荧光定量pcr的实验技巧.docx
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荧光定量pcr的实验技巧
荧光定量pcr的实验技巧
荧光定量PCR问题疑难解答
（一）
两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。
但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。
2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。
A：
曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。
1.PCR反应效率差：
引物，试剂PCR条件的原因。
做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。
可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。
2.PCR中混入影响反应的物质：
模板提取方法需要改进
3.样品稀释不准确：
这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。
Q：
荧光定量PCR的灵敏度
A：
对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。
Q：
标准曲线要重复两三次吗?
A：
没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。
Q：
关于荧光定量标准曲线的制作
A：
一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了，这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你做出来，认可度也不会太高。
Q：
溶解曲线高矮
A：
Tm值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同，同样的扩增产物也会出现Tm值有微小差异，一般差异在1度以内都可以接受。
融解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。
Q：
定量PCR没有扩增
A：
把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，说明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。
虽然你在普通PCR仪上优化过条件，但换了定量PCR仪，由于两台仪器的升降温速度及温度精密度等指标存在差异，同样的条件做不出PCR也是可能的。
由于很多因素的影响，扩增子的溶解温度会有一定变异。
溶解温度会受特殊缓冲液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl2浓度和其他因素的影响。
要做溶解曲线的对比你首先要确保所用的条件相同。
Q：
SG的稳定性如何？
A：
只要不进行稀释，SG是非常稳定的。
一旦稀释，可以保存1周到3个月，这取决于冻融次数，推荐配置成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。
为优化SG反应，有必要在所有的常规步骤来确定，优化扩增反应的条件（合适的MgCl2、dNTP和Taq酶浓度等）。
结果应该在凝胶电泳上有唯一的条带。
SG分析的优化主要包括以下4个因素：
a）SG浓度b）引物浓度c）MgCl2浓度d）温度和反应次数
推荐的SG终浓度变动范围是1：
5000到1：
100000。
经常用到的浓度范围是1：
10000到1：
70000。
引物浓度的优化应该测试不同浓度的正向和反向引物。
引物浓度的范围应该是50nM到300nM，然而，也有例外的情况。
Q：
荧光定量污染解决办法
A：
几个月前我也有跟你一样的遭遇，当时跳楼的心都有。
后来美国来人给培训，按照他们的要求，污染果真就给控制了，两个月来一直还很好。
以下的经验希望对你有用。
1.配反应体系和加模板要在不同的屋子进行；
2.配体系的屋子准备一件干净的白大衣，每次进去都要记得换白大衣，至少要把别的屋子穿的白大衣脱掉；
3.分装好体系以后把反应板/条放在一个有盖的干净的托盘中端到加样的房间；
4.配体系戴的手套可以带到加样的房间，反过来不可；
5.PCR完毕后，反应产物拿到别的屋子扔掉；
6.最重要的就是不要把DNA带到配体系的屋子，以上几点也都是为了这一目的。
Q：
荧光定量real-timePCR重复性问题
A：
建议不要只加1ul，而是稀释10倍左右然后加10ul，这样有助于改善重复性。
如果你测的是拷贝数，重复性不好是很难避免的。
我感觉用SYBRgreen作realtime的误差还是比较大的，它的优势在于灵敏度高，但如果想精确定量，还是比较困难的，只好重复很多次，或者多花钱买标记的引物，那个特异性最好。
Q：
各位高手，今天第一次做完8个基因的相对荧光定量（ddct法），扩增时忘了做融解曲线了，现在是不是没法再做融解曲线了？
（ABI7500）对于每个基因都作了NTC对照，结果显示NTC无扩增，这样能否说明引物设计得还可以，没有引物二聚体的产生？
至于是否有非特异性产物，就必须得做融解曲线了？
请帮忙指教一下啊
A：
把你的定量PCR产物重新作融解曲线，只是新建立一个反应，反应条件按照融解曲线的条件设定就可以了，没必要重新作定量。
Ct值25-29，融解曲线单峰；ntc无CT值，融解曲线无峰，就不用电泳了，可以肯定。
模板量增加10倍，Ct值减小3.32Cycles。
Q：
荧光阈值高，怎么改进？
A：
阈值取决于基线，基线是3~13cycles左右的荧光信号值标准偏差10倍，可能是背景高，把模板纯化一下看看。
要调整一下你的基线的起止循环数。
一般开始的循环为2或3，中止循环为一次试验最早起峰的Ct-3，即如果一条曲线在第13个循环就已经起峰了，那么基线的中止循环可以设置为13-3=10。
如果你的体系不存在问题，就可能是你的那次试验模板浓度较高，起峰早，导致的阈值线过高。
Q：
荧光定量PCR检测灵敏度和线性范围的关系
A：
一般大家认为的检测灵敏度即检测下限，可以理解为能检测到和准确定量的最低浓度（拷贝数），而线性范围为能够检测的区间，即可以检测及分辨的最低浓度到最高浓度的数量级。
但两者都与荧光定量PCR仪器及试剂体系相关。
Q：
realtimePCRCT值一般在多少后认为模板没扩增？
A：
当进入对数期的循环数大于35个时，RealTimeRT-PCR检测无效，基因没有表达；当进入对数的循环数在32-35个循环时，需要有至少3个重复才能判断是否能检测到基因的表达。
Q：
正常情况NTC是不应该出现CT值的吗？
A：
如果是探针法，应该没有Ct值，所谓的没有，也是针对不同算法而言的。
NTC一般没有明显的指数扩增，所以一般软件不计算Ct。
如果是染料法，可能在30个循环后有微弱起峰，并且软件计算出Ct值，这时还要观察溶解曲线，看扩增产物是否是引物二聚体。
大多情况是二聚体，这时也可以优化条件，比如提高退火温度等。
如果是探针法，阴性对照起峰肯定是污染，如果是染料法，还要看溶解曲线：
如果溶解曲线的Tm值在80度以下，那么很可能是引物二聚体；如果溶解曲线是双峰或更多峰，其中有与加模板后的扩增产物的Tm值相同的峰，那么就意味着存在污染。
Q：
realtimePCR无结果，而用产物跑电泳条带很清楚，什么问题？
A：
我也出现过此情况，后来发现是因为加样的时间太长了，荧光染料暴露时间太长了，荧光基团淬灭了，出现上述问题还有一种情况，那就是荧光PCR仪的荧光采取信号值太低，有时也不稳定。
如果你使用探针法，有荧光信号而没有求出Ct值，那么可能你的探针浓度有问题，可能太高或者太低了，可能改变探针浓度看看。
Q：
最佳荧光采集温度
A：
采集荧光的时机不是决定于温度，而是决定于采用的方法。
如果采用染料法，一般要在延伸阶段的末点进行检测，而72度延伸的效率最高，所以采用染料法时大多在72度检测。
如果扩增产物中存在引物二聚体，也有采用更高的读板温度，比如76度、80度等，这时的读板温度与引物二聚体的Tm值相关。
如果采用TaqMan探针法，由于TaqMan探针是累积荧光，理论上说在任何步骤检测都可以，但目前TaqMan大多采用两步法，所以在退火的末点进行检测即可。
如果采用分子信标的方法，就要在退火的末点进行检测。
如果采用FRET探针法，要在退火时进行荧光检测。
Q：
标准曲线的讨论
A：
有一点可以告诉你：
样品浓度太高，beta-actin都是很高的，要漂亮就稀释1000倍后再做。
浓度高，很容易导致污染。
而且第一二个梯度没有分开啊。
标准曲线的落点局限在15个循环以前，那样你得到的反应有效线性范围太窄，就是说要很高浓度的样品才适用你这标准曲线。
Q：
定量PCR中，质粒作为标准分子为何要线性化
A：
因为你要检测的目的基因如果不出意外的话，应该是线性的吧，而你用来定标准曲线的目的基因确是连接在环状的质粒上的。
我想单从变性和复性的难易上就会有很大的区别，当然会对引物的结合等各方面造成影响，何况环状的空间构象和线性的空间构象上的差异了。
做标准曲线时的基本原则之一就是要尽量的模仿需要定量的基因所在的自然条件，所以说，如果做标准曲线时你可以有条件做到用和你要检测的基因一样的标准品做标准曲线的话，就不要选择把一段基因克隆到质粒上。
但是一般情况下是很难做到的。
楼上说的没有酶切效果还行，那只是还行。
荧光定量本来就是很容易受到很多因素影响的实验，当然是要求严点好了，当然如果你检测的基因本身就是环状的，那当然不用线性化了，那样反而不好了！
线性化比较麻烦：
首先要酶切，保证完全酶切，才能全部线性化。
然后要回收，质粒酶切后再回收容易被破坏，而且回收率也不是很高。
第三，线性化的质粒不容易保存，相对于环状质粒来说。
所以，如果有实验证据证明不线性化的质粒可以用，那就可以省去很多事情了。
Fig.6alsoshowstheefficiencyofthePCRreactionisnotalteredbyusingcircularplasmidDNAinplaceoflinearisedplasmidDNA.线形化与环状质粒比较文章
评论：
这篇文章用这个质粒对线性化和非线性化做了比较，从实验结果看线性化并没有对标准曲线产生任何改变。
但是这篇文章只是摆出了试验结果，并没有从原理上分析这个实验结果的原因，因此线性化对于标准曲线的作用并不能以这篇文章的结果来外推。
就是说可能需要更多的实验结果，或者从原理上分析了这篇文章的结果，才能得出结论来说明，线性化确实对于所有,或大部分的质粒标准分子是不必要的。
荧光定量PCR问题疑难解答
（二）
Q：
realtimepcr不同基因之间的阈值（threshold）是不是要一样啊?
A：
如果做标准曲线或者相对定量，建议阈值还是一样比较好。
而且阈值一般要放置于扩增曲线的指数段，即荧光数据对数坐标轴下的线性段。
如果扩增曲线的效率接近，阈值线的位置对于定量结果的影响是微乎其微的。
Q：
扩增曲线本底不断升高是什么原因?
A：
我近期也遇到过这种现象，现在基本解决了，原因可能如下：
1、试剂质量差是主要原因，我用ABI的SYBR试剂做了一年从来没有遇到过类似问题，而近期换成东洋纺的试剂就出现了这个问题，所以最好不要贪便宜用小鬼子的试剂！
2、模板不纯是一个重要原因，我用东洋纺的试剂出现问题后，用ddH2O稀释10倍以上（一定不要用TE稀释，要不然可能会更差），问题基本解决；
3、如果模板稀释后基线还有一定的上升，结果分析时可以将基线从6以上设，避开初始的几个上升厉害的循环；
建议：
要根本解决此问题请用质量可靠的试剂，便宜没好货！
Q：
分子信标做的阴性对照，曲线为一条斜线，什么原因？
A：
和我以前做得没消除背景的曲线挺相像。
很可能是试剂的问题，我用东洋纺的试剂也得到过类似的曲线，换了试剂就好了！
探针设计的问题！
还有反应液体试剂酶离子调整。
Q：
标准曲线检测限
A：
这是由于ABI仪器采用半导体加热，其边缘效应致使96孔加热模块的中央温度高，周边温度低。
由于定量原理是通过已知浓度的标准品和未知样本之间的比较来进行的，所以各孔位的反应参数可比性决定了定量的准确性。
在模板浓度低的时候ABI的仪器各孔位热循环不均导致的误差经过多个循环后被放大，最终影响定量结果的准确性。
所以ABI仪器只能区分5000个拷贝和10000个拷贝的差异，而且必须用ABI的原装试剂才能达到此效果，如果将模板再稀释，就无法区分这2倍浓度差异了。
你加入起始模板数分别是1000、100、10copy/ul的反应孔，模板浓度太低了，ABI7000仪器不能检测出来，建议用高浓度模板来做标准曲线。
虽然现在的定量PCR仪好多都宣称能做到单拷贝检测，但这个前提是非常苛刻的。
需要模板、引物、体系、实验条件设置一切都是最优的情况下才可能做出来，而且一般还有比例。
像一般低拷贝检测Ct值不准确的情况还是很正常的，不需要郁闷的说，大家都是这样。
一般临床检测的下限不会低于100拷贝，所以你要考虑是不是真的要做低拷贝的检测，另外，当Ct值大于30的时候结果就存在很大的不可信性，要反复确认，而低拷贝的Ct值一般都会大于30。
Q：
溶解曲线3个峰
A：
如果出现引物二聚体，可以从实验条件和体系上加以优化，比如提高退火温度，降低引物浓度等。
但如果非特异性的峰离目标产物的峰较近的话，那就需要重新设计引物了，从引物的设计上多做些考虑。
可以先优化条件，如果没有用的话就试试改变引物。
引物二聚体的几个特征是溶解曲线的峰不明显，即峰不尖且不高，另外是溶解温度基本上低于80度。
如果不符合上面的两个条件，基本上就是体系污染了。
可以跑个电泳看看。
样本出现双峰，也可以按照上面的判断看看是否有引物二聚体还是非特异性扩增产物。
可以提高2度退火温度试试看，延长退火时间对于消除引物二聚体的作用不大。
基本上采用染料法的确容易出现引物二聚体，尤其是30个循环之后。
如果提高退火温度后空白对照还是起峰，但Ct值在35之后，那就不要管他了，正常。
Q：
A：
你的实验结果其实很好，是初始模板浓度设置错了。
1.以2倍梯度稀释的模板，Ct值的差异为1的时候扩增效率为100%，从标准曲线上来看，你的6个模板Ct差异（标准曲线横轴）还都在1以上一点，已经很好；
2.你的模板是以2倍梯度稀释的，这样初始模板拷贝数的对数值每个浓度相差应该在0.3左右，从图中看，标准曲线的纵轴每个梯度相差在0.7左右，似乎你设置时初始模板的拷贝数是
按照5倍梯度设置的。
你可以把Ct值取出来，根据初始模板自己做一个标准曲线看看，估计扩增效率可以达到90%以上。
2倍梯度区分的很好！
Q：
只要Ct值大于30都是阴性吗？
一开始不用设定吗？
A：
看你做什么检测了，还要与对照品比对才能定性分析。
不过，一般Ct值大于30结果置信度降低，需要多次确认。
常规修饰基团分子量5’-Biotin405.453’-TAMARA623.60
5’-（6FAM）537.463’-Dabsyl498.49
5’-HEX744.133’-（6FAM）569.46
5’-TET675.243’-AminoModifierC3153.07
5’-Cy5533.633’-AminoModifierC7209.18
5’-Cy3507.593’-ThiolModifierC3154.12
荧光定量PCR问题疑难解答（三）
Q：
溶解曲线出现三个峰，以为是引物合成问题，重新合成三次引物，溶解曲线仍为三个峰。
产物经电泳证实却为一条带，为什么会出现这种结果？
A：
我也曾经出现过这个问题，但是我是出现两个峰，后来跑电泳证实是引物二聚体，<100bp的地方隐约出现一个引物二聚体的条带，你跑电泳没有其他条带可能是电泳的灵敏度不够吧，还有引物产生二聚体也不一定只产生一种结构的二聚体啊，可能会产生其他结构的二聚体啊，建议你可以继续设计引物再试试，或者提高退火温度看看！
你的单一条带是不是很宽啊？
照图上看来你的非特异性的产物和你的目的产物差不多大。
非特异性扩增的条带的Tm值和你的产物的还是有点接近。
而且不一定是跑胶都能看到非特异性扩增的。
我以前做完后跑胶都没有目的条带，但是扩增曲线还是不错，但是荧光值都比较低。
实时定量还是很敏感的。
建议提高温度，如果没有目的条带，就试着调一下镁离子浓度。
Q：
最近作Real-timePCR有几个问题请教：
1.产物可以进行电泳检测吗？
2.为什么阴性产物进行二次扩增也有较强的荧光信号（据Ct值可判为阳性）？
且电泳似乎也有较亮的条带，无法与阳性产物区别。
3.在Ct值无法判断阴性或阳性的情况下（接近或略高于判定阴性值时，有扩增曲线，但Ct值较大如37、38）如何下结论？
A：
1.荧光定量的结果可以进行电泳检测。
2.如果阴性有扩增，说明PCR体系被污染了，PCR污染是很可怕的，而且很难消除。
3.结论根据原来定的标准下，比如原来设定ct>35为阴性，那当ct为36时就不要特意调整标准。
确定其为阴性就可以了。
4.阳性产物做模板ct较低，其原因是模板浓度较高，模板浓度的对数和ct成反比。
所以，模板浓度越高，ct越低。
A：
1.产物是可以用来电泳的，不过由于定量PCR借助于荧光的作用灵敏度较高，电泳产物则一般条带不会很亮；
2.产物的二次扩增在定量PCR中一般是不建议做的，原因很简单，片段太短了，还是那个问题，定量PCR是高灵敏度的，再二次扩增很难排除二聚体、PCR污染、操作误差等等因素，特别是污染，我们能排除的往往都只是你想到的，还有很多是一时想不到的；
3.如果你是用标准的检测试剂盒，你只需要按说明书来就操作就可以，判断结果同样，如果你还想探究其中的阴性可能漏检的问题，你应该用其他方法，而不能用这个试剂盒了。
Q：
通过前辈的介绍了解到：
正常的ct值范围在18~30之间，ct值应是荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。
如果正常情况下大于30应可以定为阴性。
因为最近我也在用SYBRGreen做实时定量PCR，所以也想向各位前辈请教一下有关Ct值的问题。
我的结果中待测基因的Ct值大多在18~25之间，但唯独内参照的Ct值很低。
第一次做时基本都在10左右，将模板稀释10倍后第二次的内参照的Ct值还是在12~14之间。
以这样的数据分析会影响结果的准确度吗？
或者还是将模板继续稀释，直到ct值都达到18~30之间呢。
A：
没必要吧。
一般ct超过30是不好，但要是三个重复都这样，也还是可以用的啊，每次都做阴性对照阴性对照ct为0，那ct30就肯定不是污染，而是基因表达量低或是模板太稀，内参ct为10~14都正常啊，没必要再稀释模板了，那样你的目的基因ct又要超过30了，不过内参ct太低，低于10也是不太好，结果可能会有偏差。
Q：
real-timepcr结果可用来发文章的要求有哪些？
A：
不用，但是在文章必须说明用电泳还是用溶解曲线检测过。
论文中把你的实验方法说明白就可以了。
简单的一个表示图，就可以发表了。
不过REAL-TIMEPCR想用的话最好放溶解曲线图，一般外文杂志喜欢接受。
Q：
不知道为什么这两天做荧光老不顺，荧光Ct在20以下产物检测很亮，而普通用mix酶跑PCR条带却很淡，难道是荧光定量的酶比较好的原因吗？
另外我的NTC荧光在30多个循环的时候都有起峰，我用重开的一管新酶和新稀释的引物以及新水做，还是有起峰，实在是搞不懂了。
求大家帮帮忙吧！
A：
1.一些公司荧光定量试剂盒的酶是比普通Tag酶要好，主要是可以防止引物二聚体产生，引物二聚体少了，扩增效率自然高了。
2.也可能是你荧光定量的体系比你普通的PCR体系要优化，比如有些公司荧光定量mix中的Mg离子浓度要高于普通的PCR体系。
3.可能是跑胶的问题。
看看你的MARKER还和以前一样亮吗？
做荧光定量的短片段特别容易污染。
可能是你的枪被污染了吧，是用的跑电泳的那把枪吗？
如果在35个循环后起峰，污染不算严重。
可以把荧光定量PCR的基线调节到恰好高过阴性对照。
Q：
请问下现在的PCR荧光诊断试剂盒里面，国家规定都要求要有临界阳对照吗？
这些对照品是不是一定要和样本一起提取呢？
还有临界阳用阳性对照来稀释来得到可以吗？
不知道要怎么稀释比较好呢？
A：
阳性对照和阴性对照必须要和样品一起提取，进行平行实验，这样才有作为对照的意义。
临界阳性样品是不能通过阳性对照稀释的，除非你知道临界阳性的浓度，经过定量标定将阳性对照稀释到临界阳性。
Q：
本人检测的目的基因共有5个处理，每个处理做两次重复，现在的问题每个处理内重复性非常差，有的Ct值差异达到了10，不知道是怎么回事？
A：
换了一个退火温度把所有的设计好的引物都拿来重新试了一下，现在有一对引物两个温度都还好。
基本上能够达到要求了。
另外，我使用的是BIO-RAD的仪器，感觉边上跟中间温度差异挺大的，因为之前这对引物我也曾经试过的，但是放在边上一个，结果差异很大。
经验教训啊！
Q：
荧光量开始很高 A：
根据TAKARA的资料说，这是因为摸板浓度过大了，把它再稀释，然后再做看看。
是模板浓度过大引起的，可以看到曲线图中最高浓度的样品的Ct值很小。
但是这张图也能用的，你调整一下基线范围，把背景荧光压下去，这样以来图就漂亮了就能分析了。
Q：
刚做了一次realtimePCR，结果解离曲线中出现了负值
A：
这个曲线反应的是随着温度的变化荧光值的变化速率。
值越高，则此时PCR产物荧光值变化越快，也就是说PCR产物变性速度最快。
当温度达到Tm值时，PCR产物迅速变性，荧光值急剧下降，表现在这张图上就是出现一个峰。
产物越纯，峰越窄，PCR产物越多，峰越高。
这样看来，出现负值表明此温度下PCR产物变性速度没有两边的温度是快。
70-80度时，已经出现变性，但是较为缓慢。
但是你的产物看来不是特别纯，峰比较宽，可能要改变反映条件或者改变引物。
荧光定量PCR问题疑难解答
（一）
两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。
但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。
2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。
A：
曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。
1.PCR反应效率差：
引物，试剂PCR条件的原因。
做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。
可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。
2.PCR中混入影响反应的物质：
模板提取方法需要改进
3.样品稀释不准确：
这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。
Q：
荧光定量PCR的灵敏度
A：
对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。
Q：
标准曲线要重复两三次吗?
A：
没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。
Q：
关于荧光定量标准曲线的制作
A：
一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了，这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你
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