生理生化实验课资料.docx
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生理生化实验课资料
硕士研究生
《昆虫生理生化实验技术》
课程代码：
3012100018
开课单位：
植物科技学院
责任教师：
牛长缨
研究生：
学号：
实验一昆虫血淋巴中蛋白质的分离（聚丙烯酰胺凝胶电泳法）
一、实验目的
掌握凝胶电泳基本方法，并测定各种昆虫，以及同一种昆虫不同发育阶段的血淋巴的蛋白谱。
二、实验原理
昆虫的各种组织，均含有多种蛋白质和各种酶类。
在血淋巴中经分离和纯化后已鉴定的蛋白质有：
卵黄原蛋白，脂蛋白，贮存蛋白，滞育蛋白，抗菌蛋白，抗冷蛋白等。
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离蛋白质和酶类，可以得到满意的蛋白谱和酶谱，通常能分离到20－30条带。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂（过硫酸胺）与加速剂（四甲基乙二胺）的作用下，聚合交联而成，具有三维网状结构，能起分子筛的作用，因此常用它作为电泳支持物。
对样品的分离不仅取决于各组分所带电荷的多少，也与分子大小有关。
此外，凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH和凝胶孔径梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带。
从而提高了分离效果。
三、实验材料和仪器
供试昆虫：
菜青虫
试剂及配制：
1．Acr:
丙烯酰胺Bis:
甲叉双丙烯酰胺TEMED:
四甲基乙二胺AP:
过硫酸胺Tris:
三羟甲基氨基甲烷
A：
1mol/LHCl48ml；Tris36.3g；加水至100ml，pH8.9；贮存于棕色瓶内，4℃保存。
B：
Acr30g；Bis0.8g；加水至100ml，贮存于棕色瓶内，4℃保存。
C：
10%AP1gAP加9ml水，最好现用现配，贮存于棕色瓶内。
D：
1mol/LHCl48ml；Tris5.98g；加水至100ml，贮存于棕色瓶内，4℃保存.
E：
Tris6g；甘氨酸28.8g；加水至1000ml，pH8.3（电极缓冲液）
2．1％溴酚蓝指示剂，苯硫脲
3．染色液：
考马斯亮蓝R2501.25g;水227ml;冰乙酸46ml;甲醇227ml;共500ml,溶解后过滤。
4．脱色液：
水875ml;甲醇50ml;冰乙酸75ml.
5．分离胶及浓缩胶的配制：
分离胶
高pH不连续系统
配制体积比（ml）
A
1mol/LHCl
Tris
加水至100ml
48ml
36.3g
pH8.9
2．5
B
Acr
Bis
加水至100ml
30g
0.8g
5
TEMED
（直接用原液）
0.01
加水
12.39
10％AP
（最后加入）
0.1
浓缩胶
配制体积比（ml）
D
1mol/LHCl
Tris
加水至100ml
48ml
5.98g
pH6.7
1.25
B
Acr
Bis
加水至100ml
30g
0.8g
1
TEMED
0.005
水
7.64
10％AP
0.10
仪器及用具：
高压电泳仪与垂直平板电泳槽、冰箱、组织匀浆器、离心机、吸水纸、移液器、注射器及长针头、大培养皿及大玻璃烧杯
四、实验方法及内容
（一）样品制备
血淋巴的采集：
用解剖针轻轻刺破菜青虫尾部或头部表皮，用力挤压虫体收集血淋巴，滴入小试管或离心管中，用力适当防止将虫体内脏一起挤入（血淋巴中可加入微量的苯硫脲以防止血淋巴变黑）。
（二）电泳胶的制备
1.凝胶框的安装：
将两块制胶玻璃插入橡胶框内成为凝胶框，插入电泳槽中，拧紧电泳槽两侧的固定螺丝，使橡胶框垂直安装在电泳槽内不致漏水。
2.分离胶的制备：
如上述，混匀后速将此胶加到凝胶框内，上面加正丁醇，晾干，约30分钟。
3.待分离胶凝固后，倾倒出正丁醇，用蒸馏水多次冲洗胶面，最后用吸水纸吸干胶面水分。
4.配浓缩胶，倒入分离胶上面，马上插入梳子，梳子下不能有气泡，用微量移液器向凹陷的梳子孔加入浓缩胶补平。
约10分钟后，浓缩胶干燥。
（三）加样
1.待浓缩胶干燥后，取出梳子，留下梳子孔准备点样。
2.样品与40％蔗糖（1：
1）混匀，一般各取50µl。
3.点样后，每个样上加溴酚蓝指示剂，然后倒入电极缓冲液，至样品以下，用吸管吸缓冲液覆盖于样品之上，然后再倒满。
（四）电泳
1.打开电泳仪，在浓缩胶150v,跑到分离胶后200v,大约跑3－4小时，至底部为止，关上电泳仪。
2.倒出电极缓冲液，取出玻璃板，分开，浓缩胶不要，将分离胶倒入培养皿中，倒入染色剂染色（60℃30分钟）
3.用脱色液脱色，至胶变白色为止。
（五）分析
各蛋白谱带迁移率（Rf）的计算：
迁移率Rf：
谱带迁移距离（cm）/溴酚蓝迁移距离（cm）
谱带迁移距离是指从分离胶起点至谱带中心的距离（cm）
五、实验结果及分析
实验二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定牛血红蛋白分子量
一、实验目的
掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，并用以测定未知蛋白子分子量大小，分离不同大小的蛋白质。
二、实验原理
一般凝胶层析是非变性的，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是变性的，二硫键也被还原，所以是亚基（肽链）分子量。
非变性胶同蛋白质分子结构，分子电荷有关。
而变性胶因为有SDS参与，所以同分子结构电荷等等都无关。
氨基酸有电泳性质，不过在普通Page胶里面电荷远少于SDS，忽略不计，所以可以用以分离不同大小的蛋白质。
三、实验材料及仪器
同实验一
四、实验方法及内容
方法同实验一，不同的是制备分离胶、浓缩胶和电极缓冲液的时候都要加入10%的SDS。
制样：
样品要与上样缓冲液混匀，注意蛋白Marker和样品都要沸水煮3-5min。
五、实验结果及分析
实验三昆虫基因组DNA的提取及检测
一、实验目的
1.学习并掌握昆虫基因组DNA提取的一般方法；
2.掌握基因组DNA检测的一般方法；
3.比较不同样品对基因组DNA提取质量的影响。
二、实验原理
CTAB法原理：
CTAB是一种非离子去污剂，CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。
琼脂糖凝胶电泳检测原理：
在pH值为8.0－8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
三、实验材料及仪器
供试昆虫：
蜚蠊、家蝇、橘小实蝇
试剂：
2×CTAB溶液：
0.05MCTAB（国产）
0.1MTris·Cl（pH8.3）
0.02MEDTA
1.4MNaCl
AddddH2Oto1000ml
氯仿/异戊醇（24:
1），实验前配好，放入通风橱中。
异丙醇，分装在棕色瓶中，-20℃保存。
70%乙醇
TE溶液：
1mMEDTA，10mMTris.HClpH8.0
进口琼脂糖
电泳缓冲液10×TAE：
NaAc4.1g+EDTA1.85g（pH8.0）混合定容于250ml
EB0.5ug/ml
DNAMarker：
DL2000
仪器：
冰盒，研钵，1.5ml的离心管，移液器，枪头（蓝黄白三种），一次性手套，玻棒，烧杯，容量瓶，锥形瓶，灭菌瓶
四、实验方法及内容
1.取试验昆虫于研钵中研碎；
2.取约0.4g左右细粉1.5ml离心管，加入1ml2×CTAB提取液，加入大约2ul的β-巯基乙醇混匀；
3.65ºC水浴中放置1h，每隔10分钟上下颠倒混合数次（DNase变性，促进内溶物释放）；
4.11000rpm离心15分钟；
5.吸取600ul上清于新的1.5ml离心管，加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25:
24:
1），上下颠倒数次；
6.11000rpm离心15分钟；
7.取上清，重复5-6步1-2次；
8.加入等体积异丙醇-20ºC沉淀半小时；
9.弃去上清。
用70％乙醇浸洗沉淀，除去离子及CTAB残余，自然干燥30分钟以上；
10.加入50ulTE（含20ug/mlRNaseA），放于4ºC冰箱保存备用；
11.0.8-1%琼脂糖凝胶电泳检测：
（1）将挡板及制胶板洗净，水平放置在工作台上；
（2）称取0.24g琼脂糖于30ml1×TAE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；
（3）调整好梳子的高度，趁热插入凝胶中；
（4）凝胶凝固后，小心拔去梳子，取下挡板；
（5）将电泳样品（约5ul）依次点入加样孔中，选一个适当的位置点DNAMarker；
（6）将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）；电压80v，30min。
（7）电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5µg/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡10－15min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。
五、本实验注意事项
1.研钵预冻，粉末转管前至加CTAB前不要融化
2.24:
1的苯酚氯仿抽提时动作应轻柔，氯仿的操作要在通风柜中进行
3.所用试剂必需灭菌，带手套
4.EB为诱变剂，可引起插入突变，并有中度毒性，操作时要注意防护。
一般配成1000×储液（0.5mg/ml），工作浓度为0.5ug/ml。
六、实验结果及分析
实验四昆虫肌动蛋白（Actin）基因片段的PCR检测
一、实验目的：
学习并掌握PCR扩增目的基因片断的一般原理和方法，熟练操作琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的方法。
二、实验原理：
PCR（多聚酶链式反应〕是一种体外扩增特异DNA片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。
PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。
反应分为变性（denaturation，）退火（annealing）、延伸（extension）三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。
三、实验试剂及作用
ØMg2＋：
Mg2＋能影响反应的特异性和扩增片段的产率。
一般反应体系中1.5-2.5mmol/L
Ø反应缓冲液：
使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。
ØdNTP：
在PCR反应体系中其浓度一般为20-200mmol/L，浓度过高、过低都不利。
ØTaqDNA聚合酶：
在70－75C具最高活性。
具有5’－3’的聚合酶活性和5’－3’的外切酶活性，无校正功能。
是镁依赖性酶。
引物序列
Actin基因片段引物：
F:
5′-AGGCTAACCGTGAGAAGA
R：
5′-GGTGGTGGTGAAAGAGTAA
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Ø模板DNA：
前次所提质量较好的基因组DNA
Ø1.4-1.5%琼脂糖
ØEB
Ø电泳buffer的配制
四、操作步骤
1.20×反应体系
10×ExTaqbuffer2l
MgCL2（25mM）2ul
dNTPmixture（10mM）1l
PrimerF（20uM）1l
PrimerR（20uM）1l
Taq（5u/1l）0.2l
ddH2O11.8l
混匀
DNA1l
Total20l
2.PCR反应循环条件设置：
95℃3’
94℃1'
55℃1'35cycles
72℃2'
72℃10'
4℃forever
3.检测：
取10l反应产物电泳；
4.在1.4-1.5%的琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。
五、实验结果及分析
实验五昆虫肌动蛋白（Actin）基因片段的PCR产物纯化
一、实验目的
通过PCR产物的纯化，可获得高纯度的DNA片段，并能够保持片段完整性和高生物活性，可直接用于连接、体外转录、扩增、测序、微注射等分子生物学实验。
二、实验原理
本实验采用Axygen公司的AxyPrep-96DNA凝胶回收试剂盒。
该试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中回收多至8μg长度在70bp-10kb的片段，回收率为60-85%。
琼脂糖凝胶在温和的缓冲液（DE-A溶液）中熔化，其中的保护剂能防止线状DNA在高温下降解，然后在DE-B溶液的作用下使DNA选择性地结合到膜上。
三、实验材料及仪器
凝胶回收试剂盒
琼脂糖凝胶电泳系统
紫外观察分析仪
离心机
单面刀片
四、实验准备及注意事项
1.准备无核酸和核酸酶污染的Tip头。
2.第一次使用试剂盒前，在BufferW2concentrate中加入指定体积的无水乙醇。
3.准备75°C水浴。
4.使用前，检查BufferDE-B是否出现沉淀，若出现沉淀，应于75°C温浴加热至沉淀完全溶解并冷却至室温后再使用。
1.BufferDE-A（含有β-巯基乙醇）和BufferDE-B含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和防护眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。
若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
2.在步骤1中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间（线性DNA长时间暴露在高温条件下易于水解），从而提高回收率。
勿将含DNA的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。
3.在步骤2中凝胶必须完全熔化，否则将严重影响DNA回收率。
4.DNA分子呈酸性，建议在2.5mMTris-HCl，pH7.0-8.5的洗脱液中保存。
五、实验方法及内容
1.用干净锋利的刀片从琼脂糖凝胶中切下含有目的DNA条带的凝胶块，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。
计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100μl体积），然后依次放入96孔2.2ml深孔板（试剂盒内提供）孔中。
*观察DNA条带位置时，请尽可能缩短紫外照射时间，以减少紫外诱导突变。
电泳时间可适当延长，从而使目的DNA片段与其他DNA片段尽可能分开，从而提高回收纯度。
2.加入3个凝胶体积的BufferDE-A，用硅胶片密封各孔（试剂盒内提供），混合均匀后于75°C温浴，间断混合（每3-5min），直至凝胶块完全熔化（15min左右）。
3,000×g简短离心使硅胶片上的溶液到96深孔板中。
*温浴及混匀过程中，要确保硅胶片与深孔板贴紧，以免孔间样品污染。
*BufferDE-A为红色溶液。
在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。
3.弃硅胶片。
每孔加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，用不干胶片（试剂盒内提供）密封各孔，混合均匀。
3,000×g简短离心使不干胶片上的溶液到96深孔板中。
当分离的DNA片段小于400bp时，应在此溶液中再加入1个凝胶体积的异丙醇。
*加BufferDE-B后混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。
4.将96孔DNA制备板（试剂盒内提供）置于新的96孔2.2ml深孔板（试剂盒内提供）上，然后将样品转移至96孔DNA制备板中，用不干胶片密封各孔，3,000×g离心5min，弃滤液。
5.将96孔DNA制备板置回深孔板上，每孔加800mlBufferW2，3,000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法，再用800mlBufferW2洗涤一次，3,000×g离心1min。
*确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
*两次用BufferW2冲洗能确保盐分被完全清除，消除对后续反应的影响。
6.将96孔DNA制备板置回96孔2.2ml深孔板上，3,000×g离心5min。
7.将96孔DNA制备板置于洁净的96孔V型底板（试剂盒内提供）上，在膜正中央加50mlEluent或去离子水，用不干胶片密封各孔，室温静置5min。
3,000×g室温离心5min洗脱DNA。
*将Eluent或去离子水加热至65℃，可提高洗脱效率。
6、实验结果及分析
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