生物药物的分类基因重组多肽蛋白类治疗剂基因药物.docx

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生物药物的分类基因重组多肽蛋白类治疗剂基因药物

1、生物药物的分类：

（1）基因重组多肽、蛋白类治疗剂

（2）基因药物（3）天然生物药物（4）合成与部分合成的药物。

DNA重组药物和基因药物的区别：

DNA重组药物即应用重组DNA技术（包括基因工程技术和蛋白质工程技术）制造的重组多肽、蛋白质类药物和疫苗、单克隆抗体与细胞因子等；

基因药物即以基因物质（DNA或RNA）为基础，研究而成的基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。

3、DNA重组药物主要有哪几类，举例说明。

DNA重组药物有：

（1）细胞因子干扰素类：

α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素

（2）细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子：

白介素-2（IL-2）和突变型白介素-2（Ser125-IL-2）

肿瘤坏死因子类主要有TNF-α和TNF-α受体。

（3）造血系统生长因子类：

粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬细胞粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）、促红细胞生成素（EPO）、促血小板生成素（TPO）干细胞生长因子（SCF）

（4）生长因子类：

胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDFD）、转化生长因子（TGF-α和TGF-β）、神经生长因子（NGF）及各种神经营养因子。

（5）重组多肽与蛋白质类激素：

重组人胰岛素（rhInsulin）、重组人生长激素（rhGH）、促卵胞激素（FSH）、促黄体生成素（LH）和绒毛膜促性腺激素（HCG）、重组人白蛋白和重组人血红蛋白

（6）心血管病治疗剂与酶制剂：

Ⅷ因子、水蛭素、tpA、rtpA、尿激酶、链激酶、葡激酶、天冬酰胺酶、超氧化歧化酶、葡萄糖脑苷酶及DNsae等

（7）重组疫苗与单抗制品：

重组乙肝表面抗原疫苗、乙肝基因疫苗、AIDS疫苗、流感疫苗、痢疾疫苗和肿瘤疫苗。

2简述生物活性物质分离纯化的主要原理：

根据混合物中的不同组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，或者将混合物置于某一相中，外加一定作用力，使多组分分配于不同区域，从而达到分离的目的。

主要纯化原理有：

（1）根据分子的形状和大小不同进行分离

（2）根据分子电离性质（带电性）的差异进行分离（3）根据分子极性大小及溶解度的不同进行分离。

（4）根据物质吸附性质的不同进行分离（5）根据配体特意性进行分离

3、保存菌种、菌种退化、检查菌种退化

常用的菌种保存方法：

斜面低温保藏法、液体石蜡封藏法、冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法、甘油冷冻保藏法、其他如沙土管保藏法。

菌种的退化意味着随时间的推移菌种的一个或多个特性逐步减退或消失，最终导致营养细胞的死亡。

一般把菌株的生活力、产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降统称为退化。

检查菌种退化：

（1）单位容积中发酵液的活性物质含量

（2）琼脂平皿上的单菌落形态，（3）不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特征，如形成孢子的能力；（4）发酵过程的pH变动情况（5）发酵液的气味、色泽

4重组DNA技术基本原理，如何获取目的基因

基因工程是通过体外重组将甲生物体的基因转入乙受体生物体内进行表达的生物技术。

获取目的基因的方法有：

（1）鸟枪克隆法

（2）人工合成目的基因1、酶促方法2、化学合成法

5常见的基因载体有，如何构建基因重组体

在体外将含目的基因的DNA片段和具有自我复制功能、并带有选择标记的载体分子进行酶切连接，获的重组DNA分子。

常见的基因载体有：

链霉菌质粒、芽孢杆菌载体、质粒、噬菌体（phage）、黏粒（cosmid）、病毒载体等。

6DNA重组体有主要有哪几种表达系统？

各有什么特点？

基因工程包括转录、翻译及翻译后加工等过程。

根据宿主细胞种类不同，分为原核基因工程和真核基因工程。

原核基因工程以原核细胞作为表达宿主，如大肠杆菌、枯草杆菌等；而真核基因工程则以真核细胞为表达宿主，如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。

（1）大肠杆菌表达系统：

遗传背景比较清楚，使用安全、技术操作简便，繁殖力强（20~30min即可繁殖一代），便于大规模培养，成本较低，表达水平较高（可达总蛋白的5%~6%），下游技术成熟、易于控制。

目前使用最广泛、最成功的表达系统。

（2）酵母表达系统：

是真核表达体系，对表达蛋白可进行折叠和翻译后的修饰与糖基化；表达量高，如明胶表达量达14。

8g/L;培养成本低；适用高密度发酵；杂蛋白少，产物易纯化。

（3）哺乳动物表达系统：

中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和猴肾细胞（COS）优点是能识别和剪切外源基因的内含子并加工成为成熟的mRNA.但其培养技术难度大，成本高，研究与生产周期长。

三体系表达特点比较

表达体系

产物

产生部位

培养方式

提纯

产物活性

潜在危险

大肠杆菌

多肽、蛋白质或融合蛋白质

菌体内

容易

部分可获得高产

一般

对原核者好

真核者稍差

不大

酵母

多肽、蛋白质或糖基化蛋白

菌体内或分泌出细胞

容易

可高产

菌体内，稍复杂

真核的接近天然

不大

哺乳动物细胞

完整糖基化蛋白质

分泌出细胞

较难成本高

可高产

简单

几乎可为天然产物

需注意有致癌因素

1、去处发酵液中的杂蛋白的方法：

（1）加入凝聚剂

（2）加入絮凝剂（3）变性沉淀（4）吸附（5）等电点沉淀

（6）加各种沉淀剂

2、去处发酵液中的钙、镁、铁离子的方法：

（1）离子交换法去铁离子

（2）沉淀法钙与草酸钠或草酸镁的去处用草酸沉淀不完全，碱性条件下用磷酸盐，或三聚磷酸钠，生成络合物（污染河水）

3、影响絮凝效果的主要因素：

絮凝剂分子量、絮凝剂用量、pH及操作条件

絮凝剂分子量越大，链越长，吸附桥架效果就越明显，但分子链越大，絮凝剂在水中的溶解度降低；

絮凝剂浓度越低，增加用量有助于架桥，提高絮凝效果，但过多引起吸附饱和，在胶粒表面形成覆盖层，使胶粒稳定，降低絮凝效果；

pH的变化影响离子型絮凝剂功能团的电离度，电离度的提高使电排斥作用增强，架桥能力最佳；

搅拌应注意，刚开始搅拌迅速使絮凝剂分散，发挥絮凝作用，絮凝团形成后，高的剪切力会打碎絮凝团。

4细胞破碎：

方法

原理

特点

机械法

匀浆法

基于液相的剪切力

适用面广，处理量大，速度快，工业广泛使用，不适用某些高度分支微生物，产热大，可能会生物活性物质失活

珠磨法

研磨作用破碎

适用面广，处理量大，工业广泛使用，产热大，可能会生物活性物质失活

超声波

超声波的空穴作用破碎

产热大，散热不易，成本高，适用小量样品破碎

物理法

干燥法

菌体细胞膜渗透性变化，自溶

较剧烈，易引起蛋白质或其他组分变性

冻融法

胞内冰晶引起细胞膨胀破碎

较温和，但破碎作用较弱，常需反复冻融，实验室使用

渗透压冲击法

渗透压突然变化，细胞快速膨胀变化

较温和，但破碎作用较弱，常与酶法合用

化学法

化学试剂处理

化学试剂溶解细胞或抽提某些细胞成分

需选择合适的试剂，减少对活性物质的破坏，可应用于大规模生产

制成丙酮粉

丙酮迅速脱水，破坏蛋白质与脂质结合的键

迅速脱水，减少蛋白质变性，促进某些结合酶释放

生物法

酶解法

用酶反应分解破坏细胞壁上特有的化学键

反应条件温和，但成本较高，一般仅适用于小规模应用

组织自溶法

利用组织中酶改变、破坏细胞结构、使组织自溶

反应条件温和、成本低，不适用于易受酶降解的目的物的提取

2、溶液萃取法按操作方式不同，可分为单级萃取和多级萃取，后者分为错流萃取和逆流萃取。

当萃取剂用量相同时，二级萃取收率比单级萃取收率高，在萃取用量一定的情况下，萃取次数愈多，则萃取愈完全。

多级逆流与错流萃取相比，萃取剂耗量较少，萃取液平均浓度较高。

4、破坏乳状液的方法：

（1）、加入表面活性剂

（2）离心（3）加电解质（4）加热（5）吸附法破乳（6）高压电破乳（7）稀释法（8）其他途径：

超滤、反应萃取、中性磷萃取、脂肪类萃取剂

第五章沉淀和结晶

1、盐析沉淀是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀形式析出，从而达到纯化目的的方法。

基本原理：

一、盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合，形成离子对，因此盐离子部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互结合。

二、中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，疏水区相互作用，使其沉淀。

2、影响盐析效果的因素：

（1）无机盐的种类

（2）溶质（蛋白质）种类的影响（3）蛋白质浓度的影响（4）温度的影响（5）pH的影响

3、影响沉淀效果的因素：

（1）有机溶剂种类及用量

（2）pH的影响（3）温度（4）无机盐的含量（5）某些金属离子的助沉淀作用（6）样品浓度

4、形成过饱和溶液的方法：

（1）蒸发法

（2）温度诱导法（3）盐析结晶法（4）透析结晶法（5）有机溶剂结晶法（6）等电点法（7）微量扩散法（8）化学反应结晶法（9）共沸蒸馏结晶

5、影响晶体大小的因素：

（1）过饱和度：

增加过饱和度能使成核速度和晶体生长速度加快，对前者影响较大，过饱和度增加，晶体较细小。

（2）温度快速冷却，达到较高的过饱和度，晶体细小形成针状晶；反之，缓慢冷却得到较粗大的晶体。

（3）搅拌速度：

搅拌能促进成核和加快扩散，提高晶核长大的速度，过快则晶体会被打碎。

经验表明，搅拌速度愈快，晶体愈细。

（4）晶种加入晶种能诱导结晶，还能控制晶体的形状、大小和均匀度。

2、吸附剂及被吸附物的极性对吸附的影响：

一般极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。

极性吸附剂适宜从非极性溶剂中吸附极性物质，非极性吸附剂适宜从极性溶剂中吸附非极性物质。

如活性炭从水中吸附有机化合物；硅胶是极性的，适宜从有机溶剂中吸附极性物质。

4两种以上常用吸附剂的性质，用途。

活性炭：

吸附能力很强的非极性吸附剂。

价格低，来源广。

除杂，生化药物的分离。

人造沸石：

人工合成的无机阳离子交换剂。

带正电荷。

与钠离子交换。

磷酸钙凝胶：

吸附作用主要是钙离子与蛋白质负电基团结合。

白陶土：

活性物质分离纯化的吸附剂，也可作为助滤剂与去除热原的吸附剂。

白陶土能吸附分子量较大的杂质，包括导致过敏的物质，常用它脱色。

氢氧化铝凝胶：

氧化铝：

适用于亲脂性成分的分离价廉，再生容易，活性易控制，操作不便，手续繁琐，处理量有限

硅胶：

活性强弱与自由水的含量有关，自由水多，活性低，自由水少，活性高。

5、大网格高聚物吸附剂与传统吸附剂相比的优点：

选择性好、解吸容易，理化性质稳定，机械强度好，反复使用，流体吸力较小。

1、公式Ve=Vo+KdVi各字母的含义，凝胶层析的原理。

Ve——淋出体积Vo——粒尖体积Vi——填料的孔体积Kd——排阻系数或分配系数

凝胶层析原理：

平衡排除理论一个高聚物分子的流出体积是由在宏观的流动相和微观的孔体积中的平衡分配系数所决定的。

这里所谓的平衡是指扩散的平衡，即溶质分子扩散进入一个填料颗粒孔中且再出来所需要的时间远小于溶质区段在此停留的时间。

换言之，当溶质分子流过一个填料颗粒这段距离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。

平衡条件只是在流速很慢时一个极端情况。

2、常用凝胶的名称、特点及用途。

名称

特点

用途

葡聚糖凝胶（SephadexG）

最常用，稳定，对阳离子轻微吸附，多次重复使用

分离

修饰葡聚糖凝胶

聚丙烯酰胺凝胶

化学稳定好，成分不易脱落，适用pH广，机械强度好，无带电基团，分辨率较高

琼脂糖类凝胶

多孔玻璃微球