植物生长调节剂对南方红豆杉愈伤组织培养和紫杉醇合成的影响百解读.docx

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植物生长调节剂对南方红豆杉愈伤组织培养和紫杉醇合成的影响百解读

天然产物研究与开发NatProdResDev2006,18:

569-576

文章编号:

1001-6880（200604-0569-08

　收稿日期:

2005-05-27　　　接受日期:

2005-06-21

　基金项目:

湖南省自然科学基金项目（03JJY5017＊通讯作者Tel:

86-744-8231386;E-mail:

duyatian6688@163.com

植物生长调节剂对南方红豆杉愈伤组织培养和

紫杉醇合成的影响

杜亚填

1＊

陈建华2,许建宇1,曹　庸1,周朴华

3

（1.吉首大学湖南省林产化工工程重点实验室;2.吉首大学城乡资源与规划学院,张家界427000;

3.湖南农业大学生物科学与技术学院,长沙410128

摘　要:

通过不同种类和水平植物生长调节剂对南方红豆杉（Taxuschinensisvar.mairei愈伤组织诱导、生长和紫杉醇合成能力影响的研究发现:

诱导培养初期,以无植物生长调节剂的MS为基本培养基,在附加不同植物生长调节剂组合作用下愈伤组织产生的时间和生长、在相同植物生长调节剂组合作用下不同外植体愈伤组织的产生时间和生长均表现出较显著差异,2,4-D/NAA高于0.4时,不利于南方红豆杉愈伤组织的诱导。

转换到附加不同植物生长调节剂组合的B5培养基上后,随培养继代次数的增加,生长差异逐渐缩小,直至不显著,表明参考不同文献报道最优配方所设计的各植物生长调节剂组合对南方红豆杉愈伤组织的生长均较适宜,有利南方红豆杉愈伤组织生长的植物生长调节剂优化组合没有唯一性。

但不同调节剂组合作用下的同源愈伤组织中、相同调节剂作用下不同源愈伤组织中紫杉醇含量均存在着极显著差异,适当水平（2mg/L的2,4-D单用,或与适当水平的KT、6-BA、KT+GA配合使用,对南方红豆杉愈伤组织紫杉醇的合成较有利,NAA则不太有利,幼茎和叶愈伤组织产紫杉醇的水平较其它愈伤组织为高。

关键词:

植物生长调节剂;南方红豆杉;紫杉醇;愈伤组织培养中图分类号:

Q813.1+2;Q946.88　　

文献标识码:

A

InfluenceofPlantGrowthRegulatoronTaxuschinensisvar.mairei

CallusCultureandBiosynthesisofTaxol

DUYa-tian1＊,CHENJian-hua2,XUJian-yu1,CAOYong1,ZHOUPu-hua3

（1.ForestProductsChemicalIndustryEngineeringKeyLaboratoryofHunanProvince,JishouUniversity;

2.Town-villageResource&ProgramCollege,JishouUniversity,Zhangjiajie427000,China;3.Bioscience&BiotechnologyCollege,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China

Abstract:

Toexploretheinfluenceofdifferentkindsandconcentrationsofplantgrowthregulatorsoninduction,growthandbiosynthesisabilityoftaxolofTaxuschinensisvar.maireicallus,variousexplantsofT.mairei,includingyoungstem,youngstemsbark,cambium,immatureneedle,apicalmeristemwererespectivelyinoculatedon8kindsofcallus-inductionmediumcontainingMSbasalsaltsandvitamins,2%sucroseanddifferentkindsofplantgrowthregulatorswithdifferentconcentrations,andwereinducedtoproducecallusandculturedfor3ages（about29day.age-1,thenthecalluseswererespectivelytransferedon8kindsofcallus-multiplicationmediumcontainingGamborgB5basalsaltsandvitamins,3%sucroseanddifferentkindsofplantgrowthregulatorswithdifferentconcentrations.TaxolcontentofvariouscalluscultureswereanalysedbyHPLCwhensub-culturedfortwoages（60day.Theresultshows:

forinitialstagesofinducingculture,thedifferencesbetweenthetimeofpro-ductingcallusandthegrowthvalueofcallusweresignificantwhenthesamecalluswasculturedindifferentmediumcontainingvariousregulatorcombination,orwhendifferentcalluswereculturedonthesamemediumcontainingcertainregulatorcombina-tion.TheinductionrateofT.maireicalluswouldbereducedwhentheconcentrationof2,4-DtotheconcentrationofNAAishigherthan0.4.However,forfollowingfrequentsubculturing,whenthesecallusesweretransferredon8kindsB5callusmuliti-

DOI:

10.16333/j.1001-6880.2006.04.010

plicationmedium,theabovedifferenceswouldbegraduallydeminishedtillinsignificant.Theseresultssuggestedthatallthereg-ulatorcombinationsincallus-multiplicationmediumdeterminedbasedontheoptimizationdirectionsinreference,werebeneficialtothegrowthofT.maireivariouscallus,i.e..TherearemanyoptimizedcombinationsofplantgrowthregulatorsuitableforthegrowthofT.maireicallus.Nevertheless,thereweresignificantdifferencebetweentaxolcontentinthecalluses,whenthesamecalluswasculturedondifferentmediumcontainingvariousplantgrowthregulatorcombination,orwhendifferentcalluswerecul-turedonthesamemediumcontainingthecertainregulatorcombination.Properconcentrationof（2mg/L2,4-Dusedindepen-dently,orproperlysupplementedwithKT,6-BAorKT+GA,benefitthebiosynthesisoftaxolinT.maireicallus,butNAAisnot.Thebiosynthesisoftaxolinyoungstemandleafcallusarehigherthaninotherexplantcalluses.Keywords:

plantgrowthregulator;Taxuschinensisvar.maire;taxol;callusculture

　　南方红豆杉（Taxuschinensis（Pilg.Rehd.var.mairei（LemeeetLevl.ChengetL.K.Fu.又称美丽红豆杉为红豆杉科（Taxaceae红豆杉属（Taxus在中

国的1个变种[1]

经研究发现其枝、皮、叶、根和果肉中均含有紫杉醇[2],故以其组织和细胞培养生产紫杉醇的研究报道较多,但未见有关植物生长调节剂种类和水平对其愈伤组织诱导、生长和愈伤组织合成紫杉醇影响的系统研究报道[3-12]。

所以,我们以其幼茎、较成熟幼茎皮、形成层、幼叶、顶端分生组织为原始诱导材料,以MS附加不同水平和组合的2,4-D、NAA、KT、6-BA为愈伤组织诱导培养基,以B5附加不同水平和组合的2,4-D、NAA、KT、6-BA、GA为生产培养基,结合HPLC法检测,对该方面进行了比较系统的研究,以探索植物生长调节物质对植物次生代谢的调控作用,为组织或细胞大量培养工业化生产紫杉醇提供基础。

1　材料与方法

1.1　南方红豆杉愈伤组织诱导、培养1.1.1　外植体

原始外植体:

南方红豆杉幼茎、较成熟幼茎皮、形成层、幼叶、顶端分生组织均自本室资源收集圃所采南方红豆杉（1996年引种于桑植八大公山自然保护区所培育约7年生苗春梢（茎皮为绿色上获得。

1.1.2　外植体消毒

将野外材料洗净后分剪成较成熟幼茎、嫩枝、带幼叶枝梢三个部分,然后分别进行表面消毒处理。

将带幼叶枝梢先用自来水冲洗干净,晾干表面水后,分别用75%酒精浸泡5s、0.1%HgCl浸泡20min,无菌水清洗7次后备用;将较成熟幼茎和嫩枝先用自来水冲洗2h,晾干表面水后分别用75%酒精浸泡15s、0.1%HgCl浸泡20min,无菌水清洗7次后备用。

11,2

1.1.4　无菌接种

茎段:

将已经消好毒的幼茎切去其上叶片,再切成0.5cm长的小段接入诱导培养基中。

较成熟幼茎皮:

将已消好毒的较成熟幼茎用手术刀小心刮去表面栓皮,后剥取周皮,将皮切成约0.5×0.5cm小块接入诱导培养基中（注意剥取周皮时不要伤及形成层,裸茎杆留作削取形成层用。

形成层:

用手术刀小心切削剥皮后裸茎上的表面形成层组织,然后切成小块接入培养基。

发育未成熟幼叶:

将已消毒带幼叶枝梢上发育未成熟幼叶自叶柄基部切下,后切成0.5cm长小段接入诱导培养基中。

顶端分生组织:

用尖头镊子从取过幼叶的枝梢顶端挑取顶端分生组织,接入诱导培养基中。

接种量:

每一个处理接5瓶（5个重复,每瓶接5块外植体,共计有40组实验、200个重复、约1000个外植体。

1.1.5　培养

暗诱导培养:

温度25±1℃、湿度85%±5%和温度23±1℃、湿度80%±5%条件下各暗培养12h交替进行,诱导培养7d。

弱光诱导培养:

经暗培养7d后,转为每天白天温度25±1℃、湿度85%±5%、光照1000～1200Lx弱光,夜晚温度23±1℃、湿度80%±5%黑暗条件下12h。

1.1.6　观测记录与数据处理

诱导时间:

外植体接入诱导培养基后每天观察一次,每个处理5个重复中第1块外植体长出愈伤组织所需时间即为该处理的愈伤组织诱导时间。

计算愈伤组织诱导率的公式:

愈伤组织诱导率（%接入外植体个数-被污染外植体个数

×100%

在继代培养前观察记录愈伤组织的颜色、形状和生长状态。

570天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.18

表1　愈伤组织诱导培养基Table1　Callus-inductionmedium

MediumnumberBasemedium2,4-Dmg/L6-BA

mg/LGA3

mg/LKT

mg/LNAA

mg/LSucrose

g/LAgarg/LpHvalueMS1[13]MS3.0----2085.8MS2[13]MS----3.02085.8MS3[13]MS2.0---0.52085.8MS4[13]MS0.5---3.02085.8MS5[16]MS1.5--0.5-2085.8MS6[17]MS--0.50.13.02085.8MS7[14]MS1.22.8--3.02085.8MS8[14]

MS

1.2

2.8

--4.0

20

8

5.8

表2　生产培养基Table2　Productionmedium

Medium

numberBasemedium2,4-Dmg/L6-BA

mg/LGA3

mg/LKT

mg/LNAA

mg/LCH

g/LCoconut

mL/LSucroseg/LAgarg/LpHvalueC1[18]B52.0------3085.8C2[19]B52.00.1---1.0-3085.8C3[13]B52.0---0.5--3085.8C4[16]B52.0--0.5-1.01003085.8C5[13]B50.5--0.51.0--3085.8C6[20]B52.0-0.51.0---3085.8C7[16]B51.5--0.5-1.01003085.8C8[17]

B5

---0.1

3.0

--30

8

5.8

1.2　南方红豆杉愈伤组织增殖继代培养

选取在8种诱导培养基（表1上诱导、继代培养了3代以上、黄绿色、生长旺盛、结构疏松、大小一

致的5种外植体来源愈伤组织,在无菌条件下转接到8种生产增殖培养基（表2上进行增殖继代培养,每一个处理接5瓶（5个重复,每瓶接5块愈伤组织,共计有40组实验、200个重复、约1000块愈伤组织,接入的每块愈伤组织大小基本保持一致。

1.2.1　生产增殖培养

于25±1℃、湿度85%±5%,1000Lx左右光下12h,23±1℃、湿度80%±5%,黑暗12h,连续循环培养2代（每代培养30d。

1.2.2　观测记录与数据处理

愈伤组织块直径月平均生长量:

经诱导培养基诱导培养所获得愈伤组织继代接入生产增殖培养基后每三天观测一次（共观测10次,用直尺量取每块愈伤组织最大方向上的直径Dd+2（mm,5瓶共25块愈伤组织每3d第3d最大方向直径的和为∑Dd+225

若前一次观测的和为∑Dd25

则∑Dd+225

-∑Dd25即为当次观测每处理5重复25块愈伤组织直径3,组织直径的月均生长量的公式:

月均增长量∑（∑Dd+225-∑Dd2510

25（或每处理愈伤组织总块数mm　　同时观察记录愈伤组织的颜色、形状和生长状态。

1.3　紫杉醇含量检测1.3.1　材料

将在生产培养基上继代培养了2代的愈伤组织按来源和处理不同分别收集冻藏待测。

1.3.2　紫杉醇标准溶液的配制

用十万分之一天平准确称取紫杉醇对照品2.94mg,用甲醇（色谱纯溶解定容至10mL备用。

1.3.3　HPLC检测[15-19]

色谱柱:

SciencehomeC18（4.60×250mm,5μm;流动相:

甲醇∶乙腈∶水（25∶35∶45,v/v/v;进样量:

5μL（未经处理对照品为1μL;灵敏度:

0.01Aufs;流速:

1mL/min;柱温:

40℃;检测波长:

227nm。

1.4　仪器与试剂

1.4.1　仪器设备

LC-9A高效液相色谱仪（日本岛津;SPD-6AV;R-571

Vol.18杜亚填等:

植物生长调节剂对南方红豆杉愈伤组织培养和紫杉醇合成的影响　

本;UC-55N恒温水浴（日本;AEL-4OSM十万分之一天平（日本岛津;冷冻干燥器;FD-230型红外水分计（日本;生长室（LPH-300;无菌操作台（CCV-1311;高压蒸汽灭菌锅（SM-52;干热灭菌箱（SG-62;过滤装置;萃取装置。

1.4.2　试剂与药品

除HPLC检测所用试剂与药品为色谱纯外,其

余均为分析纯。

紫杉醇对照品购于中国药品生物制品检定所。

2　结果与分析

2.1　植物生长调节剂对南方红豆杉愈伤组织诱导培养的影响

2.1.1　对诱导时间的影响（表3

表3　植物生长调节剂对愈伤组织诱导时间的影响Table3　Influenceofplantgrowthregulatorsonthecallusinducedtime

培养基中植物生长调节剂的组合与水平

Concentrationofplantgrowthregulatorsinmedium

愈伤组织诱导所需天数Callusinducedtime（day

Youngstems

BarkCambiumNeedleApicalmeristem

MS1:

MS+3mg/L2,4-D1310-66MS2:

MS+3mg/LNAA

1314-118MS3:

MS+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA1341-118MS4:

MS+0.5mg/L2,4-D+3mg/LNAA99-217MS5:

MS+1.5mg/L2,4-D+0.5mg/LKT2619-74MS6:

MS+3mg/LNAA+0.1mg/LKT+0.5mg/LGA31244-118MS7:

MS+1.2mg/L2,4-D+3mg/LNAA+2.8mg/L6-BA1747-3217MS8:

MS+1.2mg/L2,4-D+4mg/LNAA+2.8mg/L6-BA

9

12

-13

7

　　结果显示,植物生长调节剂各组合对南方红豆杉幼茎和较成熟幼茎皮的影响比较一致,2,4-D与NAA适当的组合较有利二者愈伤组织的快速诱导,似乎与2,4-D/NAA的比值有关,组合为2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA（比值为4时的明显不如组合为0.5mg/L2,4-D+3mg/LNAA（比值约为0.17,在有6-BA存在时差异更加明显（MS7与MS8,较低的

该比值（0.16～0.3较为有利。

较高的2,4-D（MS1:

3mg/L、或较低的2,4-D（MS5:

1.5mg/L适当增补KT（0.5mg/L均较有利于幼叶愈伤组织的诱导,NAA对幼叶愈伤组织的快速诱导不太适合。

顶端

分生组织启动最快,较低水平的2,4-D或NAA对其起动更有利,这可能与其本身的内源生长素水平较高有关。

形成层组织在各组合的作用下均未启动,可能是取材不当所致。

总的看来,2,4-D/NAA高于

0.4时（MS7,不利于南方红豆杉愈伤组织的诱导。

2.1.2　对诱导率的影响（表4

结果与2.1.1的相接近,诱导率的结果进一步证明,2,4-D/NAA的组合对南方红豆杉愈伤组织的诱导影响较大,其比率大小应据材料不同而定。

3mg/L2,4-D条件下幼茎的诱导率只有5%的结果,是非正常现象,可能是材料和接种的原因所致。

表4　植物生长调节物质对诱导率的影响

Table4　Influenceofplantgrowthregulatorsonpercentageofcallusinduced

培养基中植物生长调节剂的组合与水平Concentrationofplantgrowthregulatorsinmedium愈伤组织诱导率Percentageofcallusinduced（%

StemsBarkCambiumNeedleApicalmeristem

MS1:

MS+3mg/L2,4-D5.00100.00-93.33100.00MS2:

MS+3mg/LNAA

100.000-93.33100.00MS3:

MS+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA100.0075.00-100.00100.00MS4:

MS+0.5mg/L2,4-D+3mg/LNAA100.0071.40-62.96100.00MS5:

MS+1.5mg/L2,4-D+0.5mg/LKT

100.0077.78-100.0083.33MS6:

MS+3mg/LNAA+0.1mg/LKT+0.5mg/LGA3100.00100.0-93.33100.00MS7:

MS+1.2mg/L2,4-D+3mg/LNAA+2.8mg/83.33

-43.43

100.00

L6-BA

MS8:

MS+1.2mg/L2,4-D+4mg/LNAA+2.8mg/100.00

100.00

-86.21

100.00

L6-BA

572天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.18

2.1.3对愈伤组织生长状况的影响（表5

表中所示结果与上述诱导率结果基本相对应,

除深褐色外,其它生长状态均为