植物生理指标检测方法.docx
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植物生理指标检测方法
植物组织中可溶性糖含量的测定
在作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。
它们在营养中的作用主要有：
合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为NH3的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。
由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。
Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖
一、原理
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。
该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。
在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。
但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。
此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。
糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为620nm，故在此波长下进行比色。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
任何植物鲜样或干样。
（二）试剂
1.80％乙醇。
2.葡萄糖标准溶液（100μg/mL）：
准确称取100mg分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100mL，使用时再稀释10倍（100μg/mL）。
3．蒽酮试剂：
称取1.0g蒽酮，溶于80%浓硫酸（将98%浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中）1000mL中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用2～3周。
（三）仪器设备
分光光度计，分析天平，离心管，离心机，恒温水浴，试管，三角瓶，移液管（5、1、0.5mL），剪刀，瓷盘，玻棒，水浴锅，电炉，漏斗，滤纸。
三、实验步骤
1.样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品0.5～1.0g（或干样粉末5～100mg），放入大试管中，加入15mL蒸馏水，在沸水浴中煮沸20min，取出冷却，过滤入100mL容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。
2.标准曲线制作取6支大试管，从0～5分别编号，按表24-1加入各试剂。
表24-1蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量
试剂
管号
0
1
2
3
4
5
100μg/mL葡萄糖溶液（mL）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（mL）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
蒽酮试剂（mL）
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
葡萄糖量（μg）
0
20
40
60
80
100
将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮10min，取出冷却，在620nm波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（μg）为横坐标绘制标准曲线。
3．样品测定取待测样品提取液1.0mL加蒽酮试剂5mL，同以上操作显色测定光密度。
重复3次。
四、结果计算
溶性糖含量（％）＝从标准曲线查得糖的量（μg）×提取液体积（ml）×稀释倍数/[测定用样品液的体积（ml）×样品重量（g）×106]×100
式中：
C——从标准曲线查得葡萄糖量，μg。
VT——样品提取液总体积,mL。
V1——显色时取样品液量，mL。
W——样品重（g）。
植物体内可溶性蛋白质含量的测定
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。
在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位/mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。
因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。
常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。
本实验将分别介绍这两种方法。
1．考马斯亮蓝法
一、实验原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。
在一定蛋白质浓度范围内（0-100μg/mL），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。
故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。
二、实验材料、仪器和试剂
1.材料
小麦叶片或其他植物组织
2.仪器设备
分光光度计，离心机，研钵，25mL容量瓶1个，刻度吸管0.5mL2支，2mL1支，10mL试管3支。
3.试剂
（1）牛血清白蛋白配成1000μg/mL和100μg/mL。
（2）考马斯亮蓝G-250：
称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100mL，最后用蒸馏水定容至1000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
（3）90%乙醇
（4）磷酸（85%，W/V）
三、实验步骤：
1.可溶性蛋白的提取
称取新鲜植物叶片0.5g置于研钵中，加入5mL4oC下预冷的浓度为50mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10mL离心管中，在4oC冰箱中静置10min，于15000rpm/min下冷冻离心25min，上清液即为过氧化物粗提液。
4oC下保存备用。
2.标准曲线的绘制
（1）0-100μg/mL标准曲线的制作
取6支试管，按下表数据配制0-100μg/mL血清白蛋白液各1mL。
准确吸取所配各管溶液0.1mL，分别放入10mL具塞试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。
配制0-100μg/mL血清白蛋白液
管号
1
2
3
4
5
6
100μg/mL牛血清蛋白量（mL）
蒸馏水量（mL）
蛋白质含量（mg）
0
1.0
0
0.2
0.8
0.02
0.4
0.6
0.04
0.6
0.4
0.06
0.8
0.2
0.08
1.0
0
0.10
（2）0-1000μg/mL标准曲线的制作
另取6支试管，按表10-2数据配制0-1000μg/mL牛血清白蛋白溶液各1mL。
与步骤
（1）操作相同，绘出0-1000μg/mL的标准曲线。
配制0-1000μg/mL血清蛋白血液
管号
7
8
9
10
11
12
1000μg/mL牛血清白蛋白（mL）
蒸馏水量（mL）
蛋白质含量（mg）
0
1.0
0
0.2
0.8
0.2
0.4
0.6
0.4
0.6
0.4
0.6
0.8
0.2
0.8
1.0
0
1.0
3.样品提取液中蛋白质浓度的测定
吸取样品提取液0.1mL（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。
四、
结果计算与分析
样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=
式中C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；
V－提取液总体积（mL）；
a－测定所取提取液体积（mL）；
W－取样量（g）。
叶绿素测定方法
1、称取剪碎叶片0.2g，放入容量瓶。
2、加50ml95%的乙醇。
3、遮光浸提48-72小时，中间摇晃一次。
（保证各批次浸提时间一致）
4、分光光度计测吸光值，三波长（649，665，470），分别对应叶绿素a、b和其他。
空白为95%乙醇。
计算公式如下：
CA=13.95*D665-6.88*D649
C单位：
mg/L
叶绿素a=CA*0.05/2
叶绿素单位：
mg/g
CB=24.96*D649-7.32*D665
叶绿素b=CB*0.05/2
C其他=（1000*D470-2.05*CA-114.8CB）/245
叶绿素其他=C其他*0.05/2
总叶绿素含量为三者之和。
一般叶绿素a/b为3：
1至4：
1
选择的波长不一样，计算公式就不一样，网上也有其他的波长方法，计算公式里的系数响应也有差异。
淀粉含量的测定
原理
淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，测定葡萄糖含量，根据葡萄糖含量换算成淀粉含量
（C6H12O6）n→（C6H10O5）n+nH2O
糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关。
在625nm波长下的OD值与糖含量成正比。
由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色
仪器用具和试剂
1.仪器用具：
移液枪、10ml离心管、试管、50ml容量瓶、试管架、棕色瓶（>=500ml）、螺口瓶（>=500ml）、烧杯、移液管（连续加样器）、离心机、分光光度计；
2.试剂：
葡萄糖标准液Ⅰ：
精确称取0.1000g蔗糖（分析纯），于小烧杯中加水溶解，定容至100ml，加2-3滴浓H2S04，该溶液可长期保存；
葡萄糖标准液Ⅱ:
准确吸取1mg/ml的蔗糖标准液5ml，加水定容量50ml，得到浓度为0.1mg/ml蔗糖标准液；
蒽酮溶液：
100mg蒽酮溶于50ml浓H2S04（化学纯）中，避光保存，当天配制当天使用；
3mol/LNaOH溶液：
12g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；
3mol/LHcl溶液：
25ml浓盐酸与75ml蒸馏水混匀。
测定方法
1.植物淀粉相关溶液的提取：
向测可溶性糖所剩残渣中加入7ml3mol/L的盐酸，在沸水浴中煮沸45分钟，取出冷却，4000转/分离心15分钟，取上清到50ml容量瓶中，加入7ml3mol/LNaOH，用蒸馏水定容到50ml，作为待测样品。
2.标准曲线的配制：
吸取0.1mg/ml葡萄糖标准液按下表加入至11支试管：
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.1mg/ml葡糖（ml）
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
蒸馏水（ml）
2
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
葡糖浓度（mg/ml）
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
0.1
蒽酮试剂（ml）
8.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
45℃水浴中显色10~15分钟，625nm处测OD值
3.准确吸取待测液1.0ml，加蒽酮4.0ml，在45℃水浴中显色10-15分钟，各管在加入蒽酮试剂时要迅速，加完后用力振荡混匀。
4.取出后避光冷却，在625nm处测OD值，从标准曲线上得到提取液中可溶性总糖含量。
结果计算
葡萄糖糖含量（%）=标准曲线对应含糖量×定容体积×100／（样品质量×显色吸取液体积×103）
粗淀粉含量（%）=葡萄糖含量×0.9
强酸溶液，注意安全
超氧化物歧化酶（SOD）的测定
一、实验原理
超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD，EC1.15.1.1）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧自由基O2·ˉ，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O2·ˉ，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性的大小。
二、实验材料、仪器和试剂：
1.材料
小麦叶片或其他植物组织
2.仪器设备
高速离心机；分光分度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处理度为4000Lx）；试管或指形管数支。
3.试剂
（1）1.50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。
（2）2.130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：
称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100mL。
（3）3.750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：
称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100mL，避光保存。
（4）4.100μmol/LEDTA-Na2溶液：
称取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000mL。
（5）5.20μmol/L核黄素溶液：
称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000mL避光存。
三、实验步骤：
1.显色反应
取5mL指形管数支，测定管数目依据处理而定，另4支为对照管，按表2依次加入下列各溶液对照管用缓冲液代替酶液，蒸馏水0.25mL。
将其中2支对照管置于暗处，其它置于4000Lx日光下反应20min左右，主要看颜色的变化，全部变成灰色，对照可能较浅。
2.测定
待反应结束，以不照光的对照管做空白，依次测定其它各管的吸光值。
表2各溶液显色反应用量
试剂（酶）
用量（mL）
终浓度（比色时）
0.05mol/L磷酸缓冲液
1.5
130mmol/LMet溶液
0.3
13mmol/L
750μmol/LNBT溶液
0.3
75μmol/L
100μmol/LEDTA–Na2液
0.3
10μmol/L
20μmol/L核黄素
0.3
2.0μmol/L
酶液/缓冲液（对照）
0.1
对照管以缓冲液代替酶液
蒸馏水
0.2
总体积
3.0
四、结果计算与分析
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。
SOD总活性
SOD比活力
式中：
SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。
比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
Ack—照光对照管的吸光度。
AE—样品管的吸光度。
VT—样品液总体积，mL。
Vt—测定时样品用量，mL。
W—样品鲜重，g。
蛋白质含量单位为mg/g。
五、注意事项
1.配好的Met溶液须在4℃冰箱中保存备用，以防止Met活性损失。
2.配好的NBT溶液须放入棕色试剂瓶，并在4℃冰箱中保存备用，以防止NBT见光分解。
3.配好的核黄素溶液须放入棕色试剂瓶避光保存。
六、思考题
1.在SOD测定中为什么设照光和暗中两个对照管?
2.影响本实验准确性的因素是什么?
应如何克服?
实验六植物抗氧化酶活性的测定
酶液的提取
称取新鲜植物叶片0.5g置于研钵中，加入5mL4oC下预冷的浓度为50mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10mL离心管中，在4oC冰箱中静置10min，于15000rpm/min下冷冻离心25min，上清液即为过氧化物粗提液。
4oC下保存备用。
1．过氧化氢酶（CAT）的活性测定
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而导致H2O2累积。
H2O2可以直接或间接地氧化细胞内的核酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。
过氧化氢酶可以清除植物体内的H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。
因此，植物组织中过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。
一、实验原理
H2O2在240nm波长下有强吸收，过氧化氢酶（Catalase,CAT,EC1.11.1.6）能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。
根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
二、实验材料、仪器和试剂
1.材料
小麦叶片或其他植物组织
2.仪器设备
紫外分光光度计，离心机，研钵，25mL容量瓶1个，刻度吸管0.5mL2支，2mL1支，10mL试管3支，恒温水浴锅。
3.试剂
（1）0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）。
（2）0.1mol/LH2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。
三、实验步骤：
取10mL试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管（将酶液煮死），按表1顺序加入试剂。
表1紫外吸收待测样品测定液配制表
试剂（酶）
管号
S0
S1
S2
粗酶液（mL）
0.2
0.2
0.2
pH7.8磷酸缓冲液（mL）
1.5
1.5
1.5
蒸馏水（mL）
1.0
1.0
1.0
25oC预热后，逐管加入0.3mL0.1mol/L的H2O2，每加完1管立即计时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔lmin读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，计算酶活性。
四、结果计算与分析
以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（µ）。
过氧化氢酶活性
式中：
ΔA240——AS0–（AS1+AS2）/2。
AS0——加入煮死酶液的对照管吸光度。
AS1、AS2——样品管吸光度。
Vt——粗酶提取液总体积（mL）。
V1——测定用粗酶液体积（mL）。
FW——样品鲜重（g）。
0.1——A240每下降0.1为1个酶活单位（µ）。
t——加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。
注意：
凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。
五、注意事项
1.试剂中的H2O2的浓度对测定结果影响较大，要注意标定的准确性。
2.缓冲液中必须加PVP，以防止酶活性降低。
六、思考题
1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些？
2.超氧化物歧化酶（SOD）的测定
七、实验原理
超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD，EC1.15.1.1）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧自由基O2·ˉ，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O2·ˉ，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性的大小。
八、实验材料、仪器和试剂：
1.材料
小麦叶片或其他植物组织
2.仪器设备
高速离心机；分光分度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处理度为4000Lx）；试管或指形管数支。
3.试剂
（6）1.50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。
（7）2.130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：
称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100mL。
（8）3.750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：
称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100mL，避光保存。
（9）4.100μmol/LEDTA-Na2溶液：
称取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000mL。
（10）5.20μmol/L核黄素溶液：
称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000mL避光存。
九、实验步骤：
3.显色反应
取5mL指形管数支，测定管数目依据处理而定，另4支为对照管，按表2依次加入下列各溶液对照管用缓冲液代替酶液，蒸馏水0.25mL。
将其中2支对照管置于暗处，其它置于4000Lx日光下反应20min左右，主要看颜色的变化，全部变成灰色，对照可能较浅。
4.测定
待反应结束，以不照光的对照管做空白，依次测定其它各管的吸光值。
表2各溶液显色反应用量
试剂（酶）
用量（mL）
终浓度（比色时）
0.05mol/L磷酸缓冲液
3
130mmol/LMet溶液
0.6
13mmol/L
750μmol/LNBT溶液
0.6
75μmol/L
100μmol/LEDTA–Na2液
0.6
10μmol/L
20μmol/L核黄素
0.6
2.0μmol/L
酶液
0.1
对照管以缓冲液代替酶液
蒸馏水
0.5
总体积
6.0
一十、结果计算与分析
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。
SOD总活性
SOD比活力
式中：
SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。
比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
Ack—照光对照管的吸光度。
AE—样品管的吸光度。
VT—样品液总体积，mL。
Vt—测定时样品用量，mL。
W—样品鲜重，g。
蛋白质含量单位为mg/g。
一十一、注意事项
4.配好的Met溶液须在4℃冰箱中保存备用，以防止Met活性损失。
5.配好的NBT溶液须放入棕色试剂瓶，并在4℃冰箱中保存备用，以防止NBT见光分解。
6.配好的核黄素溶液须放入棕色试剂瓶避光保存。
一十二、思考题
3.在SOD测定中为什么设照光和暗中两个对照管?
4.影响本实验准确性的因素是什么?
应如何克服?
3．过氧化物酶（POD）活性的测定
一、实验原理
过氧化物酶（peroxidases,POD,EC1.11.1.7）是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等有密切关系，当植物受到环境胁迫时，酶活性就会发生变化。
在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm的吸光度变化，测定过氧化物酶活性。
二、实验材料、仪器和试剂
1.材料
小麦叶片或其他植物组织
2.仪器设备
分光光度计，研钵，100mL容量瓶，吸管，离心机。
3.试剂
（1）50mmol/L磷酸缓冲液pH7.0。
（2）过氧化氢：
取30%的
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