陈卫栋开题报告.docx

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陈卫栋开题报告

中北大学

毕业论文开题报告

学生姓名：

陈卫栋

学号：

1104064125

学院：

化工与环境学院

专业：

生物工程

设计（论文）题目：

甲壳类动物4种过敏原的序列分析、抗

原表位预测及三维结构建模

指导教师:

叶增民

2015年4月3日

开题报告填写要求

1．开题报告作为毕业论文答辩委员会对学生答辩资格审查的依据材料之一。

此报告应在指导教师指导下，由学生在毕业论文工作前期内完成，经指导教师审查后生效；

2．开题报告内容必须用按教务处统一设计的电子文档标准格式（可从教务处网页上下载）打印，禁止打印在其它纸上后剪贴，完成后应及时交给指导教师签署意见；

3．学生写文献综述的参考文献一般应不少于10篇（不包括辞典、手册）。

文中应用参考文献处应标出文献序号，文后“参考文献”的书写，应按照国标GB7714—87《文后参考文献著录规则》的要求书写，不能有随意性；

4．学生的“学号”要写全号（如0201140102,为10位数），不能只写最后2位或1位数字；

5.有关年月日等日期的填写，应当按照国标GB/T7408—94《数据元和交换格式、信息交换、日期和时间表示法》规定的要求，一律用阿拉伯数字书写。

如“2004年3月15日”或“2004-03-15”；

6.指导教师意见用黑墨水笔工整书写，不得随便涂改或潦草书写。

毕业论文开题报告

1．选题依据：

1.1概述

1.1.1甲壳类动物

甲壳动物是节肢动物门中的一个纲，其体表都有一层几丁质外壳，称为甲壳。

甲壳动物大多数生活在海洋里，少数栖息在淡水中和陆地上。

虾、蟹等甲壳动物有5对足，其中4对用来爬行和游泳，还有一对螯足用来御敌和捕食。

甲壳动物包括虾类、蟹类、钩虾、栉虾及鳃足亚纲、介形亚纲动物，大约2.6万种之多。

虾、蟹等甲壳动物营养丰富，味道鲜美，具有很高的经济价值。

有些甲壳还是鱼类等经济动物的饵料。

在甲壳动物中，也有一些种类是有害的，如藤壶等。

1.1.2食物过敏原

食物过敏是指人们摄入食物后产生的一种变态反应，临床上表现为荨麻疹，哮喘，腹痛和腹泻等多种症状，严重的可导致休克，甚至危及生命[1]。

其中甲壳类水产品过敏可导致患者出现皮肤红肿、哮喘、鼻炎等过敏症状，严重时还伴随着虚脱、休克，甚至危及生命，严重影响着过敏人群的身体健康和生活质量[2]。

1.1.3甲壳类动物的6种过敏原

甲壳类动物的主要过敏原包含精氨酸激酶（Argininekinase，AK）、肌球蛋白轻链（MyosinLightChain，MLC）、原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）、肌质钙结合蛋白（SarcoplasmicCalcium-bindingProtein，SCP）、血蓝蛋白亚基（HemocyaninSubunits，HCS）和磷酸丙糖异构酶蛋白（TriosephosphateIsomerase，TPI）。

（1）精氨酸激酶：

精氨酸激酶是调节无脊椎动物能量代谢的重要酶,在调节无脊椎动物体内磷酸精氨酸与ATP之间的能量平衡过程中具有重要作用[3]。

在无脊椎动物中，根据精氨酸激酶的分子量及结构，可分为:

①单亚基精氨酸激酶，如海湾对虾，相对分子量约为40kD；

②双亚基精氨酸激酶，如海参，相对分子量约为80kD；

③四亚基精氨酸激酶，如环节动物，相对分子量约为150～160kD［3］。

（2）肌球蛋白轻链：

肌球蛋白是一个超级家族，是一种多功能肌动蛋白，为肌肉收缩提供动力，是一个六聚体的生物大分子，包括2条质量约220kDa的重链、2条质量约17kDa的基本轻链和2条质量约20kDa的调节性轻链[4]。

肌球蛋白轻链是肌球蛋白的一个亚基。

肌球蛋白轻链拥有自己的肽链，这点与重链不同。

肌球蛋白家族中不包含它，但是却对肌球蛋白酶催化超分子复合体的形成有着很重要的作用。

肌球蛋白轻链是调控链，调控重链的表达。

（3）原肌球蛋白：

原肌球蛋白，分子量是64KD，由两条互相平行的多肽链扭成螺旋结构，每个Tm的长度相当于7个肌动蛋白，是长杆状。

每一条原肌球蛋白都有7个肌动蛋白结合的位点，因此Tm和肌动蛋白细肌丝中的7个肌动蛋白亚基相互结合。

主要作用是加强和稳定肌动蛋白丝，抑制肌动蛋白与肌球蛋白结合。

虾中有多种过敏原组分，其中相对分子质量为36000的原肌球蛋白能与超过50％的虾过敏患者血清IgE发生特异性反应，是虾类的主要过敏原。

原肌球蛋白是一种来源于虾肌肉组织的糖蛋白。

它是由2条不同的α螺旋肽链互相缠绕形成的超螺旋结构，等电点大概在4.5。

目前原肌球蛋白的结构已经研究的较为清楚,但对其引起过敏反应的抗原表位的研究还比较缺乏[5]。

（4）肌质钙结合蛋白:

肌质钙结合蛋白是存在于无脊椎动物肌肉和神经组织中的EF-手型钙离子结合蛋白，其功能与脊椎动物的小清蛋白相似，主要参与肌肉的收缩。

（5）血蓝蛋白亚基：

血蓝蛋白是一种多功能蛋白，又称血蓝素，过去被称为呼吸蛋白，但经最新的研究证明，该蛋白与能量贮存、维持渗透压及蜕皮过程的调节有关。

它是在某些软体动物、节肢动物（蜘蛛和甲壳虫）的血淋巴中发现的一种游离的蓝色呼吸色素。

血蓝蛋白与含铁的血红蛋白类似，含两个直接连接多肽链的铜离子，易于和氧结合，也易与氧解离，是已知的惟一可和氧可逆结合的铜蛋白，氧化时呈青绿色，还原时呈现白色。

其分子量450000～130000。

节肢动物的血蓝蛋白一条多肽链与一分子氧结合，含铜量0.17%；软体动物的血蓝蛋白一条多肽链则与6分子氧结合，含铜量0.025%。

铜以二价形式与蛋白直接结合。

血蓝蛋白有几种催化作用，尤其是在变性后，在特定的条件下具有多酚氧化酶、过氧化氢酶和脂氧化酶等活性。

血蓝蛋白是虾血淋巴中的含铜呼吸蛋白，每个氧结合位点有2个铜原子，其氧的结合位点与另一种铜离子结合蛋白——酚氧化酶的氧结合位点的结构具有很高的相似性。

血蓝蛋白在脱氧状态为无色，结合氧为蓝色。

（6）磷酸丙糖异构酶蛋白:

磷酸丙糖异构酶蛋白（Triose-phosphateisomerase，通常简称为TPI或TIM）是一种酶，能够催化二羟丙酮磷酸和D型甘油醛-3-磷酸，这两种丙糖磷酸异构体之间的可逆转换。

磷酸丙糖异构酶在糖酵解中有着很重要的作用，对有效能量的生成是具有必不可少的作用。

磷酸丙糖异构酶存在于几乎所有的生物体内，包括哺乳动物、植物、昆虫、真菌和大多数细菌中。

但也有一些不进行糖酵解的细菌，如解脲支原体，则缺乏该酶。

磷酸丙糖异构酶是由两个相同的亚基所形成的二聚体；每个亚基都包含250个左右的氨基酸残基。

每一个亚基的三维结构中都包含位于内部的8个平行β链和位于外部的8个α螺旋。

这种结构花样被称为TIM桶或αβ桶，是目前观察到最为普遍的一种蛋白质的折叠方式。

这种酶的活性位点位于“桶”的中心，其中一个组氨酸和一个谷氨酸参与了催化反应的进程。

在所有已知的磷酸丙糖异构酶中，活性位点附近的残基序列都很保守。

1.1.4蛋白质的序列分析

蛋白质序列的基本性质分析是蛋白质序列分析的基本方面，一般包括蛋白质的理化性质、跨膜区、信号肽、亲水性/疏水性、Coil区分析及结构功能域等方面的分析。

蛋白质的功能特征大都可以通过直接分析其序列而获得。

1.1.5抗原表位

抗原是指能刺激机体产生特异性免疫应答，并与免疫应答产物（抗体）或致敏淋巴细胞结合，发生免疫效应的物质，包括免疫原性和反应原性两个固有属性[6]。

抗原表位，又称抗原决定簇（antigenicdeterminant，AD），指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。

抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答；抗原也借表位与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。

抗原表位的性质、数目和空间构型决定抗原的特异性。

1.2国内外研究进展

国内外研究表明，食物中的过敏原多为相对分子质量在10000～70000的糖蛋白，一般对热、酸和蛋白酶稳定[7-8]。

甲壳类动物主要过敏原为原肌球蛋白（Tropomysin，TM）．相对分子质量约为36000，对热稳定，序列保守性高，且种间能够发生明显交叉反应[9]。

另外，国外研究者从Penaeusindicus[10]、Penaeusaztecus[11]、Metapenaeusensist[12]和Parapenaeusfissures[13]等4种虾中分别纯化出相对分子量为36kDa的原肌球蛋白,并证实了其为虾的主要过敏原。

中国对虾过敏原的部分基因序列长为1034共编码264个氨基酸，密码子的偏好性强,不同海产动物过敏原基因的有效密码子及碱基含量有很大的相似性。

从基因序列和氨基酸序列的角度看，中国对虾的过敏原蛋白与其他种类海产甲壳动物的过敏原蛋白具有很强的相似性，这可能是导致海产品过敏原蛋白活性交叉反应的重要原因之一[14]。

甲壳类动物重要过敏原精氨酸激酶（Argininekinase，AK）是调节无脊椎动物能量代谢的重要酶类，其相对分子质量约为40000[15-16]。

近年来，Ayuso等人发现肌球蛋白轻链（Myosinlightchain，MLC）是凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）新型过敏原[17]，Shiomi等证实肌质钙结合蛋白（Sarcoplasmiccalcium-bindingprotein，SCP）是斑节对虾（Penaeusmonodon）新型过敏原[18]。

另外，经证实血蓝蛋白亚基（Bluebloodproteinsubunits,HCS）和磷酸丙糖异构酶蛋白（Triose-phosphateisomerase,TIM）也是甲壳类动物的重要过敏原。

随着发现的甲壳类动物过敏原越来越多，以及对食物过敏认识的不断深入，对甲壳类动物不同过敏原之间相似性分析的研究逐渐成为热点之一。

随着生物信息学的高速发展，蛋白质的序列分析、抗原表位预测、三维结构建模的研究日渐成熟。

本文也是利用生物信息学的方法，对甲壳类动物进行六种过敏原的序列分析、抗原表位预测和三维结构建模，来探明甲壳类动物六种过敏原之间是否存在相似性，以避免更多的过敏症状的发生。

1.3选题目的和意义

近年来食品安全问题受到越来越多人的重视，食物过敏已引起了人们的普遍关注。

随着人们饮食结构的巨大变化，海产品受到越来越多人的青睐，但是人们对甲壳类海产品的认识还不是很完善，使得好多消费者出现了过敏的症状。

在引起过敏的食物中，水产品是其中重要的一类。

我国是世界水产品的最大生产国，随着水产品在国民生活和出口创汇方面所占比重的逐年增加，水产品过敏发病率也有明显增加的趋势。

由于过敏的长期性和严重性，使得海产品过敏成为重要的公共健康问题。

因此加强甲壳类食物过敏原的研究，为该类食物过敏的诊断和防治提供技术依据。

本题通过对甲壳类动物6种过敏原的序列进行分析，抗原表位预测，及三维结构建模，以清楚的了解甲壳类类6种过敏原的抗原表位的结构及其序列，进而更深入地了解过6种过敏原引起过敏的发病机理，为进一步对该过敏原的研究打下基础。

1.4论文安排

（1）6种过敏原的理化性质分析

（2）6种过敏原的疏水性分析

（3）6种过敏原的跨膜区分析

（4）6种过敏原的信号肽预测

（5）6种过敏原的Coil区分析

（6）6种过敏原的亚细胞定位

（7）6种该过敏原蛋白质的二级结构预测

（8）6种过敏原的B细胞抗原表位预测

（9）6种过敏原的T细胞抗原表位预测

（10）三维结构建模

参考文献

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山东农业大学

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毕业论文开题报告

２．研究方案：

2.1研究内容

2.1.1过敏原的序列分析[19]

本文提到的6种过敏原都是蛋白质，一般包括蛋白质的理化性质、亲水性/疏水性、跨膜区、信号肽、Coil区分析及结构功能域等方面的分析。

（1）蛋白质的理化性质分析：

根据组成蛋白质的20多种氨基酸的物理和化学性质，可以对其基本参数进行分析，一般包括分子质量、分子式、理论等电点、氨基酸组成、消光系数、稳定性等理论特征。

（2）疏水性分析：

组成蛋白质的20种氨基酸各自带有不同极性的侧链集团。

氨基酸侧链的疏水性，用从各氨基酸的疏水性减去氨基酸疏水性之值来表示。

（3）跨膜区分析：

目前跨膜蛋白预测的算法都是基于统计学模型或神经网络，综合不同的软件预测结果并结合疏水性图，可获得较好的预测结果。

（4）信号肽预测：

分泌蛋白的N端约15～35个氨基酸的疏水性肽段，根据氨基酸组成及位置特征，可将信号肽划分：

分泌信号肽、脂蛋白信号肽、Pilin-like信号肽、细菌素和信息素信号肽五大类。

（5）Coil区分析：

卷曲螺旋（Coiledcoil）是蛋白质由2-7条螺旋链缠绕形成类似麻花状结构的总称。

HR是由多个七肽单元链接而成的重复序列,是典型的卷曲螺旋结构类型之一，

（6）亚细胞定位：

定位该蛋白质在细胞中的位置信息。

（7）结构域分析：

结构域是蛋白质的功能、结构和进化单元，结构功能域分析对于蛋白质结构的分类和预测有着重要的作用。

（8）motif分析：

Motif是指蛋白质分子结构中介于二级结构个三级结构间之间的一个结构层次，又称超二级结构。

（9）蛋白质的三级结构预测：

蛋白质的三级结构指的是一条多肽链在二级结构，超二级结构，甚至在结构域的基础之上，再进一步折叠盘绕，依靠次级键的固定维系所形成的一种特定的空间结构。

2.1.2过敏原的抗原表位预测

这里我们只进行B细胞抗原表位预测和T细胞抗原表位预测。

（1）B细胞抗原表位理论预测方案包括：

级结构预测方案、抗原性方案、可及性方案、电荷分布方案、可塑性方案、亲水性方案、柔韧性方案、抗原指数方案。

（2）T细胞抗原表位预测的方法主要有简单基序法、扩展基序法、矩阵法、人工神经网络法和基于分子模拟的表位预测方法。

2.1.3过敏原的三维结构建模

蛋白质的三级结构预测壳可以通过同源建模、Threadding、TPITS等方法进行，同源建模是最主要的方法。

2.2研究方法

2.2.1理化性质分析

在此将利用ProtParam工具进行分析这6种蛋白质过敏原的理化性质。

2.2.2疏水性分析

在此我使用ProtScale程序在线分析和和使用生物软件BioEdit分析其疏水性。

2.2.3跨膜区分析

在此采用TMHMM判定蛋白是否为膜蛋白，用TMpred准确预测跨膜蛋白的跨膜片段，用TMP采用多序列比对方式预测跨膜区。

2.2.4信号肽预测

在此使用SecretomeP预测真核生物中非经典类型的和无导肽的分泌蛋白。

2.2.5Coil区分析

预测蛋白质中是否含有卷曲螺旋结构，在此使用COILSServer进行分析。

2.2.6亚细胞定位

亚细胞定位预测的过程包括以下几个步骤:

（1）建立数据库，抽取出一个高质量的亚细胞定位数据集并分为训练集和测试集；

（2）从这些蛋白质数据中抽取出特征信息向量；（3）选择合适的算法，根据前面的特征信息向量作出预测；（4）用检验数据集对预测结果进行评价。

2.2.7结构域分析

在此使用SMART服务器进行蛋白质的结构域分析。

2.2.8motif分析

在此试使用PROSITE进行motif搜索。

2.2.9蛋白质的二级结构预测

在此使用SSPro4.0服务器进行预测各蛋白质的二级结构预测。

2.2.10蛋白质的三级结构预测

在此通过SWISS-MODEL同源模建各蛋白的三级结构。

过程为

（1）搜搜与目的蛋白结构序列相匹配的模板——同源蛋白，将目的蛋白与同源蛋白进行多重序列比对，确定同源蛋白的结构保守区及相应的主链框架结构。

（2）依次模建目的蛋白结构保守区的主链、结构变异区的主链。

（3）目的蛋白侧链的模建及其优化。

（4）对模建的结构进行优化和评价。

2.2.11B淋巴细胞抗原表位预测

使用DNAstar软件，对蛋白质的抗原指数，亲水性，蛋白表面可极性和柔韧性进行预测。

采用Jameson-wolf法对抗原指数进行预测，Kyte-Doolittle法预测亲水性，Enimin法预测蛋白表面可极性，Karplus-Schulz法预测柔韧性。

2.2.12T淋巴细胞抗原表位预测

在此试使用SYFPEITHI进行T淋巴细胞表位预测分析。

2.3进度安排

（1）4月6号~5月08号搜索6种过敏蛋白的相关的信息，应用相应软件（DNAstar、Bcepred等），采用不同的算法对6种蛋白的抗原指数、亲水性、蛋白表面的可及性及柔韧性进行预测，应用ProtParam、TargetP、SiganalP、ProtScale、TMHMMServer2.0、SOPMA等软件分析蛋白的结构功能。

同时进行二级、三级结构构建分析。

（2）5月09号~5月18号对预测结果进行认真的分析、总结，得出合理的结论。

（3）5月19号~5月31号阅读、翻译外文篇数：

阅读5-8篇、翻译1篇英文学术论文。

（4）6月1号~6月12号根据实验的结果认真撰写毕业论文，要严格按学校教务处规定的学位论文书写格式要求撰写，材料方法详细明确，结果可靠，并对实验结果进行分析。

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指导教师意见：

指导教师：

年月日

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参考文献注释格式

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