细胞因子生物学活性检测.docx

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细胞因子生物学活性检测

细胞因子生物学活性检测

　　细胞因子水平测定是细胞免疫功能检测的一个重要组成部分。

由于许多细胞因子cDNA克隆和表达的成功，给细胞因子单克隆抗体制备、生物学功能的鉴定提供必要条件。

目前检测细胞因子水平主要包括两类方法：

一是生物学活性的检测，这类方法是利用细胞因子某一特定的生物学作用所设计的检测方法，如IL-2维持活化T细胞的增殖，IFN能保护病毒对正常细胞的感染，TNF-α选择性杀某些肿瘤细胞等，因此敏感性也较高；二是定量的检测，常用酶联免疫吸附试验（ELISA），如多克隆抗体与单克隆抗体，识别不同表位两种单克隆抗体的双抗体夹心法，生物学和定量的检测方法各有优缺点，在必要时可同时进行检测。

　　　　　　一、白细胞介素1（IK-1）生物学活性测定

　　白细胞介素1是一种重要的细胞因子，主要由单核-巨噬细胞产生，IL-1不仅对多种免疫活性细胞有重要的调节功能，而且与发热、炎症发生以及某些疾病的病理变化有关。

目前对IL-1产生水平的检测主要应用生物学活性检测的方法。

ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性

（一）　原理

　　小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达IL-1受体，在有IL-1同时存在的条件下，IL-1可协同丝裂原促T细胞的增殖作用。

根据加入IL-1后增殖水平（３H-TdR掺入率）的增加可计算出样品中IL-1的活性单位，或计算出刺激指数。

（二）　操作步骤

　　　　　　　　取6～8周龄C57BL16小鼠，拉颈处死，无菌取胸腺

　　　　　　　　置不锈钢网筛上，用注射器针蕊研磨成细胞悬液

　　　　　　　　调整细胞数为1.5×10７／ml

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　细胞悬液内加入ConA，使终浓度为3μg／ml，在96孔

　　　　　　　　培养板中加100μl（1.5×10６细胞）

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　加入不同稀释度待测样品和IL-1标准品

　　　　　　　　100μl／孔（ConA终浓度为1.5μg／ml）

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　37℃CO２孵箱66h

　　　　　　　　　　　　每孔加３H-TdR0.5μci

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓37℃CO孵箱6h

　　　　　　　　多头细胞收集仪收获于9999型玻璃纤维纸上

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　烤干，移入液闪瓶中，加适量闪烁液，于液闪仪上测β计数

　　计算:

　　1.　从IL-1标准曲线上测得IL-1的活性单位

　　2.　也可用刺激指数（SI）表示

　　　　　　　　　　　　　实验组cpm

　　　　　　　　　　SI＝──────　×100％

　　　　　　　　　　　　　对照组cpm

（三）　试剂和器材

　　1.10％FCSRPMI1640，96孔培养板，CO孵箱

　　2.　标准IL-1，　ConA

　　3.　３H-TdR，PPO、POPOP，二甲苯

　　4.　9999型玻璃纤维滤纸，细胞收集仪

　　5.　β液闪计数仪

　　（四）　注意事项

　　1.　不同品系小鼠对IL-1的反应性有差异，据国内资料报道以C57BL为好。

　　2.　不同周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应性不一，一般选用6～8周龄，小于5周或大于10周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应不稳定。

　　3.　ConA促丝裂原作用要进行预试，一般采用亚适剂量。

应用EL-4CTLL检测IL-1生物学活性

　　IL-1是一种十分重要的免疫调节因子，同时也是一种可引起发热和导致多种病理损伤的重要的内源性致热原和炎症介质。

目前IL-1检测方法有多种，主要包括：

小鼠胸腺细胞法，黑素瘤细胞增殖抑制法，纤维母细胞法、T淋巴细胞系法以及EBV转化B细胞法等。

　　㈠原理：

小鼠胸腺瘤细胞系EL4的某些亚克隆细胞表面具有高密度IL-1受体，在IL-1诱导下产生高水平的IL-2，通过用IL-2依赖株CTLL-2检测IL-2的生物学活性，从而反映检测样品中IL-1的水平。

　　㈡操作步骤：

　　　1.用EL４细胞两步法检测IL-1活性：

　　　　　　　　收集处于对数生长期的EL４细胞

　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　洗涤后，用1％FCSRPMI1640重悬细胞，并

　　　　　　　　　　　调整细胞浓度2×10６/ml，

　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　加处96孔板中，100μl/孔

　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　加入不同稀释度的IL-1α或IL-1β，100μl/孔，

　　　　　　　　　　　同时设1％FCSRPMI1640对照

　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　　5％CO,37℃培养18～24小时

　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　按终稀释度为1∶10～20转入另一块96孔板中

　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　用CTLL-2检测IL-2活性、检测方法见"IL-2检测"

2.用EL4细胞一步法检测IL-1活性

　　　　　　　　用5％FCSRPMI1640调整

　　　　　　　　EL4细胞浓度至2×10５/ml，CTTL-2浓度至4×10５/ml

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　　　加入96孔板中，两种细胞各加50μl/孔

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　　　加入不同稀释度的IL-1或待测样品，同

　　　　　　　　　　　　　时设EL４和CTLL-2细胞对照

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　　置5％CO２,37℃培养24～28小时后加入

　　　　　　　　３H-TdR,0.5μci/50μl/孔,继续培养6～8小时

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

收集样品，β计数

　　㈢试剂和器材

　　1.EL４细胞

　　2.CTLL-2细胞

　　3.标准rIL-1。

　　4.３H-TdR、POPOP、PPO、二甲苯。

　　5.玻璃纤维滤纸，细胞收集仪。

　　6.β计数仪

　　7.96孔板，无菌吸管，滴管、试管及加样器头。

　　8.FCS,RPMI1640,CO２培养箱等。

　　㈣注意事项：

　　1.在一步法检测IL-1时，其EL４细胞浓度不宜超过1×10４/孔，血清终浓度应＜5％。

　　2.在二步法检测IL-1时，其EL４细胞浓度在2×10５/孔时，犉d转移上清稀释度不宜低于1∶8,其诱导时间应12～24小时间为佳。

诱导血清浓度应≤1％。

　　3.在检测经诱导的上清中IL-1时，应避免使用A23187，TPA和ConA等较强的能诱导EL４细胞产生IL-2的诱导剂来刺激IL-1的产生。

二、白细胞介素2（IL-2）的生物学活性测定

（一）　原理

　　IL-2主要由活化T细胞产生，又为T细胞增殖所必需，故称T细胞生长因子（TCellGrowthfactor,TCGF）。

IL-2产生的水平反映T细胞的功能，牪;仅是免疫调节重要的研究对象，而且与临床多种疾病密切相关，CTLL是C57BL／6来源的。

犘!

鼠杀伤性T淋巴细胞细胞系，由Gills1977年建立，只有在IL-2存在的培养基中才能生长。

因此可作为指示细胞来测定待检样品中IL-2的水平。

除CTLL外，丝裂原活化的T淋巴母细胞亦可作为检测IL-2活性的指示细胞。

（二）　方法

　　可根据实验室条件，选用３H-TdR掺入法和MTT法

　　1.　３H-TdR掺入法

　　　　　　　　IL-2依赖的CTLL用10％FCS　RPMI1640洗涤

　　　　　　　　2次，每次1000rpm,5min,除去原培养液中的IL-2

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　　　　调整活细胞数1×10５／ml

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　　96孔平底培养板中每孔加100μl

　　　　　　　　　　　CTLL悬液（1×10４／孔）

　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　加入不同稀释度标准IL-2和待测样品

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　37℃CO孵箱，培养18～24h

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　每孔加３H-TdR0.5μci／50μl

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4-6h

　　　　　　　　　用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　干燥后，移入液闪瓶中，加入1ml闪烁液，

　　　　　　　　　于液闪仪中测β射线的cpm值

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　计算（举例）

　　将标准IL-2不同浓度和待测样品不同稀释度时所获得的cpm值作图，犠]轴采用概率座标（probit），横座标为Log2稀释倍数。

从50％的最高cpm值画一横线，犛k标准和待检斜线的交点，即可计算出待检样品IL-2的活性单位。

　　如标准品50％最大cpm值时为1u／ml，则待测标本1∶4时为1u／ml,原液则为4μ/ml

　　2.　MTT法

　　MTT（3-（4,5-dimcthylthioazol-2-yl）-2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide,四甲基偶氮唑盐）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。

当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲　（Formazan），将结晶的甲　溶解释放，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待检样品中IL-2的水平。

在掌握良好的实验条件下，MTT法的敏感性可接近３H-TdR同位素掺入法。

　　　　　　　　IL-2依赖的CTLL用10％FCS　RPMI1640洗涤2次，

　　　　　　　　每次1000rpm,5min,除去原培养液中的IL-2

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　　调整活细胞数1～2×10５／ml

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　96孔平底培养板中每孔加100μl

　　　　　　　　　　CTLL悬液（1～2×10４／孔）

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　加入不同稀释度标准IL-2和待检样品，100μl／孔，

　　　　　　　　　　　　　　　每份设3个重复孔

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　　　CO孵箱培养18～24h

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　　每孔加10μl　MTT（5mg／ml溶于PBS）

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　4h，37℃

　　　　　　　　轻轻吸出150μl上清，加入150μl二甲亚砜（DMSO）

　　　　　　　　或酸性异丙醇（异丙醇溶于0.04NHCl）

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　溶解10min，测OD值（570nM）

　　（三）　试剂和器材

　　1.　IL-2依赖的CTLL

　　2.　10％FCS　RPMI1640

　　3.３H-TdR

　　4.　标准IL-2

　　5.MTT,酸性异丙醇，二甲亚砜（DMSO）

　　6.　PPO，POPOP，二甲苯

　　7.　9999型玻璃纤维滤纸

　　8.　96孔平底培养板

　　9.　细胞收集仪

　　10.CO孵箱

　　11.β液闪计数仪

　　（四）注意事项

　　1.　CTLL细胞洗涤要充分，但操作必须轻柔，离心速度不宜过高，否则影响细胞的增殖。

　　2.　避免同位素污染。

　　3.　加标准IL-2或待测样品时，按从低浓度到高浓度顺序加。

　　4.　加入３H-TdR最适时机是阴性对照细胞开始全部死亡。

　　5.　CTLL细胞冻存后复苏较困难，用含有丝分裂原条件培养基长期培养容易发生变异。

三、白细胞介素6（IL-6）生物学活性检测

　　白细胞介素6（IL-6）是一种具有多重免疫调节功能的细胞因子。

HTLV-1感染的T淋巴母细胞系、单核细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞以及某些肿瘤细胞均可产生IL-6。

某些急性炎症、自身免疫性疾病、淋巴细胞恶性肿瘤（如多发性骨髓瘤）等与病人体内IL-6水平异常增高有关。

　　㈠原理：

IL-6在体外能促进B细胞杂交瘤的生长，故又称为杂交瘤生长因子（HGF）。

小鼠B细胞杂交瘤7TD1是一株对IL-6依赖的细胞系，由VanSnick1986年建立，只有在IL-6存在的培养基中才能生长，可以作为指示细胞来测定待检样品中IL-6水平。

这类IL-6依赖的小鼠B细胞杂交瘤细胞系还有MH60·BSF2、B9等。

　　㈡方法：

主要为３H-TdR掺入法

　　　　　　IL-6依赖的7TD1细胞用无FCS的RPMI1640洗涤2次

　　　　　　　每次1000rpm，5min，除去原培养液中的IL-6

　　　　　　　　　　　　　　　　↓

用10％FCS-RPMI1640调整活细胞数2×10４/ml

　　　　　　　　　　　　　　　　↓

96孔平底培养板中每孔加100μl7TD1悬液（2×10３/孔）

　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　加入不同稀释度标准IL-6和待检样品（100μl/孔）

　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　37℃，5％CO２孵箱培养48～72h

　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　每孔加３H-TdR0.5μCi/50μl

　　　　　　　　　　　　　　　　↓10h

用多头细胞收集仪收获于玻璃纤维滤纸上

　　　　　　　　　　　　　　　　↓

干燥后移入液闪瓶中，加入1ml闪烁液，于液闪仪中测β射线的cpm值。

　　计算：

　　1.根据cpm值，将能使7TD1细胞３H-TdR掺入cpm值达到最大值50％的IL-6的活性定为1u/ml。

　　2.以刺激指数（SI）表示。

　　㈢试剂和器材

　　1.IL-6依赖的7TD1细胞系

　　2.10％FCS-RPMI1640及无FCS的RPMI1640

　　3.３H-TdR

4.标准IL-6

5.PPO,POPOP,二甲苯。

　　6.9999型玻璃纤维滤纸。

　　7.96孔平底培养板

　　8.多头细胞收集仪

　　9.CO２孵箱

　　10.β液闪计数仪

　　㈣注意事项：

　　1.7TD1细胞洗涤要充分、轻柔，每次弃洗涤上清力求彻底。

　　2.避免同位素污染。

　　3.加样品时，应从低浓度到高浓度顺序加。

　　4.加入３H-TdR最适时机是阴性对照95％以上死亡。

　　5.为了增加检测方法的敏感性，可采用新复苏7TD1细胞，或用pH4.0枸椽酸缓冲液处理培养状态的7TD1细胞。

四、干扰素（IFN）生物学活性检测

　　干扰素（IFN）根据其产生细胞不同和理化性质、犐z物学特性的差异可分为α干扰素（IFN-α）、β干扰素（IFN-β）和γ-干扰素（IFN-γ）。

它们在机体免疫调节、抗病毒感染中具有重要作用。

检测IFN的方法主要分为定量测定（常用ELISA）和生物学活性的检测，后者较为常用。

（一）原理

　　干扰素能刺激某些指示细胞（如人羊膜上皮细胞Wish株、人喉癌细胞株Hep-2以及人胚肌皮或肺单层细胞）产生抗病毒蛋白，从而使细胞免受水疱性口炎病毒（VSV）的攻击，根据待测样品不同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。

（二）　操作步骤

　　　　　　　　96孔培养板中加入不同稀释度的IFN和标准IFN，

　　　　　　　　每个稀释度设3孔，每孔50μl，病毒对照不加IFN

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　每孔加入100μl1.5～2×10５／mlWish

　　　　　　　　　　或Hep-2细胞悬液，37℃、CO孵箱培养6～12h，

　　　　　　　　　　使细胞贴壁为单层

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　每孔加入50μl含100个　TCID50VSV,

　　　　　　　细胞对照不加病毒液

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　根据细胞病变状态，终止培养前3～4h

　　　　　　　　　　加入5mg／mlMTT,15μL／孔

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　加入适量生理盐水，用滴管轻轻吹吸

　　　　　　　　　　弃去悬浮病变细胞和死细胞

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　200μl／孔二甲亚砜（DMSO），作用10min

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　测OD（570nm）,表示活细胞中含甲　的量，

　　　　　　　　　　也可用刚果红摄入法、结晶紫染色法

　　　　　　　　　　　　　测定IFN对活细胞的保护水平

　　计算:

　　以保护半数（50％）细胞免受病毒损害的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。

也可从标准曲线中求得待测样品的IFN活性单位。

　　（三）　试剂和器材

　　1.　VSV

　　2.　WISH、HeP-2细胞株或人胚肌皮或肺单层培养物。

　　3.　MTT[3-（4,5二甲噻唑-2-yl）-2,5-2苯基-四唑溴盐]，二甲亚砜（DMSO），刚果红，结晶紫等。

　　4.　10％FCSRPMI1640,培养板、培养瓶、CO孵箱、超净台、酶联检测仪。

　　（四）　注意事项

　　1.　实验时先加IFN，后加指示细胞，以使细胞均匀分布于培养板底部。

　　2.　本法对天然培养上清或重组IFN-α、IFN-β和IFN-γ均可检测其活性单位。

五、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）生物学活性测定

　　肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种主要由单核-吞噬细胞产生的单核因子，不仅具有选择性地杀伤某些肿瘤细胞，而且有多种免疫调节作用。

其检测方法主要包括生物学活性测定和免疫学检测方法。

其中细胞毒生物学检测方法敏感性较高，最为常用；免疫学检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射免疫测定法。

（一）　原理:

　　TNF-α受体广泛地分布于多种肿瘤细胞和血细胞，根据TNF-α与相应靶细胞结合后引起不同的生物学效应，建立了多种检测TNF-α生物学活性方法。

某些肿瘤细胞膜表面的TNF-α受体与TNF-α结合后，可导致这些肿瘤细胞的死亡，可通过检测对肿瘤细胞的杀伤能力，来反映TNF-α的生物学活性。

若这种肿瘤细胞先用3H-TdR标记，则被杀伤后３H-TdR释放至细胞外，牽I通过测定肿瘤细胞释放３H-TdR的量来反映TNF-α的杀伤活性。

（二）　操作步骤:

　　　　　　　0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的L929细胞

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　用RPMI1640洗涤细胞后，调整细胞浓度至2×10６／ml

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　　加入３H-TdR，20μci／ml

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　置37℃，5％CO培养箱中2～3h，摇动1次／30min

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　用RPMI1640洗涤2次，800rpm×5min／次

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　调整细胞浓度至2～3×10５／ml后，加入96孔

　　　　　　　　　培养板中，100μl／孔

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　加入不同稀释度的待测样本（设三个重复孔）

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　加入放线菌素D，使放线菌素D最终浓度至1μg／ml

　　　　　　　　　用时设放线菌素、完全培基阴性对照和rTNF-α标准

　　　　　　　　　　　　　　　　品阳性对照

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓37℃,5％CO培养中24h

　　　　　　　　　　　　加入3％胰蛋白酶和0.25％DNA酶各10μl／孔

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓37℃，30min

　　　　　　　　　　　　用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集器收集样品于

　　　　　　　　　　　　"9999"型玻璃纤维滤纸上

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　　　　　烤干后，进行β计数

　结果判定:

　　1.　TNF-α作用24h后，在倒置显微镜下判定50％L929细胞杀伤的稀释度即为１个TNF-α活性单位。

　　2.　根据测得的cpm值按下列公式计数活性单位:

　　　　TNF-α活性单位（U／ml）

　　　　　　　　放线菌素D对照组cpm-实验组cpm

　　　　　　　＝──────────────×标准品活性单位×待测样品稀释倍数

　　　　　　　　放线菌素D对照组cpm-标准品cpm

　　（三）　试剂和器材:

　　1.　鼠成纤维细胞（L929）

　　2.　rTNF-α和待测样品

　　3.　放线菌素、DNA酶、胰蛋白酶

　　4.　10％FCSRPMI1640，RPMI1640

　　5.　３H-TdR，PPO，POPOP、二甲苯，玻璃纤维滤纸

　　6.　96孔培养板、无菌吸管、滴管、试管、加样器和加样器头

　　7.　CO培养箱、倒置显微镜、超净台等

　　（四）　注意事项:

　　1.　用于标记３H-TdR的L929细胞要处于对数生长期，否则３H-TdR掺入率低，影响实验结果。

　　2.　标记后的L929细胞应充分洗涤，以洗掉游离的３H-TdR，牱q则会影响完全培基对照组cpm值。

　　3.　胰蛋白酶和DNA酶浓度和消化时间要严格控制，犆?

批酶均要摸索最适浓度和时间。

否则，消化时间过长或过短者会影响实验结果。

　　4.　为了增强检测系统的敏感性，在测定系统中加入放线菌素D，但浓度不宜过大，一般最终浓度为0.5～1μg／ml。

　　5.　在测定PHA等丝裂原诱导的PBMC培养上清时，要注意排除TNF-β（淋巴毒素）的影响。

因为TNF-β细胞毒生物学作用等很多生物学效应均与TNF-α相似。