固相萃取基本原理与应用.docx

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固相萃取基本原理与应用

一、固相萃取基本原理与操作

1、固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理

固相萃取主要通过目标物与吸附剂之间的以下作用力来保留/吸附的

1）疏水作用力：

如C18、C8、Silica、苯基柱等

2）离子交换作用：

SAX,SCX，COOH、NH2等

3）物理吸附：

Florsil、Alumina等

2、pH值对固相萃取的影响

pH值可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度。

对于强阳/阴离子交换柱来讲，因为吸附剂本身是完全离子化的状态，目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附保留。

而目标物的离子化程度则与pH值有关。

如对于弱碱性化合物来讲，其pH值必须小于其pKa值两个单位才可以保证目标物完全离子化，而对于弱酸性化合物，其pH值必须大于其pKa值两个单位才能保证其完全离子化。

对于弱阴/阳离子交换柱来讲，必须要保证吸附剂完全离子化才保证目标物的完全吸附，而溶液的pH值必须满足一定的条件才能保证其完全离子化。

3、固相萃取操作步骤及注意事项

针对填料保留机理的不同（填料保留目标化合物或保留杂质），操作稍有不同。

1）填料保留目标化合物

固相萃取操作一般有四步（见图1）：

Ø活化----除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境。

（注意整个过程不要使小柱干涸）

Ø上样----将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。

（注意流速不要过快，以1ml/min为宜，最大不超过5ml/min）

Ø淋洗----最大程度除去干扰物。

（建议此过程结束后把小柱完全抽干）

Ø洗脱----用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。

（注意流速不要过快，以1ml/min为宜）

如下图1:

2）填料保留杂质

固相萃取操作一般有三步（见图2）：

Ø活化--除去柱子内的杂质并创造一定的溶剂环境。

（注意整个过程不要使小柱干涸）

Ø上样--将样品转移入柱，此时大部分目标化合物会随样品基液流出，杂质被保留在柱上，故此步骤要开始收集（注意流速不要过快）

Ø洗脱---用小体积的溶剂将组分淋洗下来并收集，合并收集液。

（注意流速不要过快）

此种情况多用于食品或农残分析中去除色素。

如下图2：

二、固相萃取方法的建立与优化

固相萃取技术使用起来虽然比液液萃取简单，但建立一个固相萃取的方法并无快捷方式可走。

建立固相萃取方法必须考虑与萃取过程相关的多种因素，归纳起来可通过下图来了解：

方法建立如下图片1.jpg：

方法建立如下图片2.jpg：

1、初步固相萃取方法的建立

建立初步的萃取方法要考虑:

·选择合适的SPE柱

·选择合适的固相萃取方法

·方法的优化

2、固相萃取柱的选择<

1）柱填料的选择

首选根据目标化合物与干扰物的差异，如极性，分子量，pka值等，选择合适的填料。

固相萃取柱的选择如下图片.jpg：

2）固相萃取柱规格的选择

对于反相、正相和吸附型固相萃取柱来说，被萃取样品的质量不超SPE柱填料的5%（参考值，同一种SPE柱对不同的目标物选择性不同，吸附容量不同）；而离子交换型的固相萃取柱，必须考虑离子交换的容量。

不同厂家的小柱离子交换容量稍有差异。

下表附SPE小柱的容量和洗脱参数

SPE柱上样容量和洗脱体积的选择

规格

最大上样量

最小洗脱体积

100mg/1mL

5mg

250µL

200mg/3mL

10mg

500µL

500mg/6mL

25mg

1.2mL

1g/6mL

50mg

2.4mL

3、选择合适的固相萃取方法

固相萃取的保留机制可分为两种：

·吸附剂（填料）保留目标化合物：

绝大多数化合物应用此机制，填料保留其目标组分及少量杂质，通过淋洗步骤去除吸附在柱上的少量杂质，最后选择合适的（洗脱）溶剂把目标组分洗脱下来。

根据吸附剂的保留机理可进一步分为：

（1）反相（C18,C8,CN,Phenyl,C4,C1）

·分析物：

非极性至中等极性基质：

水溶性

·方法：

a.活化：

通常用水溶性有机溶剂如甲醇活化，然后用水平衡

b.淋洗：

含0-50%极性溶剂的缓冲溶液淋洗杂质

c.洗脱：

极性或非极性溶剂洗脱目标物

（2）正相（Silica,Florisil,Diol,NH2）

·分析物：

中等极性到强极性

·基质：

非极性至中等极性

·方法：

a.活化：

非极性有机溶剂

b.洗脱：

非极性有机溶剂

如下图片：

（3）阳离子交换（SCX,PRS,COOH）

u分析物：

阳离子（碱性）化合物

u方法：

1.活化：

用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂过柱后，然后用水平衡，最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。

2.上样：

样品溶液pH值要小于其pKa两个单位（以保证其带电荷）

3.洗脱：

洗脱溶液pH值要大于其pKa两个单位（中和分析物的电荷）

（4）阴离子交换（SAX,PSA,NH2，PAX/MAX）

u分析物：

阴离子（酸性）化合物

u方法：

1.活化：

用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂活化后，然后用水平衡，最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。

2.上样：

样品溶液pH值要大于其pKa两个单位（以保证其带电荷）。

3.洗脱：

洗脱溶液pH值要小于其pKa两个单位（中和分析物的电荷）。

u吸附剂（填料）保留杂质：

食品中色素等杂质的去除多用此机制。

填料保留杂质而不保留或只保留极少量的目标组分，所以上样后即开始收集目标组分，最后用目标物所在的溶剂进一步洗脱。

合并两部分收集液。

（1）活化：

以样品所在的有机溶剂进化活化，1-2柱管体积

（2）上样：

提取液转移至柱内，并收集流出液

（3）洗脱：

用样品所在的有机溶剂进一步洗脱，收集流出液。

合并上样和洗脱流出液。

4、固相萃取方法的优化

1）影响萃取效率的因素

（1）填料（固定相）-----核心

选择合适的SPE柱是保证理想结果的前提。

（2）洗脱溶剂的强度：

Ø采用正相固定相时，溶剂强度随其极性增强而增加；

Ø采用反相固定相时，溶剂强度随极性减弱而增强。

（3）pH值：

离子交换固定相、被分析物和干扰物质的pKa各不相同。

通过调节pH大小，可以使固定相带电荷，被分析物带相反电荷，而使干扰物质不带电荷；或者反过来，使固定相带电荷，干扰物质带相反电荷，而使被分析物不带电荷。

（4）操作：

控制合适的流速、活化的时不要让柱干涸等

2）常见问题及解决方法

·分析物回收率低

·萃取重现性差

·洗脱馏分中含有干扰物

·SPE柱流速降低或阻塞

具体解决方案如下：

A.分析物回收率低

•未保留？

•被淋洗？

•未被洗脱或部分洗脱？

首先要把上样液、淋洗液、洗脱液均收集，进样分析，确定问题来源

回收率差如下图片：

重现性差如下图片：

相关图片如下

2）鸡蛋中三聚氰胺的检测（CleanertPCX,P/N:

CX0603）

1材料和方法

1.1主要仪器和试剂，

色谱柱（VenusilASBC8，4.6*250mm，5μm，艾杰尔科技），混合型阳离子交换固相萃取柱（CleanertPCX，60mg/3mL，艾杰尔科技），12位固相萃取装置（艾杰尔科技），高效液相色谱仪；高速离心机；超声波震荡仪；涡旋混合器；分析天平（万分之一）；溶剂过滤器（带0.45μm有机、水系过滤膜和真空泵）；乙腈（HPLC级）；三聚氰胺标准品（≥99.0%）；柠檬酸（分析纯）；庚烷磺酸钠（色谱级）；水（二次蒸馏水以上）。

1.2色谱条件：

色谱柱：

VenusilASBC8，4.6*250mm，5μm；

流动相：

乙腈∶10mM/L柠檬酸+10mM/L庚烷磺酸钠缓冲液=7∶93（pH=3.0）

检测波长：

240nm；流速：

1mL/min；进样20μL。

2实验部分

2.1三聚氰胺标准溶液配制：

称取三聚氰胺标样10.0mg，加流动相溶解定容至100mL，即得浓度为100mg/L的三聚氰胺标样溶液。

将浓度为100mg/L的三聚氰胺标准溶液分别用水稀释成浓度为1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L的标准品溶液，用0.45μm滤膜过滤后进液相色谱检测。

2.21%三氯乙酸溶液溶液的配制

称取三氯乙酸1.00g，加水溶解定容至1000mL即得。

2.35%氨化甲醇的配制

准确量取5mL氨水和95mL甲醇，混匀后备用。

2.45%醋酸铅溶液的配制

称取5.0g醋酸铅，加水溶解定容至100mL即得。

2.5混合型阳离子交换固相萃取柱（CleanertPCX60mg/3mL）的活化

取CleanertPCX固相萃取柱，以3mL甲醇，3mL水依次过柱活化，弃去流出液，备用。

2.5加标样本处理

将鸡蛋打开搅匀，分别称取1.00g鸡蛋样本置于10mL具塞离心管中，分别加入100mg/L三聚氰胺标样溶液10μl、20μl、100μl，分别得到添加浓度为1.0mg/kg、2.0mg/kg、10.0mg/kg的样本。

往装有上述样本的具塞离心管中分别加入10mL1%三氯乙酸溶液，2mL5%醋酸铅溶液，摇匀，超声20分钟，8000rpm离心10分钟，全部上清液转入活化好的混合型阳离子交换固相萃取柱（CleanertPCX，60mg/3mL），依次使用3mL水，3mL甲醇淋洗，抽干，弃去淋洗液。

最后用5mL5%的氨化甲醇洗脱（V/V），接收洗脱液，50℃氮气吹干，用1mL流动相定容，0.45μm滤膜过滤后进液相色谱检测。

另取空白鸡蛋样本1.00g，不添加三聚氰胺照上述方法处理，作为空白对照样品。

3实验结果：

3.1峰型与分离度

图片如下

由图1可见，用该方法处理，三聚氰胺峰型对称尖锐，且与杂质分离良好

3.2精密度

分别移取浓度为1.0mg/L、5.0mg/L的三聚氰胺标准溶液，分别连续进样6次，结果如表1所示。

表1保留时间与峰面积的稳定性数据

浓度mg/mL

指标

平均值

RSD%

1.0

保留时间（min）

18.830

18.829

18.838

18.840

18.834

18.833

0.026

峰面积

4.286

5.0

保留时间（min）

18.949

18.952

18.947

18.949

18.950

18.946

18.949

0.011

峰面积

423

440

438

439

437

438

436

1.461

由表1结果可见，本方法具有很好的精密度和重现性。

3.3标准校正曲线

表2标准校正曲线实验数据

浓度

mg/kg

峰面积

第1次进样

峰面积

第2次进样

峰面积

均值

1.0

5.0

423

440

431

10.0

832

844

838

15.0

1265

1299

1282

20.0

1689

1823

1756

根据以上数据计算线性方程为：

y=87.43x-13.67，R²=0.999，相关曲线见图2。

3.4添加回收率

表3添加浓度与回收率数据

添加浓度（mg/kg）

峰面积

计算含量

回收率（%）

1.0

19.9

1.158892

115.89

1.0

21.0

1.214532

121.45

2.0

41.7

2.261587

113.08

2.0

40.8

2.216062

110.80

10.0

188.8

9.702247

97.02

10.0

219.6

11.26018

112.60

由表3可见，本方法检测鸡蛋中三聚氰胺回收率较好。

4结论

通过上述实验可见，运用本方法测定鸡蛋中三聚氰胺，基质净化效果好，杂质干扰小，色谱峰型良好对称度高，操作简单方便，和准确度高等优点，非常适用于鸡蛋中三聚氰胺的检测。

[2010-9-1512:

53:

21Lasteditbypjs123]

仪器专场展示：

离子色谱色谱柱离子色谱柱

关键词：

固相萃取原理及应用萃取技术

2、环境检测应用

1）水中酚类检测（CleanertPEP,P/N:

PE0603）

1实验材料：

1.1SPE小柱：

CleanertPEP500mg/6mL

1.27种酚类：

苯酚，4-硝基酚，间甲酚，2-氯酚，2,4-二氯酚，2,4,6-三氯酚，五氯酚

2实验过程

2.1．样品前处理方法

1）活化：

依次用5mL甲基叔丁基醚（10:

90，V/V）、5mL甲醇活化富集柱、5mL去离子水活化CleanertPEP柱，5mL/min

2）上样：

1L的水样过柱，<5mL/min

3）淋洗：

10mL去离子水淋洗小柱，5mL/min，然后真空抽干20min

4）洗脱：

2mL甲醇/甲基叔丁基醚（10:

90，V/V）分两步洗脱，收集洗脱液至尖嘴瓶中

5）浓缩：

将收集的2mL洗脱液，氮气浓缩至1mL

2.2．色谱条件

色谱柱：

VenusilMPC18（4.6*150,5µm）

流动相：

A：

1%乙酸B：

1%乙酸甲醇检测器：

UV检测器

梯度洗脱程序：

时间

流动相比例

流速（mL/min）

检测波长（nm）

0-15min

B=50:

275

15-30min

B=15:

1.8

295

图片如下：

3．实验结果

七种酚在水中的添加回收率见表1.

表1.七种酚类在水中的添加回收率结果

加标

平均值

标准偏差

平均回收率（%）

苯酚

1.367

1.541

1.524

1.477

0.096

100.3

4-硝基酚

1.229

1.308

1.430

1.322

0.101

90.0

间甲酚

1.294

1.540

1.548

1.461

0.144

106.3

2-氯酚

0.527

0.684

0.641

0.617

0.081

100.6

2,4-二氯酚

1.305

1.613

1.621

1.513

0.180

92.8

2,4,6-三氯酚

1.365

1.609

1.511

1.495

0.123

90.3

五氯酚

1.259

1.487

1.472

1.406

0.128

95.6

2）水中的多环芳烃固相萃取方法（CleanertPEP,P/N:

PE0603）

1.材料

1.1目标物成分

萘，苊，苊烯，芴，菲，蒽，荧蒽，芘，屈，苯并（a）蒽，苯并（k）荧蒽，苯并（a,h）荧蒽，苯并（a）芘，苯并（g,h,i）芘，茚并（1,2,3-cd）芘

1.2．SPE柱：

CleanertPEP（60g/3mL）

2.样品处理：

1L水中加入20mL10%的硝酸

3.SPE方法

1）活化：

5mL异丙醇和5mL水分别依次活化PEP柱

2）上样：

把处理好的水样过PEP柱

3）淋洗：

用5mL淋洗液（300mL水+700mL甲醇+2.1gNa2HPO4+2.04gKH2PO4）淋洗

4）抽干：

抽真空干燥柱管30min

5）洗脱：

用4mL洗脱液（90mL异丙醇+10mL冰醋酸+200mL甲苯，加入到1L石油醚中），混合均匀洗脱，收集洗脱液

6）浓缩，定容

4.色谱条件：

色谱柱：

VenusilPAH专用柱（4.6×250mm，5μm，200Å）

样品：

溶于MeOH:

CH2Cl2（1:

1）16PAHs标品,用MeOH:

CH2Cl2（1:

1）稀释10倍

流速：

1.2mL/min

进样量：

10μL

柱温：

30℃

波长：

254nm

甲醇/水线性梯度洗脱，梯度表如下

T（min）

MeOH（%）

H2O（%）

图片如下：

3）水中硝基苯的固相萃取方法（CleanertPEP,P/N:

PE0603）

1．SPE柱：

CleanertPEP（500mg/6mL）

2．样品制备：

分析前应先调节水样pH值为中性，向每份水样中加人甲醇使甲醇浓度为0.5%。

混匀。

3．SPE方法：

3.1PEP柱活化：

将PEP柱置于固相萃取装置的针座圈上，用3mL正己烷预洗萃取柱，加人5mL甲醇，在甲醇完全流过萃取柱前加入10mL试剂水，使柱床处于湿润和活化状态。

3.2样品的富集：

根据水样浓度准确量取适量水样于分液漏斗中，开启固相萃取装置真空系统，使水样连续通过活化过的萃取柱保持流速不超过5mL/min进行萃取，在萃取过程中要始终保持柱床上至少有1cm高水样。

当所有样品都通过萃取柱后，用10mL超纯水冲洗分液漏斗内壁，继续真空抽吸20min。

3.3干燥柱预处理：

向带筛板的干燥管中加入5g处理过无水硫酸钠，使用前分别用10mL丙酮和正己烷,再以10mL丙酮洗以净化干燥柱

3.4萃取柱的洗脱：

保持管线的连接，在真空多管装置的萃取缸中放人试管架及接收管，在针座圈和萃取柱之间连接干燥柱用于脱水，用1mL丙酮过渡，弃去过柱液（该步骤不要吹干，让丙酮和柱内填料平衡2min），10mL正己烷/丙酮（90:

10，V/V）洗脱萃取柱，洗脱经过干燥柱（与PEP柱串联），收集流出液至接受管中，用氮吹仪在40℃下浓缩至1.0mL，进样分析（需要观察有无分层，水会引起分层，影响氮吹）。

3、药物分析中的应用

1）血浆中油酸及其代谢物LC-MS分析中的应用（CleanertPAX,P/N:

AX0603）

图片如下：

2．提取及净化方法：

见下图

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