使用TALEN技术构建的GPR3敲出小鼠的筛选鉴定.docx

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使用TALEN技术构建的GPR3敲出小鼠的筛选鉴定

HUNANUNIVERSITY

毕业设计（论文）

设计论文题目：

使用TALEN技术构建的GPR3

敲除小鼠的筛选鉴定

学生姓名：

唐开翼

学生学号：

20090940219

专业班级：

生物技术2009级2班

学院名称：

生物学院

指导老师：

廖红东张儒

学院院长：

谭蔚泓

2013年6月日

使用TALEN技术构建的GPR3敲除小鼠的筛选鉴定

摘要

TALEN（transcriptionactivator-likeeffectornuclease）技术是一种源于植物致病菌Xanthomonas的崭新的靶向基因操作技术。

与传统方法相比，TALEN具有很高的打靶效率，一般在60%左右，甚至更高，大大减少了构建基因敲除动物模型的工作量。

GPR3编码产物是七次跨膜G蛋白偶联受体（G-proteincoupledreceptor，GPCR），前期研究证实，GPR3受体与神经退行性疾病和减数分裂阻遏等密切相关，然而其结构与功能的研究尚处于起步阶段，且作用于它的内源性激动剂和拮抗剂至今仍不清楚。

本实验设计旨在综合运用鼠尾基因组DNA提取、PCR、酶切、DNA电泳和TA克隆测序等一整套现代分子生物学技术，筛选出用TALEN技术构建的首代GPR3敲除阳性小鼠，为研究GPR3受体的在体生理功能及其调控机制提供可靠的动物模型，同时也为以GPR3受体为靶点的新药设计提供正确的药物筛选模型。

关键词：

基因敲除，TALEN，受体，GPR3，小鼠

ScreeningandidentificationofthefirstgenerationofGPR3knockoutmousegeneratedbyTALEN

Abstract

TALEnuclease（TALEN）isanewtechnologytospecificallyandeffectivelymodifygenome.Transcriptionactivator-likeeffectors（tales）areaclassofnaturallyoccurringDNA-bindingproteinsfoundintheplantpathogenXanthomonas.Comparedwithtraditionalgeneknockoutmethods,TALENhasahighertargetingefficiency,generallyaround60%.Itgreatlyreducestheworkloadofestablishingagene-knockoutanimalmodel.ThegeneGPR3encodesaGprotein-coupledreceptor3（GPR3）whichisanovelseven-helixtrans-membranereceptorsandanorphanreceptor.Previousresearcheshaveidentified thatGPR3playsanimportantpoleinpromotingneuriteoutgrowth，maintainingmeioticarrestandaggravatingAlzheimer’sdisease.However,thesignaltransductionanditsfunctionalregulationmechanismsofGPR3isstillunclear.ByusingaseriesofmolecularbiologytechnologysuchasgenomicDNAisolationfrommousetails,enzymaticrestrictiondigestion,PCR,DNAagrose-gelelectrophoresis,TAcloningandDNAsequencing,we screenedthefirstgenerationofGPR3knockoutmousegeneratedbyembryomicroinjectionofTALENplasmidstargetingGPR3.Thecorrectgene-knockoutmicewereidentifiedwhichcanbeusedforfurtherstudyoftheGPR3functioninvivoandnewdrugscreeningtargetingGPR3.

Keywords:

geneknockout,TALEN,receptors,GPR3,mouse

目录

1绪论1

1.1GPR3受体1

1.1.1GPR3受体的结构、信号转导通路和生理功能1

1.1.2GPR3受体的研究展望1

1.2TAL效应核酸酶（TALEN）技术2

1.2.1TAL效应核酸酶（TALEN）的结构2

1.2.2TALEN技术的密码和原理2

1.2.3TALEN技术的优势与应用3

1.3课题研究的目的和方法4

1.3.1课题的研究目的4

1.3.2课题的研究方法：

4

2GPR3敲除小鼠的初步筛选鉴定6

2.1实验材料、试剂和仪器6

2.1.1实验材料6

2.1.2实验试剂及其配制7

2.1.3实验仪器8

2.2实验方法9

2.2.1鼠尾基因组DNA的提取9

2.2.2PCR扩增包含TALEN靶点的GPR3目的片段9

2.2.31%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的目的片段10

2.2.4PCR扩增目的条带的酶切鉴定10

2.3实验结果和分析11

2.3.1GPR3的PCR产物电泳结果和分析11

2.3.2GPR3PCR扩增产物的酶切电泳结果和分析13

2.3.4小结13

3TA克隆测序筛选鉴定GPR3敲除阳性小鼠14

3.1实验材料、试剂和仪器14

3.1.1实验材料14

3.1.2实验试剂及其配制14

3.1.3实验仪器15

3.2实验方法16

3.2.1纯化酶切结果呈阳性小鼠所对应的PCR产物16

3.2.2对胶回收产物进行TA克隆连接17

3.2.3对筛选结果进行测序19

3.3实验结果和分析20

3.3.1蓝白筛选的结果和分析20

3.3.2测序结果和分析20

3.3.3小结21

4结论22

致谢23

参考文献24

1绪论

1.1GPR3受体

GPR3受体是一个新发现的G蛋白偶联受体，其结构功能的研究尚处于起步阶段[1]。

另外该受体的内源性激动剂和拮抗剂目前也不是很清楚。

一系列研究证实，神经退行性疾病和减数分裂阻遏都与GPR3受体密切相关。

1.1.1GPR3受体的结构、信号转导通路和生理功能

GPR3受体是一种组成型G蛋白偶联受体，具有7次α-双螺旋跨膜结构（α-helix），其中N端位于细胞外，C端位于细胞内。

GPR3受体虽是孤儿受体，但是科学家发现GPR3受体被一些非内源性激动剂激活后，GPR3受体所连接的G蛋白α亚基与β、γ亚基解离，活化后的G蛋白亚基会调节效应器环化腺苷酸（cAMP），将外界信号转导到细胞内，从而进行调控各项生理功能[2,3,4]。

目前发现GPR3的功能主要体现在以下三个方面：

（1）GPR3受体在体细胞和卵巢卵泡内的卵母细胞中扮演着信号传递中间体的角色，另在减数分裂的调控中也有着重要作用[5,6]。

（2）GPR3受体对阿尔茨海默病（AlzheimerDisease，AD）中γ分泌酶复合体的酶活性和Aβ淀粉样沉淀的形成有着调控作用[7,8]。

（3）GPR3受体在神经细胞中的表达能够提高神经细胞内环化腺苷酸（cAMP）的水平，解除髓磷脂的抑制作用，从而促进神经元的生长发育[9,10]。

1.1.2GPR3受体的研究展望

G蛋白偶联受体是分布于组织中的最广泛的受体家族，是具有7次跨膜螺旋的细胞膜蛋白，它们与感光、气味、神经传递以及细胞增殖、分化、迁移等各类生理活动的调控密切相关，是现代药物研发的重要靶点[11,12,13,14,15]。

找到一个受体的内源性配体对于研究该受体功能是至关重要的，因为这些受体的激动剂或拮抗剂就是可能的药物分子[16]。

鉴于此，使用本实验筛选出的由TALEN技术成功构建的GPR3受体敲除小鼠可建立稳定的GPR3受体敲除小鼠品系，这对GPR3受体作用机制的进一步研究，以及治疗神经退行性疾病和修复神经损伤的药物的开发提供了可靠的动物模型。

1.2TAL效应核酸酶（TALEN）技术

TAL效应核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN）是继锌指核酸酶（zinc-fingernuclease，ZFN）技术以来的另一种能够对动植物细胞基因组进行高度特异和高效定点修饰的新兴技术，受到很多科学家的青睐[17]。

TALEN技术是根据从植物病原体黄单胞菌（Xanthomonas）中发现的一种转录激活子样效应因子（transcriptionactivator-likeeffectors,TALE）发展而来的崭新的靶向基因操作技术。

1.2.1TAL效应核酸酶（TALEN）的结构

TALEN的组成部分包括N端分泌信号、中央DNA结合域、1个核定位信号和C端FokI核酸内切酶的切割域。

其中最为重要的是起类似转录激活物作用的DNA特异性识别域和FokI核酸内切酶的切割域。

TALEN的DNA特异性识别域是由高度保守的重复单元组成。

每个重复单元通常是由34个氨基酸组成，虽然也发现了由33或35个氨基酸组成的重复单元但并不常见。

DNA特异性识别域的最后一个重复单元也称0.5重复单元，仅含有前面的20个氨基酸。

大多数DNA特异性识别域的重复单元数目在12到28个之间[18]。

1.2.2TALEN技术的密码和原理

TALEN重复单元识别不同碱基的特异性是由其序列中的第12位和第13位氨基酸残基决定的，这2个氨基酸残基被称为重复序列可变的双氨基酸残基（repeatvariabledi-residues,RVD）。

TALEN重复单元与DNA的特异性连接遵循着一个相当简单的法则：

目标DNA的一个核苷酸对应一个RVD。

现在已经从黄单胞菌属中分离得到的TALEN重复单元中发现了至少23种RVD，但是NI、NG、NN和HD（一个大写字母表示一个氨基酸）四种RVD是最常见的。

这四个RVD中的每一个都能特异地识别一种核苷酸，其中NI、NG、NN和HD分别与核苷酸“A”，“T”，“G”和“C”相对应。

在自然界中，TALEN的DNA结合域中发现的四种RVD的特异性使得我们用它们去重新合成、组装能够靶向

结合目标序列的人工TALEN重复单元成为可能。

现在已经报告了多种用常见RVD去构建符合相应研究目的TALEN的方法[19]。

2012年，我国科学家施一公带领的团队通过解析TALEN蛋白的晶体结构，使科研工作者对TALEN蛋白特异识别DNA的机理有了一个清晰的认识。

TALEN的超螺旋重复单元结构域与DNA双链的大沟紧密缠绕，以一个重复单元连接一个核苷酸的方式与DNA序列依次对齐，同时TALEN的N端到C端与目标DNA的5’末端到3’末端的方向相对应。

构建的TALEN即保留着天然的TALEN识别特异性双链DNA的功能，同时还保留着FokI切割结构域的能力从而在体内或体外环境造成非特异性DNA断裂的能力。

FokI切割结构域要高效地造成DNA双链断裂需要形成二聚体，因此需要两个TALEN单体。

作为一组功能对，一分子TALEN单体连接到一条链上的一个靶位点（也被称为重复单元连接成分，EBE），同时另一分子TALEN单体或异质二聚体连接到临近互补链的靶位点（EBE）上；两个TALEN靶点EBE之间由一段适当长度的间隔序列隔开，其长度由连接FokI结构域的TALEN的C端长度所决定，一般在10-31bp。

这样就能让两个FokI结构域相互接近，从而形成二聚体以便最终能切断双链。

DNA双链断裂会诱发DNA修复机制，从而实现目的基因的特异性修饰[20]。

理论上，细胞内DNA双链断裂能被下列方式中的一种修复，一种方式是非同源末端连接（Non-homologousEndJoining，NHEJ），另一种方式是同源重组（HomologousRecombination，HR）。

NHEJ在细胞周期的各个时相（Phase）均可被采用，而对处于G1时相的细胞而言，NHEJ是目前仅见的一种DNA双链断裂修复的手段；NHEJ是真核生物细胞在不依赖DNA同源性的情况下，而为了避免DNA或染色体断裂（Breaks）的滞留，避免因此造成的DNA降解或对生命力的影响，强行将两个DNA断端彼此连接在一起的一种特殊的DNA双链断裂修复机制，通常会导致DNA断裂位点碱基的缺失或添加，最终导致基因功能的改变[21]。

1.2.3TALEN技术的优势与应用

在TALEN技术发展起来之前，ZFN（zinc-fingernuclease）技术曾被认为是最具有潜力的基因改造技术，它实现了基因的靶向操作，并得到了广泛的应用。

自行组装针对特定DNA序列的ZFN，所需的工作量大，花费也十分昂贵，而且最终产生的ZFN在细

胞内会产生细胞毒性，因此有必要发展更为高效的基因定点修饰技术。

最新发展起来的TALEN技术，不仅具备了ZFN技术特异结合目标DNA特异性的优点，而且也消除了它的一些缺点。

另与传统方法相比，TALEN技术具有很高的打靶效率，一般在60%左右，甚至更高，大大减少了构建基因敲除动物模型的工作量[22]；另外还具有其他多种优点，诸如无基因序列、细胞、物种限制，实验设计简单准确、实验周期短、成本低等等。

目前，TALEN技术已经在大鼠[23]、小鼠[24]、猪[25]、斑马鱼[26]、水稻[27]、拟南芥[28]及酵母[29]等多类物种中得到成功应用。

1.3课题研究的目的和方法

1.3.1课题的研究目的

使用TALEN技术可以高效地构建出GPR3敲除小鼠，但我们仍需要通过一定的实验技术手段来筛选出首代GPR3敲除阳性小鼠。

本课题综合运用鼠尾基因组DNA提取、PCR、酶切、DNA电泳和TA克隆测序等一整套现代分子生物学技术来筛选出用TALEN技术构建的GPR3基因敲除小鼠的首代阳性小鼠。

通过使用本实验筛选出的首代GPR3敲除阳性小鼠可以建立稳定的GPR3敲除小鼠品系，为研究GPR3的生理功能提供可靠的动物模型，同时也为以GPR3受体为靶点的新药设计提供正确的药物筛选模型。

1.3.2课题的技术路线和主要研究内容

为了达到课题的研究目的，实验将拟采用如下路线：

（图1.1）

蓝白斑筛选

图1.1实验路线图

实验的主要研究内容为：

（1）GPR3敲除小鼠的初步筛选鉴定

首先，剪取TALEN技术构建的4周龄左右GPR3敲除小鼠的尾巴，然后提取基因组DNA。

用提取的小鼠基因组DNA为模板，加入已设计好的两条引物，进行PCR反应。

取一部分PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，根据扩增片段的大小判断小鼠基因组的提取是否成功，同时根据扩增片段的电泳条带亮度判断PCR产物的浓度。

接着再取另一部分PCR产物，用限制性内切酶XcmI对其进行单酶切。

由于野生型小鼠的PCR扩增产物是GPR3序列的一部分，包含GPR3的第一个外显子，且该PCR产物序列仅有一个完整的限制性内切酶XcmI的酶切位点，这样PCR扩增片段会被限制性内切酶XcmI切成两部分，琼脂糖凝胶电泳会显示两条带；而GPR3阳性敲除小鼠所得到的PCR扩增片段内的XcmI酶切位点已被TALEN破坏，限制性内切酶XcmI就不能切割该片段，琼脂糖凝胶电泳条带。

我们可根据这点，用酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，来初步判断小鼠的GPR3是否敲除成功。

（2）GPR3完全沉默的敲除阳性小鼠的进一步确定

仅由酶切产物筛选出的GPR3敲除阳性小鼠，其GPR3蛋白编码序列可能并未产生移码突变，这样GPR3仍可能继续表达，所以我们还需要通过TA克隆测序手段来进一步筛选出准确可靠的GPR3完全沉默的敲除阳性小鼠。

将对应可能的GPR3敲除阳性小鼠剩余PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒切胶回收纯化。

接着通过连接反应将纯化产物连接到TA克隆试剂盒提供的T载体上，用热激法将重组好的TA质粒转入大肠杆菌感受态（DH5α）中。

然后在含氨苄青霉素或卡那霉素、X-gal、IPTG的LB平板上均匀涂布转化菌液，37℃倒置培养过夜，随机挑选9个白色菌落测序。

对测序结果进行分析比对，找到GPR3发生移码突变的序列，从而筛选出首代GPR3敲除阳性小鼠。

2GPR3敲除小鼠的初步筛选鉴定

2.1实验材料、试剂和仪器

2.1.1实验材料

实验所用C57BL/6小鼠购于JacksonLaboratory。

后在同济大学实验动物中心进行饲养和实验，所属级别为SPF级。

动物饲养于室温22士2°C的环境中，维持明-暗12h，

循环交替（光照起止时间为：

9:

00-21:

00），并给以充足的食料和洁净饮水。

扩增目的基因的引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成：

GPR3-Forward:

GTACCATGATGTGGGGAGCAGG；

GPR3-Reverse:

GAACCACCAGATGGTTCTTGGAGA。

2.1.2实验试剂及其配制

2.1.2.1实验溶液配制

限制性内切酶XcmI购于NewEnglandBiolabs公司，TaqDNA聚合酶购于北京艾德莱生物科技有限公司，DNA分子量标记物购于北京天根生化科技有限公司。

其他化学试剂均为从各生物公司购买的国产分析纯。

（1）鼠尾裂解液的配制（1000ml裂解液成分）

尿素4M（240.24g）

EDTA-2Na-2H2O10mM（3.722g）

Sarkosyl（十二烷基肌酸钠）0.5%（5g）

Tris/HCl（1M，PH8.0）0.1M（100ml）

NaCl0.2M（11.688g）

H2O定容至1000ml，室温保存

裂解液成分EDTA-2Na-2H2O主要起着螯合Mg2+，降低DNAase活性的作用；Sarkosyl可以破坏细胞膜蛋白和核蛋白，从而释放DNA；Tris/HCl起着调节溶液pH的功效。

（2）50×TAE电泳缓冲液（pH8.5）

称量242gTris、37.2gNa2EDTA·2H2O于1L烧杯中，然后把约800ml的去离子水加入烧杯中，充分搅拌溶解，接着加入57.1ml的乙酸，充分搅拌，最后用去离子水将溶液定容至lL后，室温保存。

（3）1×TAE电泳缓冲液

用100ml量筒量取20ml50×TAE电泳缓冲液于1L容量瓶中，然后用去离子水定容至1L，上下颠倒数次混匀后室温保存。

2.1.3实验仪器

采用的实验仪器如表2.1。

表2.1实验仪器表

仪器

仪器公司

台式离心机

德国Eppendorf公司

制冰机

上海华耀公司

立式压力蒸汽灭菌锅

上海博迅公司

通风橱

上海正申

金属恒温加热器

上海碧茜公司

电子分析天平

上海民桥公司

不锈钢电热恒温水浴锅

上海精宏公司

涡旋振荡器

英国Biocotestuart公司

电热恒温培养箱

上海跃进公司

凝胶成像系统

上海Tanon公司

超纯水仪

上海菲特科学器材有限公司

微波炉

中国海尔集团

纯水系统

美国Millipore公司

PCR仪

德国Eppendorf公司

电泳仪

美国Amershambiosciences公司

高速冷冻离心机

德国Eppendorf公司

涡旋振荡器

英国BioCote公司

2.2实验方法

2.2.1鼠尾基因组DNA的提取

小鼠出生后4周龄左右，剪取大约0.5cm的鼠尾尖端，每管中加入0.5ml鼠尾裂解液和5μlPK酶（20mg/ml）置于50℃恒温金属浴中振荡约两小时至鼠尾完全裂解。

然后每管加入700μl酚氯仿漩涡混匀，于4℃离心机中以9000rpm的转速离心15min。

小心取上清300μl至新的EP管中，加入450μl异丙醇颠倒混匀，直至看到白色絮状沉淀产生，再次于4℃,9000rpm离心15min。

弃上清，加入500μl的70%乙醇洗涤沉淀DNA，后放入4℃离心机中13200rpm离心5min。

充分弃上清，敞口干燥2min后加入50μl双蒸去离子水，于50℃溶解5min或4℃过夜溶解DNA。

2.2.2PCR扩增包含TALEN靶点的GPR3目的片段

2.2.1.1PCR引物序列的设计

根据小鼠GPR3的基因序列，设计合理的引物用以扩增含有TALEN靶位点的目的片段。

根据PCR引物设计的一系列原则及实验设计的需要，本实验设计用于扩增GPR3目的片段的引物设计如下：

GPR3-Forward:

GTACCATGATGTGGGGAGCAGGTm63.8℃

GPR3-Reverse:

GAACCACCAGATGGTTCTTGGAGATm64.2℃

2.2.1.2PCR扩增目的基因片段

采用50μlPCR反应体系：

双蒸去离子水33.75μl，10×PCRbuffer（含Mg2+）5μl，10mMdNTP1μl，10μM引物混合物5μl，DNA模板约250ng，Taq酶0.25μl。

PCR仪设置条件：

94℃预变性5min，94℃变性30S，65℃退火30S，72℃延伸1min，循环35次，72℃后延伸5min，4℃保存。

野生型小鼠的基因组GPR3DNA经该PCR反应后会得到全长597bp的以下序列：

gtaccatgatgtggggagcaggaagctctatggcctggttctcagctggctcaggcagtgtgaacgtgagcagcgtggacccagtagaggaacccacaggcccagctacactgctgccctctcccagggcctgggatgtggtgctgtgcatctcaggcaccctggtgtcctgcgagaacgcgctggtggtggccatcattgtgggcactcctgccttccgcgcccccatgttcctgctggtgggtagcttggccgtagcagacctgctggcaggcctgggcctggtcctgcactttgcggctgacttctgcattggctcaccagagatgagcttgatgctggtcggcgtgctagcaatggccttcactgccagcatcggcagcctgctggccattaccgttgaccgctacctttccctgtacaatgctctcacttactactcagagacaacggtaactcggacttatgtgatgctggccttggtgtgggtgggtgccctgggcctggggctggttcccgtgctggcctg