经典生理生化试验.docx

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经典生理生化试验

实验十九DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质

N—末端和蛋白质的氨基酸组成分析

一、目的：

学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N—末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。

二、原理：

DNS—Cl在碱性环境里蛋白质和肽的α-氨基酸的氨基起反应，生成带有荧光的、稳定的DNS-氨基酸（参看图19-1，19-2），其反应如下：

蛋白质在水解前与DNS—Cl反应，产生DNS-蛋白质，它标记在N-末端氨基酸残基上，经水解和薄层层析而测知是何种氨基酸。

蛋白质水解后与DNS—Cl反应，标记的是蛋白质的氨基酸组成成分，如图19-1和图19-2所示。

这是一种较为简便的、适用的蛋白质的氨基酸组成成分分析的方法。

DNS-蛋白质水解产物中包括下列DNS-衍生物：

相当于N-末端的α-DNS-氨基酸，从链内赖氨酸及酪氨酸残基形成的ε-DNS-赖氨酸和O-DNS-酪氨酸，这些衍生物相当稳定。

此外，DNS—Cl还与溶液中的氨起反应生成DNS—NH2，DNS-磺酰胺以及DNS—Cl水解生成的DNS—OH（DNS-磺酸）。

此法与氟二硝基苯法相比，有二个突出的优点，即水解产物无需提取，可用电泳或层析法直接鉴定氨基酸；另外就是灵敏度高，DNS-氨基酸的最大荧光激发值约为550nm，由于其荧光十分强烈，1—5nmol·L-1或0.2—1.0nmol·L-1DNS-衍生物即可分别用电泳或薄层层析容易地检测。

DNS—Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物。

其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可与DNS—Cl生成双DNS-氨基酸衍生物。

这些氨基酸相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度达10—9—10—10摩尔水平。

比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的氟二硝基苯（FDNB）法高100倍。

DNS-蛋白质（或肽），在5.7mol·L-1HCl，110℃水解16—20h，DNS-蛋白质的肽键被打开。

由于DNS基团与氨基之间的键结合牢固，绝大部分DNS-氨基酸都抗水解。

除DNS-色氨酸全部被破坏；DNS-脯氨酸（77%），DNS-丝氨酸（35%），DNS-苏氨酸（30%），DNS-甘氨酸（18%），DNS-丙氨酸（7%）部分被破坏外，其余DNS-氨基酸很少破坏。

DNS—Cl与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基和酚反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏；DNS-ε-赖氨酸和DNS-O-酪氨酸较稳定，同时还有DNS-双-赖氨酸和DNS-双-酪氨酸生成，展层后在层析图谱的位点上，都与DNS-α-氨基酸有区别。

DNS—Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，即：

在DNS—Cl过量时，会产生DNS—NH2，即：

DNS—OH在紫外光下产生蓝色荧光，DNS—NH2的位点往往和丙氨酸重合，在本实验条件下，需进行第三相展层。

根据鉴定方法需要，DNS—Cl的浓度5mmol·L-1（约每ml2.0mg丙酮溶液），保存在棕色瓶中，置避光处防止分解。

样品浓度大约1mmol·L-1。

反应液要求丙酮浓度50%，pH8.5—9.8，以保证游离氨基等功能团非质子化。

在37℃保温，黄色消退即表示反应完全，一般约0.5h—1h。

反应完后，混合物中含有较多DNS—OH，最好除去副产物后再水解DNS-蛋白质或肽。

蒸干除去丙酮，加5.7mol·L-1HCl，抽真空，封管在110℃水解20

h，除去盐酸，加丙酮溶解点样展层，在紫外灯下鉴定荧光产物，同标准图谱比较，可区分未知DNS—氨基酸的种类。

根据氨基酸的种类和数量可提供被测蛋白质或肽样品的纯度、肽链的数量和N-末端氨基酸的性质等方面的有价值的资料。

聚酰胺薄层层析鉴定DNS—氨基酸。

展层后可鉴定所有的DNS—氨基酸。

聚酰胺是一类锦纶的化学纤维原料（或称尼龙）。

由己二酸与己二胺聚合而成的叫作锦纶66：

由己丙酰胺聚合而成的叫作锦纶6：

聚酰胺薄膜是将锦纶涂于涤纶片上制成，这类聚合物含有大量的酰胺基团，所以称为聚酰胺薄膜。

聚酰胺薄膜的酰胺基团可与被分离物质之间形成氢键，因此对极性物质有很强的吸附作用（图19-3）。

被分离物质与酰胺基团形成氢键能力的强弱，确定了吸附能力的差异。

在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键，选用适当的展层溶剂，使被分离的各种物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数有较大差异经过吸附与解吸的展层过程，形成一个分离顺序，彼此分开。

选择适当的溶剂系统在5×5cm大小的薄膜上双向层析，大部分氨基酸可有效地分开。

DNS-氨基酸的分离和鉴定：

1．溶剂系统

第Ⅰ相展层溶剂系统

（1）：

甲酸（88%）∶水=1.5∶100（V/V）

第Ⅱ相展层溶剂系统

（2）：

苯∶冰乙酸=9∶1（V/V）

第Ⅲ相展层溶剂系统（3）：

乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸=20∶1∶1（V/V）

第Ⅳ相展层溶剂系统（4）：

0.05mol·L-1磷酸三钠∶乙醇=3∶1（V/V）

2．混合标准DNS-氨基酸图谱

（1）DNS-氨基酸混合样品，经双向展层后大部分可得到分离（如图19-4），第Ⅰ相用溶剂

（1），第Ⅱ相用溶剂

（2）。

（2）DNS-天冬氨酸（Asp）和DNS-谷氨酸（Glu）；DNS-丝氨酸（ser）和DNS-苏氨酸（Thr）；DNS-精氨酸（Arg）和DNS-组氨酸（His）；DNS-α-赖氨酸（Lys）和DNS-ε-赖氨酸（Lys）可能分不开；DNS-丙氨酸（Ala）和DNS-NH2也可能重叠在一起。

为了分离这些DNS化的氨基酸，可用溶剂（3）在第Ⅱ相再展层一次（图19-5）。

（3）经过3次展层，有时，α组氨酸和精氨酸，α和ε赖氨酸分离还不完全，可用溶剂系统（4）在第Ⅱ相再展层一次（图19-6）。

3．猪胰岛素N-末端氨基酸残基图谱和氨基酸组成

（1）猪胰岛素N—末端分析（图19-7）。

猪胰岛素由2条肽链组成，因此，纯的猪胰岛素有2个N—末端氨基酸，即甘氨酸和苯丙氨酸。

还有两种非N—末端的氨基酸，即酪氨酸和赖氨酸。

在紫外灯下可见到DNS-

Gly和DNS-Phe，同时还可见到O-DNS-Tyr，ε-DNS-Lys。

（2）猪胰岛素氨基酸组成图谱（19-8）。

猪胰岛素氨基酸组成包括：

Gly，Phe，Leu，Ile，Pro，Val，Ala，Cys，Glu，Asp，Thr，Ser，His，Arg。

胰岛素氨基酸组成中，Asp和Asn，Glu和Gln是分辨不出来的，因为经过水解之后，氨基酸的酰胺化合物都转变成为相应的酸，Trp（Try）也完全被破坏，测不出来。

测N-末端时，如果丹磺酰化完全得到负结果，则很可能此样品的N-末端是Trp，因为

Trp的DNS-衍生物盐酸水解时全部被分解。

丹磺酰化后的肽或蛋白质用链霉蛋白酶水解，则能很容易地检测出Trp。

鉴定DNS-氨基酸，可用夹心型的聚酰胺薄板，即板的两面都涂有聚酰胺薄膜，板的一面点上待检样品；另一面点上标准样品。

展层后，利用板的透明性鉴定未知DNS-氨基酸。

一般情况下，如无这种薄板，则利用所得到的图与标准的图谱进行比较，有时还要计算相对迁移率，然后才鉴定氨基酸的种类。

DNS法鉴定肽和蛋白质的N-末端氨基酸或它们的氨基酸组成是比较方便，也比较灵敏的。

但由于聚酰胺薄膜的质量不能保证完全一样，或者展层溶剂系统产生一些细微变化，这时所得图谱与标准图谱也会有差异，这就需要进一步证实差异原因，重复实验。

酪氨酸DNS化时，一般产生3种DNS化产物，即α-DNS-Tyr的黄色荧光同一般的DNS氨基酸差不多，而O-DNS-Tyr和di-DNS-Tyr带有亮黄色荧光。

这3种产物展层后分离得比较开（图19-9）。

如果Tyr的DNS化产物和甘氨酸、苯丙氨基酸DNS化产物一起展层，是到如图19-10的结果。

三、器材及试剂：

1．器材：

紫外灯，恒温水浴，小型干燥器（或400ml平底烧杯），烧杯，电炉，真空泵，塑料膜，水解管，磨口小试管，毛细管，聚酰胺薄膜。

2．试剂：

①DNS—Cl丙酮溶液：

2—5mgDNS—Cl溶在1ml丙酮中，棕色瓶封口，暗处保存，数月稳定。

买的商品可能含有一些白色不溶物质（水解产物DNS

—OH），这种物质在试剂的保存期间也会慢慢产生。

如果水解程度很少，对实验不会有很大影响（不会有很大干扰）。

②0.2mol·L-1NaHCO3缓冲液（pH9.5）：

用Na2CO3和NaHCO3配制（Na2CO3∶NaHCO3=

3∶7）。

③5.7mol·L-1HCl：

用优级纯HCl配制。

④展层液：

第Ⅰ相展层溶剂系统

（1）：

甲酸（88%）∶水=1.5：

100（V/V）

第Ⅱ相展层溶剂系统

（2）：

苯∶冰乙酸=9∶1（V/V）

四、操作步骤：

1．丹磺酰化技术

（1）DNS—氨基酸制备：

用0.2mol·L-1NaHCO3缓冲液配成2mmol·L-1浓度的氨基酸溶液。

取0.1ml加入具塞玻璃试管中，同时加入0.1mlDNS—Cl丙酮溶液（2.5mg·ml-1），反应要求最终浓度为氨基酸1mmol·L-1，DNS—Cl5mmol·L-1，丙酮5%（pH8.5—9.8）。

用1mol·L-1NaOH调pH9—10，塞紧摇匀。

置37℃保温1h，反应完成后放暗处保存，备用。

（2）多肽和蛋白质N-末端DNS化氨基酸溶液的制备：

用0.2mol·L-1NaHCO3溶液配制2mmol/L多肽或蛋白质溶液。

取0.1ml此溶液加入水解管中，加入0.1mlDNS—Cl丙酮溶液（2.5mg·ml-1），用1mol·L-1NaOH调pH9—10，混匀后用parlfin封口，置37℃保温1h。

反应完成后，蒸干丙酮，加5.7mol·L-1HCl，抽真空封口，110℃保温16—20h，水解完成后，开管将溶液转移到5ml小烧杯内，蒸干盐酸，加几滴水再蒸干，反复数次使盐酸完全除净。

用丙酮溶解样品、点样展层，即可得到样品的N-末端DNS-氨基酸。

（3）多肽和蛋白质DNS化氨基酸组成的溶液的制备

●水解肽和蛋白质：

取0.1ml2mmol·L-1的多肽或蛋白质溶液，加入水解管中，再加优级纯盐酸，使盐酸浓度达到5.7mol·L-1，抽真空封口，置110℃水解16—20h（最好分别水解24,48,72h），水解完成后，开管转移到5ml烧杯内，置沸水浴中蒸去盐酸，干后加几滴蒸馏水，继续蒸干，反复数次除净盐酸。

●水解氨基酸DNS化：

加入0.1ml0.2mol·L-1NaHCO3和0.1mlDNS—Cl丙酮溶液，用1mol·L-1NaOH调pH9—10，转移到具塞磨口试管中，置37℃保温1h，到此，肽和蛋白质DNS化的氨基酸组成的样品制备完成，即可点样展层。

此法与二硝基化苯相比的优点是，水解后无需提取水解产物，可用于电泳或层析法直接鉴定氨基酸，且灵敏度高。

2．以聚酰胺薄层层析鉴定DNS-氨基酸

（1）选择聚酰胺薄膜：

聚酰胺薄膜有夹心式（即两面都涂有聚酰胺的板）和单面聚酰胺薄膜，单面的有4×4cm，7×7cm，5×15cm和7×11cm等几种规格。

本实验选用4×4cm或7×7cm均可，并要求质地均匀，与尼龙板贴附牢固，无剥脱现象。

（2）点样：

将粗细合适的毛细管用沙纸或砂轮将较齐的一头磨平，小心地将样品点在薄膜的右下角，距离边缘0.5cm的地方。

样品点要求圆、小，不能把膜触破，最好一次点样成功，即在一处只点一下，因此样品的浓度要合适，如果浓度不够，则需重复在一处多次点样，即在第一次点样后，用吹风机吹干再点第二次、第三次等，在膜上标记。

展层第一相样品在右下角，展层后彻底吹干，将膜顺时针转90°，即样品原点转到左下角展层第二相。

（3）展层

●点样后在小的干燥器里进行展层，首先要在干燥器盖的边缘涂一薄层凡士林，使之密闭不漏气，放入培养皿并调水平。

●向培养皿里加入展层剂，溶剂高度不超过3cm，盖上干燥器盖，使溶剂蒸汽在干燥器内达到饱和。

●用皮筋或线将点好样的薄膜捆成半圆筒型，并能垂直放稳，皮筋不接触膜，膜在板的内面，即光面在外与皮筋接触。

打开干燥器盖，将捆好的薄膜垂直放入盛有展层剂的培养皿里，立即盖好盖，溶剂即向上展层，当溶剂上升到离膜顶端0.5cm处时，停止展层，立即开盖标记前沿，取出，彻底吹干后顺时针旋转90°，以同样方法进行第Ⅱ相展层（用第

（2）溶剂系统或根据需要可在溶剂系统（3）中展层）。

五、结果讨论：

绘制出层析图谱，并分析说明该蛋白质样品是由几条链组成？

其末端—氨基酸是什么？

其氨基酸组成如何？

六、注意事项：

1．制备的条件

在DNS-氨基酸制备时，DNS化必须在碱性条件下（pH9.7—10.5）进行，否则会有很多副产物DNS—NH2或DNS—OH产生。

测蛋白质或肽的N-末端氨基酸时，可用透析或SephadexG-25，G-15，G-10层析，除去DNS-OH和DNS-NH2及小分子物质再水解。

2．封管水解的几个问题

（1）DNS化后，加5.7mol·L-1HCl水解，一定要抽真空封管。

否则110℃水解时易氧化破坏氨基酸。

（2）水解后一定要把HCl彻底除净。

3．点样展层

（1）点样：

样品的点要小、圆、量要适当，否则拖尾，因此毛细管要细，头要平，样品浓度要合适，聚酰胺薄膜要选择优质的。

（2）展层要在小的、密闭的、底部水平的容器里进行，每次展层的温度、时间、展层剂的浓度要保持一致，否则不易重复。

4．鉴定未知样品的N-末端氨基酸

（1）内标法确定未知样品N-末端氨基酸：

在一块薄膜上点未知的DNS-氨基酸，第二块膜上点已知标准DNS-氨基酸，第三块膜上将未知的和已知的同时点在一点上，展层后观察，如果在第三块膜的荧光加强并重合，表明此未知氨基酸同已知标准DNS-氨基酸一样，否则为不同的氨基酸。

（2）采用夹心型的聚酰胺薄膜，其膜的两面都涂有聚酰胺，可在一侧面点上待测的DNS-氨基酸；另一侧面点上对照的标准DNS-氨基酸。

层析后可利用板的透明性质，比较、鉴定未知的DNS—氨基酸。

思考题

1．DNS化测定N-末端的根据是什么？

DNS化的最适pH值是多少？

采用什么缓冲体系？

2．DNS化的副产物是什么？

如何除去？

3．DNS—Cl除能与α-氨基反应外，还能与氨基酸的什么基团发生反应，生成什么产物？

4．未知样品（蛋白质或肽）的N-末端氨基酸如何确定？

实验二十聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦

电泳测定蛋白质等电点

一、目的：

学习聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理及方法。

二、原理：

等电点聚焦（isoelectricfocusing,IEF）或简称电聚焦（electrofocusing），也曾称等电点分离聚焦电泳等。

它是60年代中期出现的技术，克服了一般电泳易扩散的缺点。

近年来，等电点聚焦电泳又有了新的进展，可以分辨等电点只差0.001pH单位的生物分子。

由于它的分辨力高、重复性好、样品容量大、操作简便、迅速，在生物化学、分类学、分子生物学及临床医学研究等诸方面，都得到广泛应用。

等电点聚焦电泳产生pH梯度的方法有两种：

一是用两种不同的pH缓冲液相互扩散，在混合区形成pH梯度，此为人工pH梯度。

这种pH梯度不稳定，常用于制备电泳；另一种是利用载体两性电解质在电场作用下形成自然pH梯度。

本实验就是利用载体两性电解质形成的自然pH梯度进行蛋白质样品等电焦聚电泳的。

理想的载体两性电解质应该在其本身的等电点处有足够的缓冲能力和良好的导电性，且分子量要小，组成与被分析样品有所区别，对分析样品无变性作用或发生化学反应。

常用的载体两性电解质是一系列脂肪族多氨基和多羧基类的混合物，即是一系列的异构物和同系物，分子量在300—1000之间，各组分的等电点（pI）既有差异又相接近，pI的范围在2.5—11之间。

合成载体两性电解质的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反应如下：

R1和R2为氢或带有氨基的脂肪基。

这一反应的特点是生成众多的异构物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。

混合物中各成分的含量、等电点的分布，取决于原材料的性质、比例和合成条件。

目前常用的载体两性电解质的商品有：

Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Pharmacia公司）、Serralyty（Serva公司），近来已有国产商品了。

不同厂家合成的方法不同，电泳的条件也略有不同。

目前，载体两性电解质商品在使用时还存在一些问题，如样品中的盐浓度对pH梯度有影响等，但毕竟优点很多，仍然得到广泛应用。

分析载体两性电解质的结构可知，它既有酸性基团（—NH

），也有碱性基团（—COO—），既可接受分子，也可释放质子：

它们在酸性条件下带正电荷，在碱性条件下带负电荷。

当它们所带的正负电荷相等时，其净电荷为零，呈电中性，此时溶液的pH值为该两性电解质的等电点，以pI表示。

所以两性电解质的等电点在数值上等于它呈电中性时溶液的pH值。

等电点是反映两性电解质在溶液中得失质子的能力，是它的物化性质。

两性电解质在溶液中的行为可以从两方面看，一方面溶液的pH决定它带电荷的性质。

如溶液是pH7，对pI=9的两性电解质来说，是处于酸性环境，故带正电荷；但对pI=3的两性电解质来说，却是处于碱性环境，故而带负电荷。

所以，不同pI的两性电解质，在同一环境中带有不同性质和数量的电荷；另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡：

使溶液pH有所改变。

当某一两性电解质pI较低，即释放质子（H+）能力较强，使溶液pH值下降，这类两性电解质称为酸性两性电解质；反之，pI高的可使溶液pH值上升，称为碱性两性电解质。

所以，在溶液中的两性电解质一方面受溶液pH值的影响，决定其带电的性质；另一方面，它又影响周围环境（水溶液），使其pH值有所改变。

载体两性电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI其分布在2.5—10之间。

在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。

电泳时凝胶板正极的电极液是磷酸，负极是氢氧化钠。

正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但由于pI的不同，其所带正电荷数量就有所差异电泳时负极泳动的速度也就因此不同。

同理，负极是碱性环境，载体两性电解质带有数量不等的负电荷，以不同速度向正极泳动。

根据两性电解质的特性，在泳动过程中又不断地与溶液交换质子，改变了溶液的pH。

当达到平衡时，即得失质子相等，不再出现质子的交换时，载体两性电解质到达等电点并各处于自己的

pI区域，pI即是指溶液的pH值，所以，溶液也因此呈现不同的pH，随载体两性电解质的pI梯度而形成pH梯度。

由于凝胶的防对流扩散作用，使pH梯度保持稳定不变（参看图20-1）。

实验操作中，要求开始电泳时恒压60V，15min，目的在于使小分子的，泳动快的载体两性电解质可在短时间内形成一个粗略的pH梯度。

此后，恒流为8mA，是为了避免电泳开始时介质中带电颗粒较多，电泳电流过高而破坏凝胶。

当各种蛋白质逐渐泳动到各自等电点位置时，带电颗粒逐渐减少，出现电阻增大，电压随之增高现象。

当电压升到550V时，带电颗粒已大为减少，电流不再偏高，故恒压到580V，继续电泳120min后，蛋白质颗粒慢慢地集中到它等电点位置。

电流接近于零时，蛋白质颗粒不再泳动，电泳也到此结束。

蛋白质样品也因其等电点的差异而得到集中和彼此分开（参看图20-2）。

最早的等电聚焦电泳是垂直板式，后来发展为水平板式。

超薄层水平板式也是近几年发展起来的，这种形式的电泳的优点是节省两性电解质试剂、加样数量多、利于比较不同样品的电泳结果，而且电泳后的固定、染色和干燥都很方便、迅速。

水平板式等电聚焦电泳的最大优点是防止了由于电极液的电渗作用而引起pH梯度的漂变。

三、器材及试剂：

1．器材：

稳流稳压电源，水冷式平板等电聚焦电泳电槽，玻璃板（11.5×11.5×0.2cm），大铁文具夹，塑料模具（厚0.5mm，中间开孔9.0×9.0cm），小眼科剪子，镊子，解剖刀，1ml注射器，50μl和100μl微量注射器，擦镜纸，滤纸，精密pH试纸，凝血板，培养皿（120mm），脱脂棉，棕色试剂瓶，吸液管，吸耳球，玻璃纸，坐标纸。

2．试剂：

重蒸水，丙烯酰胺（重结晶），甲叉双丙烯酰胺（重结晶），过硫酸铵，TEMED（四甲基乙二胺），载体两性电解质（pH3.5—10），考马氏亮蓝R250，液体石腊，乙醇（95%），硅油，磺基水杨酸，三氯乙酸，甲醇，乙酸（36%），已知pI蛋白质样品和标准等电聚焦样品（市售），磷酸，氢氧化钠。

3．溶液配制：

（1）单体贮液：

丙烯酰胺2.91g，甲叉双丙烯酰胺0.9g，重蒸水溶解，定容到100ml，过滤备用（在棕色瓶中4℃可保存两周）。

（2）电极液：

阳极1mol·L-1磷酸（H3PO4）：

原磷酸试剂的浓度约为16mol·L-1，故配制时用重蒸水稀释16倍即可。

阴极1mol·L-1氢氧化钠（NaOH）：

称取4g固体溶于100ml重蒸水中。

（3）固定液：

甲醇35ml，三氯乙酸10g，磺基水杨酸3.5g加水定容到100ml。

（4）染色液：

乙醇35ml，冰乙酸10ml，考马氏亮蓝R2500.1g加水定容到100ml，溶解后过滤备用。

（5）脱色液：

乙醇25ml，冰乙酸10ml，加水定容到100ml。

（6）保存液：

甘油1—5ml，乙醇25ml，冰乙酸10ml，加水定容到100ml。

（7）样品：

牛血清蛋白1mg·ml-1，糜蛋白酶元A1mg·ml-1，肌红蛋白1mg·ml-1，卵清蛋白1mg·ml-1，标准等电聚焦样品。

（8）大鼠肌肉提取液：

1g鼠肌肉，加水5ml，匀浆提取，离心取上清液透析备用。

（9）10%过硫酸铵：

称1g溶在10ml重蒸水中（纯过硫酸铵溶解时会有响声）。

四、操作步骤：

1．凝胶配制

单体贮液2.0ml，重蒸水5.3ml，载体两性电解质0.6ml，真空抽气15min后加TEMED（原液）8μl和10%过硫酸铵60μl，混匀立即灌胶。

2．灌胶

（1）准备

●取3mm洗净晾干的玻璃板，涂上一层薄薄的防水硅油，以重蒸水冲洗，使硅油分布均匀。

●平板电泳槽调水平，电泳槽上放上一张滤纸。

●滤纸上放一厚2mm的玻璃板，玻璃板上面放上塑料模具（参看图20-3（a））。

●用文具夹将模具和玻璃板固定在平板电泳槽上。

●在模板上面，文具夹的另一端再放上涂有硅油的玻璃板。

（2）灌胶：

小心、迅速地将混匀的胶灌到模具的框内。

灌胶时胶液沿着上面有硅油的玻璃板的一端即文具夹的另一端，向文具夹方向推进，边灌胶边推上面的玻璃板，使模具框内充满胶液，框内不能有气泡，为赶走气泡可移动玻璃板，待气泡释放后再向前进，一直推到接触文具夹，使两块玻璃把胶封在框内，模具框内充满胶液，切不可有气泡，否则要重新制胶和灌胶（参看图20-3（b））。

在正式灌胶之前调水平之后，以8ml水代替胶液练习灌胶，直到不产生气泡为止。

操作熟练后，洗净玻璃板、模具、晾干备用。

抽气后再加TEMED和过硫酸铵，混匀后迅速灌胶。

过硫酸铵溶液要新鲜，必须当天配制。

（3）去掉上面的玻璃板和模具：

灌胶后室温静止1h，在模具和胶的边缘可观察到折光，这是胶已凝固的特征。

再老化0.5h，然后小心将两块玻璃打开，凝胶和模具会自然地贴附在其中一块玻璃板上，去掉上面的模具及凝胶板周围的和渗出边缘的残胶，即可作加样准备。

3．加样、电泳

（1）加样前准备

●在电泳槽上涂一层液体石腊，再铺一张方格坐标纸（点样时作定位用）。

用一塑料片刮去电泳槽与坐标纸之间的气泡，并使坐标纸浸透石腊。

●将带胶的玻璃板放至涂有石腊的坐标纸上面，赶走气泡。

●接通冷凝水，再调一次水平。

●铺电极条：

将1cm宽、9cm长的3层滤纸条浸透电极液（阳极用磷酸1mol·L-1，

阴极用氢氧化钠1mol·L-1）后，放在另一张滤纸上吸干面上的电极液，用镊子将电极条铺在凝胶两端，