ELISA测定错误结果的原因分析.docx
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ELISA测定错误结果的原因分析
ELISA测定错误结果的原因分析
ELISA即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。
Engvall和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定，并命名为"enzymelinkedimmunosorbentassay（ELISA）"。
ELISA的基本原理是：
①使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；
②使抗原（或抗体）与某种酶联结成酶标抗原（或抗体），而且此酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；
③测定时将受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原（或抗体）按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体进行反应，再用洗涤方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检的抗体或抗原量成一定比例；再加入酶反应底物后，底物被酶催化后变为有色产物，根据其颜色反应的深浅进行定性或定量分析，以了解被测标本中抗体或抗原含量。
ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。
但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。
引起ELISA测定错误结果的原因主要有：
①标本因素；
②试剂因素；
③操作因素。
本文就标本因素对ELISA测定的影响做如下讨论。
血清是最常用的
ELISA标准操作及技术服务的常见问题分析
一.ELISA标准操作要点
优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。
ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的本公司要求使用的纯化水电导率小于1.5μs/cm。
1.标本的采取和保存
大部分ELISA检测均以血清为标本。
血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。
如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。
一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深。
超过一周测定的需－20℃保存。
冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。
混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。
反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。
保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。
抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。
2.加样
加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。
3.保温
在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经
1-2小时，产物的生成可达顶峰。
为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。
应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。
由于公司的试剂盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值偏高或花板。
另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘位置。
4.洗涤
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。
ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。
通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。
聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。
可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。
聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。
洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
洗板时注意各种试剂盒的洗液不要混用。
如果洗液需要稀释，应按要求稀释，所用的水电导率最好在1.5us/cm之下，洗液如果结晶应待其融解后配制。
保证洗板浸泡时间为40秒左右，孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好，手工洗板防止洗液在孔内形成气泡。
5.显色和比色
TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。
TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。
这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。
此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。
酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。
酶标仪的主要性能指标有：
测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。
优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。
酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。
测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。
有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不移动ELISA板的位置，最终测得的A值为两者之差（W1-W2）。
双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。
二.本底及假阳性产生的原因分析
1.基因工程抗原与合成肽抗原的区别
1.1基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。
该类抗原与合成肽相比具有以下特点：
a.分子量大。
合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。
b.稳定性好。
包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的试剂盒效期只有3-4个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。
c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高试剂盒的灵敏度，提高检出率。
d.纯化难度大。
基因工程抗原的纯化技术难度较大。
1.2合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。
合成肽抗原有以下特点：
a.分子量太小
b.一般只含有一个抗原决定簇
c.纯度高
d.稳定性差
由于基因工程抗原较于合成肽抗原有无可比拟的优越性，ELISA诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。
就HCVELISA试剂盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，主要是HCV特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV特异性抗原。
第三代试剂的敏感度大大提高了。
由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA反应试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。
值得欣慰的是也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度，科学得对待反应结果。
2．假阳性本底产生的原因
2.1抗原因素
2.1.1融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响。
以丙肝诊断试剂盒为例为例，因为包被的基因工程抗原为融合蛋白，包含了来自表达载体的一些序列，因此可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本。
ELISA中常见问题及解决方法
ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。
我将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。
下面分析Elisa试验操作中可能影响结果的原因，并给出相应的解决办法
1选择试剂选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。
2加样可能原因：
1）血清或血浆标本分离不好即进行加样；2）手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长（特别是室内温度较高时）；3）加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。
解决办法：
1）标本为血清：
最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：
必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。
2）加样后及时放入孵箱。
3）加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
4）如果采用AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。
5）标本较多时，请分批操作。
3孵育可能原因：
1）孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；2）孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。
解决办法：
1）贴封片或加盖；2）按说明步骤严格控制操作时间。
4洗板可能原因：
1）采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。
2）采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。
3）反应板过多造成洗板等待时间长。
解决办法：
1）保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干；2）合理安排，或多用几台洗板机。
5显色可能原因：
1）显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂；2）加显色剂时溅出孔外造成液体回流。
解决办法：
1）显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用；2）加样时保持显色剂不外流；3）A、B液应避免接触金属器械。
6终止可能原因如加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。
所以在加终止液时应避免产生气泡。
7读板如读板时板底不清洁等。
应保证酶标板清洁。
所以在整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸;尽可能实现ELISA检测标准自动化，有效提高检测质量。
在实际操作中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时作好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。
现在国内已有相当数量的单位拥有全自动酶标仪，这对于实现ELISA标准化检测、提高检测质量起到了重要作用
体外诊断试剂-超级ELISA优化方案
竞争抑制ELISA方法的建立
3.1抗体的酶标记及质量鉴定
本试验采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记在抗体上[1]，标记完后取上清用SephedexG200凝胶层析进行纯化，洗脱液为0.2mol/LpH7.4的PBS，流速为15ml/h，分步收集，每支3ml，以紫外分光光度计测A280吸光度值，以洗脱体积为横坐标，吸光值为纵坐标做图，收集第一峰即为酶标抗体峰。
标记完后用紫外分光光度计在分别在280nm、及403nm处测定酶标记物的A值，计算免疫球蛋白量、摩尔比值、酶结合率以及标记率。
3.2包被用缓冲液及最适包被抗原浓度的优化
3.2.1包被缓冲液的优化
包被抗原时，为了得到最佳的包被效果，我们采用了碳酸盐缓冲液（50mMph9.6）、磷酸盐缓冲液（50mMph7.6）、以及TRIS盐酸缓冲液（50mMph7.6）三种缓冲液作为包被液，抗原包被浓度为5ug/ml，及2.5ug/ml,酶标抗体工作浓度为1：
400及1：
300，用自动酶标仪分析，选择最佳的包被缓冲液系统（表5）。
同时为了保证缓冲液能够长期保存，我们在包被液中添加了0.01%的硫柳汞作为防腐剂。
3.2.2最适抗原包被浓度的优化
用优化好的包被缓冲液，将包被抗原（ALB）稀释成0.1ug/ml，1.0ug/ml，2.0ug/ml，4.0ug/ml，6.0ug/ml，8.0ug/ml，10.0ug/ml等六个浓度，包被微孔板，每孔100ul；竞争抗原浓度为4.0ug/ml，2.0ug/ml；酶标抗体稀释度为1：
300，经孵育、显色、终止后用自动酶标仪分析（表6）。
显色的强度在一定范围内与包被的抗原量成正比，但随着包被抗原浓度的增加，显色的强度反而降低，我们选择临界包被值作为包被抗原量。
3.3封闭液、洗涤液及保护液的优化
3.3.1封闭液的优化
采用文献报道的方法进行封闭，其封闭液的组成为：
10mM磷酸盐缓冲液含1%的牛血清白蛋白（BSA）。
3.3.2洗涤液的配制
采用文献报道的方法配制洗涤液。
3.3.2酶标板保护液的优化
酶标板经过封闭后在低温下仅能存放2周左右，为了延长固相酶标板上抗原的稳定性，我们增加了一步保护酶标板的程序。
在10mM的磷酸盐中加入适量的糖、无关蛋白质、庆大霉素以及二价金属离子，作为酶标板保护剂，在封闭完后加入保护液于4℃冰箱中孵育过夜，同时与未做保护的酶标板进行对照，然后将保护的及未保护的酶标板置于37烘箱中放置15天，考察保护液对酶标板的稳定性的影响。
3.4酶标抗体稀释度的优化
抗原包被浓度为4ug/ml,将酶标抗体做系列稀释：
1：
100，1：
200；1：
300；1：
400；1：
500；1：
600；1：
1000；经孵育、洗涤后、显色终止后，用自动酶标仪分析（表7），选择A值为1.5左右的酶标抗体稀释度为最适工作浓度。
3.5酶标抗体保护液的优化
低浓度的酶标抗体极容易受到高温、微生物、以及蛋白酶的影响而失活，严重影响产品的货架期，过去通常将酶标抗体冻干保存，然而这样的保存，不仅由于在冻干的过程中会影响酶标抗体的活性，而且在临床应用中颇为不便。
适当的缓冲液以及添加无关蛋白质、糖、防腐剂以及一些含氨基的化合物等都会对对酶标抗体的活性起一定的保护作用，因此我们设计了一组保护剂用于保护酶标抗体，与未添加任何糖蛋白的酶标抗体做对照，将经保护的酶标抗体及未保护的酶标抗体置于37℃烘箱中放置6天，考察保护液对酶标抗体的影响。
3.6底物液的优化
常用的作为酶联免疫吸附试剂有OPD和TMB系统，由于OPD有致癌的危险性以及用前需要溶解等诸多缺点，因此我们选用TMB作为底物系统，采用文献报道的方法：
取适量的TMB溶解在DMSO中，然后加入适量的超纯水，配制作为底物B液；溶解适量的过氧化氢尿素于100mM磷酸-柠檬酸缓冲液中，配制作为底物A液，用前将底物A液及底物B液等体积混合。
在文献报道的基础上，我们适当调整了TMB的用量以及过氧化氢尿素的用量，并加入了酶促进剂，与文献报道的底物进行比较。
实验方案为：
将活化的辣根过氧化物酶分别作1：
1000；1：
10000；1：
100000；1：
200000；1：
400000；1：
800000等系列稀释，比较两种不同配方的底物的灵敏度（表10）。
3.7标准品及样品稀释液
我们采用10mM的磷酸盐缓冲液内含0.5%的BSA作为标准品及样品的稀释液。
3.8抗原抗体反应时间的优化
抗原抗体反应会随着时间的增加，反应量也增加，但达到一定的时间后，反应即达到平衡，我们取反应10min，20min，30min，40min，50min，60min，
70min,90min等8个点进行比较（表11），以确定最佳抗原抗体反应时间。
3.9底物作用时间的优化
在其它条件相同的情况下，我们取5min,10min,15min,20min,25min,30min,35min
40min,50min,60min,80min等11个时间点进行比较（表12），确定最佳的底物作用时间。
3.10剂量反应曲线的建立及曲线拟合方式的确定
在其他参数均已经优化完成的情况下，将抗原标准品用标准品稀释液依次稀释为：
160mg/L,80mg/L，40mg/L，20mg/L，10mg/L，5mg/L，2.5mg/L，1.25mg/L，0.625mg/L，
0.3125mg/L，0.156mg/L，0.780mg/L等12个稀释度，同时设置阴性和空白对照，加入已包被好抗原的酶标板中，同时加入酶标抗体，经孵育、显色、终止后用自动酶标仪分析（表12），采用文献报道的4P对数拟合曲线
ELISA原理与分类
1.ELISA的原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
2. ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有三个必要的试剂：
（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；
（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。
根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：
2.2.1 双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。
洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2）加受检标本，保温反应。
标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
3）加酶标抗体，保温反应。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4）加底物显色。
固相上的酶催化底物成为有色产物。
通过比色，测知标本中抗原的量。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。
只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。
如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。
这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。
类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同（参见1.3.2，图1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hookeffect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。
钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。
因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。
用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。
但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。
RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。
用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。
采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。
双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
2.2.2双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。
用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。
与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。
此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。
乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。
本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
2.2.3间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。
其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图2-3）。
操作步骤如下：
1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2）加稀释的受检血清，保温反应。
血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
3）加酶标抗抗体。
可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。
固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
4）加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。
虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。
特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。
抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。
另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。
病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。
IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。
因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。
另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:
40~1:
200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。
2.2.4竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。
其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。
标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。
如抗原为高纯度的，可直接包被固相。
如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原
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