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word完整版双酶切连接反应之全攻略

【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）

双酶切连接反应之全攻略

前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法,用2周重组了14个质粒。

现就自己的体会，结合战友的宝贵经验,谈一下质粒重组的一些个人经验。

1、回收PCR产物：

在进行PCR扩增时候,给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要,尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶,如BamHI,HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率.选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：

http:

//img.。

..。

cn/upload/2006/08/13/31219184。

pdf。

双酶切时间及其体系:

需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要,我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。

应用大体系，如100微升.

纯化问题:

纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶,影响纯化效率.现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此,酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。

所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒

酶量的问题：

以TAKARA的为例,其对1单位酶的定义如下：

在50μl反应液中,30℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位（U）。

而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外,该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去,只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接

摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。

但对于初学者从头认真计算则非常有必要。

回收的载体片段：

回收的PCR产物片段=1：

10　，一般取前者0。

03pmol，后者取0。

3pmol.

pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA:

（Xpmoles×长度bp×650）/1,000，000（注：

长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套。

1pmol1000bpDNA=0。

66μg，如载体是5380bp，则0。

03pmol为

0.03×5.38×0.66=0。

106524µg。

测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1。

8-2。

0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。

连接反应：

TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为:

在20μl的连接反应体系中，6μg的λDNA—HindIII的分解物在16℃下反应30分钟时,有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）.而它的浓度为350U/μl，所以完全够用。

连接酶容易失活，注意低温操作,最好在冰上。

时间3个小时足已。

3、转化:

a、全量（10μl）加入至100μlJM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。

b、42℃加热45秒钟后,再在冰中放置1分钟.

c、加入890μlAMP阴性培养基,37℃振荡培养60分钟。

取100μl铺板.也可离心后余100μl

几个非常重要的问题

1做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时，16度.

2对含有AMP—RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55—60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度.铺板前后注意用吹风机吹干

3对照的设立：

为验证双酶切是否成功，可做如下对照：

A酶切反应时加各单酶分别切，两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功。

做转化时,也要进行对照.

设4个：

A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功，如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常’的情况下.

B。

酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒

C.设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误.

D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.

4。

所有的试剂切记低温保存。

一步一个脚印。

不要偷懒，图省事最后却更费事。

注意设立对照。

经PCR鉴定,克隆90％-100%的阳性率,所以在后面的挑克隆中,我只挑选4个就足够了。

然后双酶切鉴定,测序。

。

。

。

。

。

希望大家不断补充.

Ding一下，和我的方法差不多。

连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min,马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase.

springwelwrote:

用2周重组了14个质粒。

这个效率非常不错！

佩服！

smartkevinwrote：

Ding一下，和我的方法差不多。

连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min,马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase。

这个操作是什么原理？

为什么要选择45C？

其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余.

分子克隆3的经典操作,个人认为主要目的如下:

插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配,如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开.由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。

springwelwrote:

酶量的问题：

以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：

在50μl反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位（U）。

而该酶浓度约为15单位/微升,在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

［color=red］

但是公司给推荐的一般都是2.0ul体系加1ul，其实我有的时候为了省酶,在20ul只加0。

5ul酶，切的也很好。

我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamdaDNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。

smartkevinwrote：

其实也不一定45度,估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。

分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下:

插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。

由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配,从而提高连接效率。

如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用.不知道还有没有其他的解释?

我倒是没有仔细看过分子克隆。

mybbffwrote:

如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大,对于同源粘性末端可能有作用.不知道还有没有其他的解释?

我倒是没有仔细看过分子克隆。

刚才查了一下分子克隆3，只说了一句“以消除重新复性而导致的末端相互聚合"（中文版p71）。

其实如果是粘性末端酶切的话都是有用的，无所谓非同源和同源末端，就算是非同源末端，载体和载体，片段和片段也能聚合.对于平末端应该就没有什么作用了。

autumnsunwrote:

但是公司给推荐的一般都是2.0ul体系加1ul,其实我有的时候为了省酶,在20ul只加0。

5ul酶，切的也很好。

我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamdaDNA一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了,会省好多钱啊，尤其是有的酶,一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管,不知道有人试过没有。

如果100ul里的DNA太多了也不行啊,酶和DNA还是要匹配的

我不明白的是,我们一般的质粒载体是否象lamdaDNA一样好切,如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。

其实除了考虑酶浓度（每微升多少个单位）以外，还应该考虑这种酶在lamdaDNA上的酶切位点数目.比如用HincII和XbaI双切pUC118，这两个酶在pUC118上都只有一个酶切位点，而在lamdaDNA上的酶切位点分别是35个和1个。

根据酶活性的定义，相同单位的HincII和XbaI对pUC118的酶切效率是35比1,所以在双酶切体系中，所用的HincII显然应该要少很多。

好！

！

!

真实用！

！

！

“回收的载体片段：

回收的PCR产物片段=1：

10　,一般取前者0.3pmol，后者取0。

03pmol。

”

是不是应该前者0。

03，后者0。

3啊？

精华！

投你一票！

msherwrote：

好！

！

！

真实用！

！

!

“回收的载体片段：

回收的PCR产物片段=1：

10　，一般取前者0。

3pmol,后者取0。

03pmol.”

是不是应该前者0。

03，后者0。

3啊？

已经改了,谢谢!

昨天14个测序结果出来,全部是阳性克隆。

两边是载体的序列，中间是插入的目的片段。

回顾自己的实验现补充几点。

做转化时,也要进行对照。

设4个：

A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆，则证明双酶切成功,当然要保证感受态，培基,连接酶都’正常’的情况下.

B。

酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒

C。

设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误。

D。

AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况。

就上面的对照简要说一下我的结果。

转化后第二天可见14个标本的平皿上长了很多克隆，约100个左右，我用的是直径6cm的板子,所以仍显较多，（我是先挑半个克隆并标记好行PCR鉴定后再对另外的一半进行摇菌抽提质粒），较难挑克隆，所以铺皿时不用离心，直接用100微升的铺皿就可以了，我其中一个是这样做的,长得克隆较大，很好挑选。

下面简要的说一下对照的结果.

A只长出了3个克隆，以100的基数计算，约为3%。

即双酶切反应中质粒只有3％进行了单酶切

B约有5个克隆，即质粒完全没被切动的约5%

C长了很多克隆，证明操作系统没有问题。

为系统控制指标.

D长了很多克隆，证明感受态没有问题。

这些对照相辅相成，扬长避短。

万一什么都没作出来，也好分析原因.

JM108感受态细胞的制备

刚开始做实验时，是向TAKARA购买的，一支30元,定了10支。

后来干脆自己做，感觉质量和TAKARA的质量不相上下，下面谈谈我制作感受态的体会。

前期工作

分子生物耗费时间在于准备过程太多。

所以做好前期工作非常重要，所谓‘磨刀不误砍材功’。

注意事项

1。

不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌,最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种划板（AMP阴性）37度过夜培养，划板时用小TIP头挑少许冰渣即可,轻划S行.同时记得设立对照：

A、在AMP阳性板划菌，排出AMP抗性菌污染.大家都知道，实验室很多材料从师姐传师妹，或许经过很多人的转手。

所以从头鉴定所用材料的可靠性非常必要。

B、AMP阴性空白培基.系统控制参照，为更准确起见，用TIP头不沾任何东西进行划板.第二天挑克隆。

2.质粒的质量和浓度：

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA（cccDNA）.转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低.1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。

一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。

不过我一般链接反应后（TAKARA的链接酶，体系25微升）会全量加到200微升的感受态里，约为150ng（载体0。

1微克，目的片段约0。

05微克）.效果也好.

3。

试剂的质量：

所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的（GR.或AR.）,并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。

国产的当然也可以。

我用都是国产的，好像是陇西化学制剂,分析纯.

4。

防止杂菌和杂DNA的污染：

整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。

培养基的配制

1.配制LB-AMP抗性培养基LB液体培养基：

精解蛋白胨10g,酵母抽提物5g，氯化钠l0g,加去离子水800ml充分搅拌溶解，用1mol/LNaOH调pH7。

0，补加去离子水至1000毫升，高压灭菌,4度保存.我一般没有用1mol/LNaOH调pH7.0.而是直接精解蛋白胨10g，酵母抽提物5g,氯化钠l0g加去离子水至1000ml。

2。

LB固体培养基:

LB液体培养基中加1.5%琼脂粉,高压灭菌消毒；

3。

Amp母液：

用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml即100ug/ul溶液，置—20℃保存；AMP500mg/支，一支用5ml稀释即得.然后分5支分装（浓度100mg/ml即100ug/ul）。

4。

含Amp的LB固体培养基：

将配好的LB液体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp储存液,使终浓度为100ug/ml摇匀后铺板（30ml/90mm）：

即多少毫升培养基加多少微升上述的Amp母液多少毫升培基=加多少微升母液,或减半量则最终浓度为50ug/ml

有指南上写细菌转化后37度复苏时用SOC培基.我从来只用AMP阴性的普通培基，效果也很好。

5.0.05mol/LCaCl2溶液:

我们实验室只有CaCl2—6H2O,分子量219,配制100ml的，则需称量0。

005×219=1.095g就可以了。

其实氯化钙的摩尔浓度在0。

05—0.1mol/L均可.溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌.

6。

含15％甘油的0。

05mol/LCaCl2：

先配制成0。

1mol/L的氯化钙溶液50ml,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。

有文献说要用0。

22的滤器，其实完全没有必要。

高压即可。

一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的JM109单菌落，接种于3—10mlLB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右（一般过夜）。

将该菌悬液以1：

100-1:

50的比例接种于10ml试管（如较多制备，多用几个试管即可）的LB液体（AMP阴性）培养基中同时做空的培基对照,37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。

二、感受态细胞的制备（CaCl2法）

1、将培养液分转入1。

5ml的离心管中（一管10ml菌液可分装成约6管1。

5ml的离心管中），冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

2、弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液200微升轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟后，4℃下3000g离心10分钟.

3、弃去上清,加入200微升预冷含15%甘油的0。

05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液.

4、贮存于—70℃可保存半年.

要点：

1.悬浮细胞时动作一定要轻柔；2冰上。

掌握者两点可谓掌握了制备感受态的精髓,无往不利。

连接双酶切

PCR鉴定目的片段是否连接上表达载体

可能的原因，1。

表达载体双切不充分，载体量太大，而酶又加的太少，酶切时间短

 2。

连接最好是12～16小时，因为你的目的片段和载体的浓度比，不是很合适

3.回收胶的问题

今天酶切时没有和空载体对比，

TE，含有EDTA，会抑制连接酶的活性

洗下来后要先确定一下浓度，浓度太低可定连不上

1：

在使用WashBuffer洗涤前，在柱子中加入少量（200ul）溶胶液。

室温3-5分钟后，离心。

再接标准洗涤及以后操作。

该操作针对胶块大的情况。

2：

加入WashBuffer后,静置1-3分钟后,再离心。

3：

增加WashBuffer的洗涤次数（少量多次）。

胶的残留导致的问题不是单纯的胶残留问题，同时也会导致溶胶液中盐的残留—这似乎对连接影响更大。

最好的解决方法是1；当然，可能会导致得率的小量下降，但质量绝对好。

为了充分去除残留，总结,1。

多加一步200ul溶胶液，2.加WashBuffer前空柱离心30sec，3。

WashBuffer洗涤时静置及多次

柱子允许胶通过的量是有限的,胶越多或是浓度太大,残留就会更明显,所以切胶时应该尽量要小,假如过大的话分到两个柱子里应该比较好，另外就是溶胶液宁可多加也不能少加

首先要保证待测质粒的纯度，除PCR外,可以对重组质粒做两个双酶切反应：

1。

ECoR I与Xh0 I双酶切; 2。

选一个插入片段中特异存在的切点酶和质粒ECoRI下游到Xba1间的合适位点酶（插入片段中没有的）,进行双切,结果可以预测到。

每个双切反应包括酶1单切，酶2单切，双切三个反应，别忘了以空载体做对照.试试看.如果没有得到重组质粒只好再连接反应了.

酶是TAKARA的,方法就是按说明书上做的，酶各1微升,buffer 2微升，质粒5微升,20微升体系.

遇到双酶切可是两个酶没有共用buffer时两种办法：

一是低盐buffer的酶先切，然后乙醇沉淀回收，然后高盐buffer的酶再切，乙醇沉淀或切胶回收。

 也可以低盐buffer的酶先切，作用时间（一般37℃孵育1小时或更长时间）充分后加高盐buffer的酶再切，然后乙醇沉淀或切胶回收。

通过摸索可以积累经验。

我记得NEB推荐BamHI和HindIII是分步切。

要将PCR片段连入表达载体中，选的是TaKaRa的BamHI和HindIII，请问这个双酶切是在37度反应还是30度，要酶切多长时间?

PCR片段比较难切吗,引物两端都各加了3个保护碱基?

参考见解：

一般37度2小时就行,在酶切时，由于你所选用的酶都是效率比较高的，酶切一个小时就已经足够了。

不过若不放心,过夜也没问题。

buffer需要共用buffer（比如Ybuffer）.PCR片段的酶切效率与引物两端所加保护碱基有很大关系.如果保护碱基加的恰当,酶切应该不成问题.PCR产物，由于浓度较低，并不难切，只是在连接转化时难以成功。

BamHI一般加CGGGATCCCG的酶切效率高达90%。

其它酶的具体情况可以查NEWENGLANDBioLabs的目录。

按newenglandbiolab的介绍，hindIII切割的时间较长，如果，直接切pcr产物再连接有时效率不高，导致转化效率低。

如果有条件的话，可以先做at克隆,再酶切。

TaKaRa的产品目录的A部分里有关于双酶切所用buffer的详细说明,最好依照执行。

怎么才能鉴定质粒有没有被双酶切？

参考见解：

酶切后作个质粒自连实验，在感受态、连接酶等没问题的情况下，如果没有菌落长出，说明双酶切是成功的。

当然，如果只长了很少的菌落，也是可以的。

如果长了很多的菌落，那说明酶切不完全,这时候就只有一个酶切位点切开了，质粒发生了自连。

目的片断与载体应该是摩尔数之比为3：

1～6：

1

可以在转化质粒时，以空质粒为对照这样来比较

酶切目的基因及质粒载体后加Loadingbuffer终止反应，然后要直接进行连接反应，可以吗?

要是不行，还有一种方法就是加热灭活限制酶（用的是Hind3/EcoR1双酶切）,多高温度适合啊?

参考见解:

1、一般直接用2倍体积的无水乙醇沉淀目的片段，干燥后直接用水溶解连接即可。

比较适用于载体和PCR产物的连接。

效果很好.

2、酶切后要胶回收后再连接,另外酶切结束后，直接电泳回收不用加终止液,对连接没有影响。

3、有的公司的限制酶（如NEB）是不需要热灭活的，而有的公司的限制酶（如MBI）则需要热灭活,一帮是65摄氏度，10分钟.然后经凝胶回收后再作连接，目的片段与质粒的摩尔比在3～10：

1的范围内连接效果都不错.

4、通常随酶附送的loadingbuffer是含有SDS起到灭活的作用,但在上样时会产生很多泡沫.

1、做双酶切的时候用的buffer都是根据公司提供的双酶切最适buffer,每个公司应该都提供双酶切使用的buffer列表。

2、酶切后电泳条带比较好，切胶回收的效果不好，可能是回收过程中操作出现问题，或者是回收试剂盒有问题。

可以尝试更换试剂盒做回收试试，或者看看酶切电泳后目的条带有没有弥散，如果有，切胶回收得不到好的效果。

3、用于连接的的片段应是单一的，如果将双酶切的质粒直接用于连接,即使得到了转化子，鉴定也比较麻烦，自己都不知道连上的到底是目的片段还是非目的片断。

最好用回收产物做连接。

4、酶切时如果质粒很大>7kb那么希望得到的600bp亮度相对vector太暗了，可能看不到，如果600的带看不到，可以试试加大酶切的质粒的量。

相同mol数600和4900的带亮度差别会很大。

5、如果酶没有问题那就要确定双酶切是否已经切开了，已经切开了，只是600bp比较弱的话,可以尝试加大酶切体系（如增大酶切体系为原来的两倍或三倍），酶切后乙醇沉淀富集酶切片断后用小体积TE溶解后电泳，效果可能有所改善。

如果根本就没有切开的话，那就要考虑是否是酶的问题,buffer的问题或质粒的问题。

将载体和目的片段（PCR扩增产物，约500bp，两端设有酶切位点）分别用EcoR1和BamH1双酶切后，定向连接。

但载体上该双酶切位点间有一个800bp的片段，酶切后电泳可见这一片段，表明酶切成功，胶回收了大片段。

连接转化成功后,挑选的单菌落提质粒,PCR鉴定表明有目的片段,约500bp，但双酶切却仍然是800bp的原片段长度。

目的片段不含有双酶切位点。

请问连接是否成功？

若成功了，为何会出现这种奇怪的现象？

参考见解：

如果pCR没有污染

1、假设挑选的是单菌落，则有可能是因为自己引物非特异扩增。

PCR比酶切更易出问题，相信酶切结果，没连上。

2、假如PCR没有问题，最可能是菌被污染,连上了,但有污染.这种可能性大。

假阳性产生的可能性极大。

3、最好重新挑科隆，摇菌。

如果不行再用通用引物确定是否没有连上。

4、应该使用载体引物来作PCR鉴定,因为自己的引物作很有可能出现假阳性。

5、片断是500bp的,而载体切下来的片断中含有800bp,是否是因为重组质粒的浓度太低,使得800bp的片断可以见到，而没有办法看见500bp的,所以建议将重组质粒酶切量增加，电泳时上样量增加。

6、可以看到800bp的片断，应该是载体自连接，因为插入片断后载体的酶切位点移