进行PRRSV致弱活疫苗接种，结果免疫仔猪哺乳和保育期表现出明显的PRRS临床症状，保育死亡率和日增重明显比未接种组更差，38日龄可检测到核酸，52日龄发现典型PRRS组织病理学病变，ORF5测序表明11个PCR阳性样品中10个与PRRSV疫苗株99.2%～99.8%的同源性，有1个是野毒株，与疫苗株同源性为87.7%。
因此，PRRS活疫苗免疫还存在许多不一致性。
2）抗体检测结果和临床免疫效果相差很大，这也说明猪蓝耳病ELISA抗体并不代表保护水平。
这和周绪斌[6]等（2009）年对山东15个场2～3周注射PRRS弱毒苗的抗体检测结果有相似之处，即注射后并未检测到非常明显的血清学转化，多数场在7～10周龄出现明显的血清学转化，说明很可能是田间感染和疫苗注射的综合反应。
另据曹斌[7]（2008）等选取11个规模猪场，分别使用猪蓝耳病进口弱毒疫苗、国产弱毒疫苗、普通灭活疫苗、猪高致病性蓝耳病灭活疫苗对生产母猪和仔猪进行免疫，二免28日龄后，采集免疫猪群的血清，进行免疫抗体检测，结果表明：
生产母猪使用不同类型的蓝耳病疫苗免疫后所产生的抗体阳性率均高于仔猪免疫后所产生的抗体阳性率，生产母猪和仔猪使用弱毒疫苗的抗体阳性率均高于灭活疫苗。
这说明弱毒苗还是能产生较好的抗体阳性率。
有关资料分析在阳性猪场，即使不打苗免疫抗体检测也能测出有很高的抗体，蓝耳病疫苗抗体和野毒感染产生的抗体从当前的检测手段还不能区分开，抗体的高低并不能说明疫苗的优劣。
可以从免疫后猪只的健康状
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