胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究.docx
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胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究
胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究
摘要
通过沉淀离心法提取胰蛋白酶的专一性抑制剂-鸡卵类粘蛋白（CHOM）,作为亲和配基，利用亲和层析法进行分离纯化胰蛋白酶，接着以抑制剂对酶反应速度的影响了解酶促反应，掌握其规律，来最大限度地实现酶促反应的高效率，寻找最有利的反应条件以及了解酶在代谢中的作用，最后SDS-PAGE进行酶纯度检验以及其相对分子量的测定。
关键词：
胰蛋白酶鸡卵粘蛋白亲和层析法米氏常数酶促反应动力聚丙烯酰胺凝胶电泳
Trypsinofisolationandpurificationanddynamicresearch
ABSTRACT
Throughtheprecipitationcentrifugationextractionspecificityoftrypsininhibitor-chickeneggkindmucin（CHOM）,asaffinityligands,usingthemethodofaffinitychromatographyseparationandpurification,andthentobytrypsininhibitorenzymereactionspeedisknownabouttheeffectsofenzymaticreaction,grasptheirrule,comemaximallyrealizeenzymaticreactionefficient,findthemostfavorablereactionconditionsandunderstandtheroleinmetabolicenzymes,finallysds-pageforenzymeanditsrelativemolecularweightinspectionpurityofdetermination.
摘要Ⅰ
ABSTRACTⅡ
目录Ⅲ
1引言1
2材料与方法1
2.1原料与试剂1
2.2仪器设备1
2.3实验方法2
2.3.1CHOM的分离2
2.3.2CHOM的定量2
2.3.3胰蛋白酶的分离2
2.3.4酶活力的测定2
2.3.5纯化效果及纯化蛋白质相对分子量的测定2
3结果与讨论3
3.1CHOM的分离和定量3
3.2胰蛋白酶的纯化4
3.3酶活力的测定5
3.4纯化效果及纯化蛋白质分子量的测定6
4总结7
参考文献8
附录9
1引言
胰蛋白酶是取自猪胰脏的一种蛋白质水解酶，属于丝氨酸蛋白酶家族的消化酶。
胰蛋白酶在胰腺中合成并以非活性的酶原形式分泌到消化道中，在消化道中酶原通过除去部分肽链转变成活性酶形式。
所以胰蛋白酶不仅是一种重要的消化酶，而且对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶前体的活性化等其重要作用。
胰蛋白酶也是一种重要的工具酶，特别在生物化学、蛋白质组学、细胞生物学、医学等领域中得到了广泛的应用，利用胰蛋白酶可将大分子蛋白质酶解成小分子多肽片段以用于质朴分析、动物细胞培养、制备人胰岛素等。
2材料与方法
2.1原料与试剂
蛋清制得的CHOM冻存于-4℃冰箱内备用;
澄清金黄色胰脏抽提液（PX），考马斯亮蓝试剂，亲和柱平衡液，亲和柱洗脱液，标准蛋白质溶液，BAEE底物溶液，0.05M，pH8.0Tris-HCl缓冲液，电泳缓冲液（disc-PAGE,SDS-PAGE）,凝胶加样缓冲液（LoadingBuffer）等等。
2.2仪器设备
抽滤装置；移液枪；磁力搅拌器；高速离心机；分光光度计；小型亲和层析柱；蠕动泵；恒温浴水锅；DYY-6C型直流稳压电泳仪；DYCZ-24EN双垂直蛋白电泳槽（北京六一仪器厂）；脱色摇床；凝胶成像系统等。
2.3实验方法
2.3.1CHOM的分离
取蛋清50mL放入一个50mL烧杯中，加入75mLTCA-丙酮，边加边搅拌，立即出现大量白色絮状沉淀，调节pH至3.5左右，继续搅拌15min,然后置于-20℃冰箱放置30min。
将溶液装于50mL离心管中，5000rpm、离心5min,取上清液边搅拌边加入2倍体积-20℃预冷丙酮，生成沉淀；在-20℃下静置30min;取下部沉淀6000rpm、离心15min;挖出沉淀溶于10mL纯水，调节pH至4.5，然后再-20℃下对1L纯水进行透析，每1h换一次水。
透析后若产生沉淀，6000rpm、离心10min除去，将上清边搅拌边加入4倍体积-20℃预冷丙酮，产生大量沉淀，在-20℃冰箱放置10min,6000rpm、离心10min,倒弃上清，用预冷丙酮小心洗涤沉淀表面，稍微干燥。
加入5mL纯水轻轻震荡溶解，便得到CHOM.
2.3.2CHOM的定量
Bradford法：
利用CBG可与蛋白质结合而变色的特性来定量，若样品中蛋白质含量较多，则结合到蛋白质而变色的CBG也多，因而显色较深。
实验以一组标准蛋白质为对象，制作一条蛋白质与光吸收值的标准曲线，
来求得样品蛋白质含量。
2.3.3胰蛋白酶的分离
取2g甲壳素加入2mLCHOM水溶液（8.07mg蛋白含量）和0.25mLCHOM水溶液（173.5mg蛋白含量）混匀，加入1.25mL25%戊二醛，和12.4mL水，室温下反应45min,加入Tris-HCl缓冲液悬浮，装于固定好的并装有1/4体积的亲和柱平衡液的亲和层析柱中，自然沉淀，调节蠕动泵流速2～4mL/10min,不断加入Tris-HCl缓冲液，保持柱内液面高于吸附剂面，收集出口溶液，并用分光光度计测定A280值小于0.01即可。
当柱面与床面刚好相切时便上样，调整流速越4s一滴，收集15管流出液4mL/管，经紫外分光光度计测定A280值。
再用亲和柱洗脱液进行洗脱，控制流速8s一滴，收集21管流出液2mL/管，考马斯亮蓝法测定每根试管的蛋白含量，保留蛋白含量最高试管的收集液。
BAEE法测定胰蛋白酶的酶活力和比活力。
2.3.4酶活力的测定
以BAEE为底物进行测定，按已下表格依次得出数据，根据每个底物浓度下的△A253/min,求得酶促反应的初速度v，利用双倒数作图法，以不同浓度的抑制剂下的1/v对1/[S]作图，判断抑制剂类型。
2.3.5纯化效果及纯化蛋白质分子量的测定
在外场力的作用下，带电的蛋白质分子，将向着与其电荷符号相反的电极移动，该现象称为电泳。
目前使用较广泛的凝胶电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳用于蛋白质的分离。
通过各阶段纯化效果及纯化蛋白分子量用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析,并与相对分子质量标准蛋白质（低）做对照，用考马斯亮蓝R-250染色。
3结果与讨论
3.1CHOM的分离和定量
蛋白质标准曲线图
样品稀释了200倍，A595=0.116nm。
根据y=1.0481x-0.0108得，
样品蛋白质含量为8.07mg/mL。
根据以上得出的结果，可知道样品蛋白质含量偏低,原因如下:
①样品透析之后仍具浑浊现象，表明该样品不纯。
②标准曲线数据侧得有偏差。
③调节pH值的时候并未达到那个要求，致使部分蛋白质耗失。
3.2胰蛋白酶的纯化
亲和层析平衡曲线图
通过与亲和层析法的典型溶离图谱做对比，得出以下结论：
①第一个波峰表明该收集液中主要为杂蛋白，而在第十根管的时候突然上升的原因是比色皿未清洗干净。
②再经过洗脱后，第二个波峰表明该收集液主要为胰蛋白酶，这时候收集的两根收集液含有的胰蛋白酶较高，也就其纯度达到最大值。
③所制得的曲线图谱与典型图谱相差不大，说明本实验较为合理，得到的胰蛋白酶较纯。
酶时间-光吸收关系
含量（mg/mL）
活力
比活力
纯化倍数
粗酶
2.6917
12333.333
22909.93
2.62
纯酶
0.0345
414.545
60078.99
根据以上计算所得的结果，可有以下结论：
①达到的纯化倍数相对很低，因为CHOM含杂蛋白比较多。
②亲和吸附剂的制作转移过程中，耗掉了少量的吸附剂，以至于耗失少量的胰蛋白酶。
③装柱与平衡时，收集的出口溶液，经紫外光分光光度计测定A280值并未小于0.01，稍大。
④由于酶放置久其酶活力会下降。
但是酶的纯度相对较高。
3.3酶活力的测定
利用米式作图法以及双倒数作图法，所制得的关于测定胰蛋白酶Km值与酶初速度v之间的关系图，如下：
米氏方程双倒数法作图
根据以上图示T方程式y=0.0519x+0.1211,得，
Km=2.11;Vmax=0.16μmol/（L·min）
抑制剂类型判断图
根据图中T1和T2的曲线做对比，可知道Km基本上不变，而Vmax是降低了。
即该抑制剂类型为竞争性抑制。
3.4纯化效果及纯化蛋白质分子量的测定
纯化效果以及目的蛋白质分子质量大小以SDS-PAGE表示如图：
A1
A2
A3
A4
A5
A6
相对迁移率mR
0.1293
0.1919
0.303
0.5152
0.7172
0.8646
蛋白子分子质量的对数logMr
4.9877
4.8222
4.6463
4.4624
4.3032
4.1553
蛋白质相对分子质量的测定
①通过以上标准蛋白质分子质量标准曲线得出的方程式为
y=-1.0496x+5.0389
②CHOM中蛋白质到前沿距离为1.82cm~2.34cm,,得出其中蛋白质分子量大小分别为44978~14300。
从图谱作比较可知该CHOM含杂蛋白较多。
③纯酶到前沿距离为2.85cm,得到胰蛋白酶的分子量大小为26915。
从图谱中发现只有一条色带，表明该酶纯度较高。
④粗酶到前沿距离为1.17cm,得到胰蛋白酶的分子量大小为61802。
4总结
在配置亲和基时，根据所得的蛋白质含量，纯度分析，用透析法配置的CHOM纯度不够大，致使纯化后的酶的比活力不大，纯度倍数不明显。
纯酶的分子量大小仅为26915。
本实验的周期比较长，因此酶的活力总体上是较低的。
根据实验数据及结果分析，本实验的设计是教合理的。
通过对胰蛋白酶的分离纯化及其动力学研究来掌握蛋白质的分离纯化方法，将理论与实践相结合，达到真正的运用。
蛋白质分离纯化方法在生物化学、医学等领域中的应用是必不可少的，因此必须很好的掌握该技巧。
参考文献
王镜岩朱圣庚徐长法编著生物化学。
朱超锋，苟斌全，刘小刚LMB2011.ZHBIL生物化学实验手册
附录
1.标准蛋白质含量测定
表3-1
蛋白质含量0.1mg/mL
0
0.03
0.09
0.15
0.21
0.27
A595
0
0.017
0.075
0.135
0.223
0.271
2.亲和层析平衡
表3-2
次数
A280
次数
A280
#1
0.039
#18
0.036
#2
0.04
#19
0.035
#3
0.628
#20
0.03
#4
2.872
#21
0.058
#5
2.892
#22
0.049
#6
2.872
#23
0.058
#7
2.451
#24
0.02
#8
0.991
#25
0.03
#9
0.336
#26
0.089
#10
0.686
#27
1.815
#11
0.239
#28
2.451
#12
0.083
#29
0.443
#13
0.068
#30
0.249
#14
0.059
#31
0.163
#15
0.057
#32
0.132
#16
0.046
#33
0.09
#17
0.039
#34
0.072
3.粗酶时间-光吸收测定
表3-2
T/min
0
0.5
1
1.5
2
A253
0.072
0.097
0.123
0.147
0.173
T/min
2.5
3
3.5
4
4.5
A253
0.197
0.222
0.246
0.27
0.294
4.细酶时间-光吸收测定
表3-2
T/min
0.5
1
1.5
2
2.5
3
A253
0.032
0.057
0.083
0.107
0.131
0.155
T/min
3.5
4
4.5
5
5.5
6
A253
0.18
0.204
0.227
0.25
0.26
0.26
5.酶活力测定
表3-2
组别
管号
BAEE底物
缓冲液
Trypsin酶液
CHOM抑制剂
#1
1
B
0.4
2.6
——
——
2
T
2.4
0.2
——
3
Ti1
2.38
0.2
0.02
4
Ti2
2.35
0.2
0.05
#2
5
B
06
2.4
——
——
6
T
2.2
0.2
——
7
Ti1
2.18
0.2
0.02
8
Ti2
2.15
0.2
0.05
#3
9
B
0.8
2.2
——
——
10
T
2
0.2
——
11
Ti1
1.98
0.2
0.02
12
Ti2
1.95
0.2
0.05
#4
13
B
1
2
——
——
14
T
1.8
0.2
——
15
Ti1
1.78
0.2
0.02
16
Ti2
1.75
0.2
0.05
#5
17
B
1.2
1.8
——
——
18
T
1.6
0.2
——
19
Ti1
1.58
0.2
0.02
20
Ti2
1.55
0.2
0.05
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