动物细胞传代培养实验报告.docx
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动物细胞传代培养实验报告
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动物细胞传代培养实验报告
篇一:
细胞传代培养实验报告
细胞传代培养
一.实验目的
初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程,为生物技术在医学上的
应用打下基础。
二、原理
从生物体中取出某种组织或细胞,模拟体内生理条件,在人工培养条件下使其生存、生
长、繁殖或传代,这一过程称为细胞培养。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察
活细胞,并在有控制的环境条件下进行实验,避免了体内实验时的许多复杂因素,还可以与
体内实验互为补充,可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象,耗费少,比较经济,
因此成为生物学研究的重要手段。
细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为
原代培养;当原代培养的细胞增殖达到一定密度后,则需要做再培养,即将培养的细胞分散
后,从一个容器以1:
2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养,为传代培养,传
代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受
温度、渗透压、ph值、无机盐影响,消毒、配液等均有严格的规范和要求,特别是无菌操
作是细胞培养成败的关键。
三、材料和试剂
1、细胞:
293细胞株
2、试剂:
0.25%胰酶、1640培养基(含10%小牛血清)
3、仪器和器材:
倒置显微镜,培养箱、电动枪,培养板,吸液枪,5ml玻璃吸管、酒精
灯等
四、操作步骤
1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。
2、加入1~2ml0.25%胰酶溶液,使板底细胞都浸入溶液中。
3、马上吸走胰酶液,再次加入2ml左右的胰酶,同样马上吸去,再加入几滴胰酶放入培养箱中消化几分钟
4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液,再按照观察的生长情况确定的传代比例传代
5.根据确定的比例来取需要的量(剩余的细胞拿来做细胞计数),加入4ml左右的培养液
6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后,将培养板放入培养箱
7.收拾整理超净台
附:
消化液配制方法:
称取2.5克胰酶蛋白酶,加入100ml10xpbs+纯水溶解到1L,滤器过滤除菌,4℃保存,
用前可在37℃下回温。
10xpbs配方:
na2hpo4(14.2g)Kh2po4(2.32g)nacl(80g)Kcl(2.02g)
(调至ph=7.4)
五、实验结果
传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上,2天左右就在瓶内形成单层,
达到七八成满。
这时需再次传代
六、讨论与反思
无菌操作中的注意事项
在无菌操作中,一定要保持工作区的无菌清洁。
为此,在操作前要认真地洗手并用75%乙醇消毒。
操作前20~30分钟起动超净台灭菌。
培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞,打开之前和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下,打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。
操作完毕后,加上瓶塞,才能拿到超净台外。
使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端,将尖端在火上烧一下,戴上胶皮乳头,然后再去吸取液体。
总之,在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。
每天观察细胞形态,掌握好细胞是否健康的标准:
健康细胞的形态饱满,折光性好,生长致密时即可传代。
多做,熟能生巧
篇二:
细胞传代实验报告
篇一:
细胞传代培养实验报告
细胞传代培养
一.实验目的
初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程,为生物技术在医学上的应用打下基础。
二、原理
从生物体中取出某种组织或细胞,模拟体内生理条件,在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代,这一过程称为细胞培养。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞,并在有控制的环境条件下进行实验,避免了体内实验时的许多复杂因素,还可以与体内实验互为补充,可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象,耗费少,比较经济,因此成为生物学研究的重要手段。
细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养;当原代培养的细胞增殖达到一定密度后,则需要做再培养,即将培养的细胞分散后,从一个容器以1:
2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养,为传代培养,传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、ph值、无机盐影响,消毒、配液等均有严格的规范和要求,特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
三、材料和试剂
1、细胞:
293细胞株
2、试剂:
0.25%胰酶、1640培养基(含10%小牛血清)
3、仪器和器材:
倒置显微镜,培养箱、电动枪,培养板,吸液枪,5ml玻璃吸管、酒精灯等
四、操作步骤
1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。
2、加入1~2ml0.25%胰酶溶液,使板底细胞都浸入溶液中。
3、马上吸走胰酶液,再次加入2ml左右的胰酶,同样马上吸去,再加入几滴胰酶放入培养箱中消化几分钟
4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液,再按照观察的生长情况确定的传代比例传代
5.根据确定的比例来取需要的量(剩余的细胞拿来做细胞计数),加入4ml左右的培养液
6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后,将培养板放入培养箱
7.收拾整理超净台
附:
消化液配制方法:
称取2.5克胰酶蛋白酶,加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l,滤器过滤除菌,4℃保存,用前可在37℃下回温。
10xpbs配方:
na2hpo4(14.2g)kh2po4(2.32g)nacl(80g)kcl(2.02g)
(调至ph=7.4)
五、实验结果
传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上,2天左右就在瓶内形成单层,达到七八成满。
这时需再次传代
六、讨论与反思
无菌操作中的注意事项
在无菌操作中,一定要保持工作区的无菌清洁。
为此,在操作前要认真地洗手并用75%乙醇消毒。
操作前20~30分钟起动超净台灭菌。
培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞,打开之前和
加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下,打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。
操作完毕后,加上瓶塞,才能拿到超净台外。
使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端,将尖端在火上烧一下,戴上胶皮乳头,然后再去吸取液体。
总之,在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。
每天观察细胞形态,掌握好细胞是否健康的标准:
健康细胞的形态饱满,折光性好,生长致密时即可传代。
多做,熟能生巧篇二:
细胞生物学实验传代培养
一、【实验目的】
1、了解动物细胞传代培养的基本原理。
2、掌握动物细胞传代培养的基本操作,并对hela细胞进行传代培养。
二、【实验原理】
hela是heiettalacks的简称,heiettalacks是一位患有子宫颈癌的美国妇女的名字,在她死后,该细胞走被广泛散发到各研究机构,并无限次地繁殖分裂下去。
培养细胞的特性:
贴附生长:
必须贴附于支持物表面才能生长。
见于各种实体瘤细胞。
悬浮生长:
于悬浮状态下即可生长,不需要贴附于支持物表面。
见于各种造血系统肿瘤细胞。
每代贴附生长细胞的生长过程:
1、游离期细胞接种后在培养液中呈悬浮状态.也称悬浮期。
此时细胞质回缩,胞体呈圆球形。
10分钟一4小时
2、贴壁期细胞附着于底物上,游离期结束。
细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。
3、血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原(:
动物细胞传代培养实验报告)等糖蛋白(生长基质),这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上,悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。
4、潜伏期此时细胞有生长话动,而无细胞分裂。
细胞株潜伏期一般为6~24小时。
5、对数生长期细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳,最适合进行实验研究。
6、停止期(平台期)细胞长满瓶壁后,细胞虽有活力但不再分裂
细胞传代方法
1、悬浮生长细胞传代
离心法传代:
离心(1000转/分)去上清,沉淀物加新培养液后再混匀传代。
直接传代法:
悬浮细胞沉淀在瓶壁时,将上清培养液去除l/2一2/3,用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。
2.悬浮生长细胞传代(hela细胞)
此类细胞部分呈现贴壁生长现象,但贴壁不牢,可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来,进行传代。
3、贴壁生长细胞传代
采用酶消化法传代。
常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。
细胞培养用液的配制
1、d-hanks原液试剂配方
氯化钠80.0g磷酸氢二钠(nahpo·2ho)0.6g氯化钾4.0g磷酸二氢钾0.6g三蒸水1000ml
2、d-hanks工作液试剂配方
d-hanks原液100ml三蒸水896ml0.5%酚红液4ml
3、消化液:
胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,影响细胞骨架,从而使细胞分离。
胰蛋白酶液浓度越高,作用越强,但超过一定限度会损伤细胞。
胰蛋
白酶是一种黄白色粉末,用无ca2+、mg2+的pbs缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25%。
用滤器过滤除菌。
胰蛋白酶液消化时间:
2-10分钟。
用含血清培养液终止其对细胞的消化作用
完全培养基的组成基础培养基80%一95%
血清5%一20%(一般加10%)
碳酸氢钠2.0g/l
青、链霉素各100卑位/毫升
血清质量好坏是实验成败的关键。
常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等,其中以胎牛血清质量最好。
优质血清的标准:
透明,淡黄色,无沉淀物,无细菌、支原体、病毒污染。
血清的灭活(消除补体活性):
56℃,30分钟
血清的消毒:
过滤除菌
三、【实验材料】
实验用具:
离心管(2支),移液枪(每个台面一把),枪头,吸管(4根),培养皿(每组2个)
实验药品:
0.25%胰酶,d-hanks,1640培养基
四、【实验操作】
1.用75%乙醇擦手,取离心管一个,打开超净台(照明、风机),把离心管置于架子上。
然后用75%乙醇擦一下台面,点燃酒精灯。
取尖吸管、吸量管各一支,套好吸球,放置在专用的架上。
2.从冰箱中取出0.25%胰酶、d-hanks、培养基。
可以把胰酶和d-hanks的瓶盖打开或者拧松。
3.取待传代的细胞,用尖吸管弃去旧的培养基,加入d-hanks。
轻轻摇动后将hanks弃掉。
4.用尖吸管吸取适量胰酶加入,加入的量以覆盖整个细胞培养面为宜,轻轻摇动。
2-5分钟后迅速将消化液吸出。
消化时间长短是实验成败的关键,宁可短消化,不能过消化。
否则细胞会变死。
在倒置显微镜下观察,当细胞质回缩,胞间间隙加大为消化适宜。
5.取培养基加入细胞,反复轻轻吹打培养皿壁,制备细胞细胞悬液。
吹打的部位均匀,从上到小,从左到右,顺序进行吹打,保证各个部位的培养细胞均能吹打到,成片的细胞已经分散成小的细胞团或者单细胞便停止吹打。
吹打时用力不要过猛,尽量不要出现气泡,以免损伤细胞。
6.至所有细胞从培养皿底部脱落下来,然后吸取至离心管中。
1000rpm离心5分钟。
(无需准确计数时离心可略)
7.细胞离心毕,尖吸管弃去上清,吸取培养基适量,加入离心管,将细胞重悬、吹匀。
(无需准确计数时离心可略)
8.吸量管吸取适量培养基1.5ml加入新的培养皿中。
细胞悬液0.5ml加入新的培养皿中,培养密度为1×105-×106/ml。
显微镜下观察,摇匀,放入37度c02培养箱孵育。
9.待培养基(本身为红色),当ph值降低,培养基呈偏淡红色时,一般2天以后,将旧的培养基吸掉,更换新鲜培养基继续培养。
五、【实验现象】
培养基:
rm1640培养基+10%胎牛血清
六、【实验讨论】
注意事项
1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。
所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。
每次最好只进行一种细胞的操作。
每一种细胞使用一套器材。
培养用液应严格分开。
2.每天观察细胞形态,掌握好细胞是否健康的标准:
健康细胞的形态饱满,折光性好,生长致密时即可传代。
3.如发现细胞有污染迹象,应立即采取措施,一般应弃置污染的细胞
,如果必须挽救,可加含有抗生素的bss或培养基反复清洗,随后培养基中加入较大量的抗菌素,并经常更换培养基等篇三:
实验二_细胞的传代培养[定稿]
篇三:
7-动物细胞传代培养
报告成绩
实验七动物细胞传代培养
学生姓名学号班级
座位号:
同组同学日期:
年月日
备注:
【Introduction】
(1)动物细胞培养的概念和要求:
动物细胞培养,是从动物体内取出细胞或组织,模拟体内的生理环境,在无菌、适温和丰富的营养条件下,使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。
[1]
动物细胞培养需要无菌操作,要求工作环境和条件必须保证无微生物污染,不受其他有害因素影响,空气要保持清新和干燥。
(2)原代培养和传代培养及其应用:
接种组织块直接长出单层细胞或将组织分散成单个细胞再进行培养,在首次传代前的培养称为原代培养。
原代培养在一定程度上能反映体内状态。
在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下,原代细胞是很好的实验材料,如药物测试、研究细胞分化等。
原代培养也是建立各种细胞系(株)必经的阶段。
传代培养是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程。
在细胞一代中,细胞约能倍增3~6次。
【materials&methods】
实验用具:
超净工作台、倒置显微镜、离心机、co2培养箱。
实验器材:
滤器;细胞培养瓶;细胞培养皿/板;培养液瓶--蓝盖瓶;移液器和吸头;离心管;eppendorf管;酒精灯或煤气灯;75%酒精棉。
培养用液:
完全培养基(合成培养基加入5%~10%血清);平衡盐溶液;消化液;抗生素液。
实验操作:
(1)戴好口罩,穿好鞋套、无菌白大衣→戴手套,喷酒精。
(2)从细胞瓶的反面加入胰酶2.5ml,轻洗→再加0.5ml胰酶置于培养箱中消化两分钟
(3)加入2~3ml完全培养基终止→吸管吹打力量适中,7~8次
(4)低速离心1000转/分钟,5min,弃去上清液→沉淀中加入1ml完全培养基,吹匀
(5)吸取1/3体积悬液至原瓶中,加5ml完全培养基,继续培养。
【Results】
细胞传代的第二天去观察。
(1)外观细胞培养瓶:
培养液清亮,无混浊。
贴壁面呈现白色点状。
(2)倒置显微镜观察细胞:
细胞分布均匀,密度为40%左右,大部分细胞贴壁铺展良好,类似梭状。
少量细胞圆形悬浮,为有丝分裂期细胞。
无细菌等污染。
【Discussion】
1.分析细胞生长优劣的影响因素,若结果不理想,是何原因?
如何改进?
。
答:
细胞培养最容易被细菌或者病毒感染,因此实验操作时应当果断快速,不要犹豫。
如果结果不理想,比如培养液浑浊,可能是已经被污染了。
比如细胞生长过少,可能是吸吹过程中震动太大造成了细胞破裂;也可能是培养箱条件不适合生长;或者盖子太紧了没有气体交换。
2.实验操作过程中应注意哪些问题?
?
答:
所有瓶口打开前、打开后、关闭前,都要在火焰上消毒。
吸管口和枪头口从瓶口中间伸入,不要碰到瓶口;从液面浅表处吸,不要深入;若碰到,更换新的吸管或枪头。
操作时,双手不要从瓶口、皿口上面经过,应绕过取物。
这都是为了防止细胞被污染,所以要小心操作。
另外,在吹吸细胞的时候不能太多次数,否则细胞遭受物理撞击容易破裂死亡。
还有离心后要缓慢取出,尽量少晃动离心管,否则应该重新离心。
细胞培养时应该把瓶口拧松,留一些空隙让细胞呼吸。
3.对该实验有何意见或建议?
?
答:
鞋套太容易破了,希望可以换质量好一点的。
还有后面组等待的时间太长了,可以先做实验再在等待的时候讲述一些概念性的东西。
【Questions】
1.在细胞培养的过程中,若细胞培养皿/瓶中出现污染,该如何操作或挽救?
如何判断污染源?
?
答:
细胞污染常见有三种:
即真菌污染、细菌污染和支原体污染。
细菌污染:
可见培养液明显混浊,细菌产生的毒素等使细胞崩解、死亡,孔或皿底部常有沉淀物出现,用光学显微镜或倒置相差显微镜观察可见视野内有均匀的点状颗粒,瑞氏或革兰氏染色镜下检查即可确定。
挽救方法有抗生素除菌法、抗生素联合巨噬细胞吞噬法和裸鼠体内接种除菌法。
其中裸鼠体内接种除菌法能彻底清除喉癌细胞系中的污染细菌,并能保持肿瘤细胞的来源特征和增生活性,是细胞系去除污染细菌最为理想的方法[2]。
真菌污染:
这在细胞培养中是比较常见的,尤其是在炎热、潮湿的季节。
此种污染容易发现,肉眼观察大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面,镜下可见丝状、管状或树枝状菌丝,纵横交错于细胞之间。
用氟康唑可以去除细胞培养中的真菌污染[3]。
支原体污染:
这是目前细胞培养中最常见、不易被察觉、干扰实验结果的一种污染。
支原体在镜下呈暗色微小颗粒,并有类似布朗运动的表现,多位于细胞表面和细胞之间。
2.若给你一株从你未培养过的细胞株,你应该怎样做才能将该细胞株顺利传代培养?
?
答:
准备细胞培养室和各种实验器材,然后首先观察该细胞株是贴壁生长还是悬浮生长,以便于制
备相应的培养基以及培养方法。
要多设计几个对照组来找到最佳培养方案,接着按照一般细传代的步骤操作。
整个实验过程中要保持无菌状态,不能有污染。
【References】
[1]姜彬.细胞培养技术简介及避免污染的策略[J].生物学通报,20XX,03:
54-55.
[2]王鸿,张伟,孟娜.细胞培养中珍贵贴壁细胞污染挽救方法的评价[J].首都医科大学学报,20XX,01:
129-134.
[3]王恩军,靳祎,王亮.氟康唑去除细胞培养中的真菌污染[J].河北职工医学院学报,20XX,04:
7-8.
实验七动物细胞传代培养
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座位号:
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年月日
备注:
【Real-timeRecord】