基因工程PCRRRSVS7.docx

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基因工程PCRRRSVS7

基因工程RRSV-S7设计

20120921

1在NCBI上搜索RRSVS7completecds

2下载序列，并保存

3将序列文档导入Vector软件

4双击导入序列，进行开放阅读框架ORF查找,只保留ATG为起始密码子

5得到RRSV-S7的ORF,并保存至文档

6导入ORF序列，进行酶谱分析

采用PGEX载体进行克隆表达,需要对BamH1,EcoR1,Sma1，Sal1，Xho1，Not1进行分析，基因内是否含有酶切位点

ORF线性化，点击红色箭头

7载体的酶切方案：

pGEX系列上的MCS上的酶切位点在RRSV-S7目的基因序列除Xho1酶存在以外，其他均不存在，可以选用。

SmalⅠ产生的为平末端,不适合采用

考虑到酶切位点的位置效应，选取BamH1与EcoR1作为双酶切位点

同尾酶分析，BamH1与EcoR1是非同尾酶

为保证两个酶切位点的正确读框，选择PGEX-6P-1作为载体

查表得两种酶有通用缓冲液1xK，BamH1的酶切温度是30度,EcoR1酶切温度为37度

两种酶的保护碱基不长

设计酶切方案：

Kbuf,30oC,BamH1酶切2hours以上；再37oC加EcoR1酶切过夜

引物设计

图示为软件设计引物

ATGGACGAGCTAACTTTATC

TCCCTCGACGGGAGGCCCAA

P+验证：

证明正确

经过人工加上酶切位点，保护碱基最终引物

P+（BamH1）5’CGGGATCCATGGACGAGCTAACTTTATC3’

P-（EcoR1）5’GGAATTCTCCCTCGACGGGAGGCCCAA3’

送公司合成,2OD,1OD/tube分装.

使用时加ddH2O至10pmol/ul浓度.

实验设计

实验步骤：

一、RRSV-S7基因抽提

RRSV感染的病稻,切碎研磨,加入抽提缓冲液，加入酚,裂解细胞,变性蛋白，离心,得上清（含DNA,mRNA,dsRNA等核酸）。

CF11柱可以特异吸附dsRNA，获得纯化的dsRNA,电泳鉴定。

二、RT-PCR扩增

1.dsRNA,P+,P-混合物,加热1000C5min，

2.快速插入冰中，

3.加入RT缓冲液和RTase,反应1h，

4.取部分RT产物,作为PCR反应的底物,配好PCR反应体系,PCR扩增，电泳鉴定。

三、PCR程序：

1.变性：

94℃,5min

循环过程（30次左右）

2.解链：

94℃,30s

3.引物结合:

50~55℃，30s

4.延伸：

72℃，2min（ORF的长度为1826bp）

5.终延伸：

72℃，10min

四、质粒的抽提：

配制如下溶液

溶液1：

50mmol/l葡萄糖，25mmol/lTri·Cl（pH8.0），10mmol/lEDTA（pH8.0）

溶液2：

0.2mol/NaOH，1%SDS

溶液3：

7.5mol/LNH4AC（pH7.6）

其它溶液：

（1）2MNH4AC

（2）异丙醇（3）70％乙醇（4）RNase

抽提步骤如下：

1）1.5ml菌液，12000rpm*1min,弃上清，溶液1（200ul）,剧烈混匀，溶液2（400ul），温柔混匀，冰中5min;溶液3（300ul）,温柔混匀，冰中10min

2）13000rpm*5min,取上清；

3）540ul异丙醇，室温10min;

4）14000rpm*10min,弃上清；

5）100ul2MNH4AC

6）13000rpm*5min,取上清；

7）100ul异丙醇，室温10min;

8）14000rpm*10min,弃上清；

9）70%乙醇500ul,14000rpm*10min,弃上清；

10）烘干10-30min

11）50ulddH2O（含0.1mg/mlRNase）,37°C*30min.

五、基因酶切方案：

Kbuf,30oC,BamH1酶切2hours以上；再37oC加EcoR1酶切过夜

BamH1与EcoR1双酶切PGEX-6P-1质粒

六、目的基因与质粒进行连接

反应总体积为10ul；基因/载体=1：

10；16℃连接过夜。

七、感受态细胞的制备

1.菌种活化

2.取0.5ml菌液至50mlLB培养液中；

3、37℃，振荡培养2h至对数期；

4、转至50ml无菌塑料管，0℃*10min;

5、5000rpm*10min*4℃

6、取沉淀，加25ml50mMCaCl2【0℃，无菌】

7、5000rpm*10min*4℃

8、取沉淀,加2ml含15％甘油的50mMCaCl2重悬，200ul/tube分装，液氮速冻后至－80℃冰箱保存。

八、质粒与感受态细胞连接

将连接产物5ul加入感受态细胞中混匀

冰上30min

42℃,90s

冰上1～2min

加1mlLB（无Amp）

37℃培养

6000rpm*30s，浓缩100ul

涂板（Amp板）

37℃培养过夜

九、阳性菌筛选

1.将菌液涂布与Amp的培养基中，在培养基中，用牙签随机挑选6个菌落进行克隆的Amp抗性筛选，已导入载体的感受态细胞存活。

2.在培养基中，随机挑选6个菌落进行PCR筛选，目的基因长度为1824bp

3.BamH1与EcoR1双酶切电泳筛选

4.将含有目的基因的重组质粒送往公司进行测序。

十、蛋白的表达纯化

1、破碎生物组织，用适当的缓冲液将蛋白质抽提

2、离心法将细胞的亚细胞结构和细胞碎片与溶液分开

3、盐析法将相关蛋白质组分沉淀

4、色谱法或电泳法使各种蛋白质分开，纯化

十一、蛋白功能研究