色谱柱清洗维护及管理规程.docx

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色谱柱清洗维护及管理规程

1.目的：

为规范色谱柱清洗、维护及管理工作，特制订本预案。

2.范围：

适用于所有实验人员。

3.职责：

制剂室主任和分析组负责人负责规程的执行和修订。

各实验室负责人负责本制度的实施，安全员负责监督实施。

制剂组所有操作人员应认真贯彻执行本制度的相关规定。

4.规程细则

4.1色谱柱的购入

新色谱柱购入时，验收人（分析组各成员）检查外包装、封口和标签是否完好，登记信息入库存台账，按照台账格式内容包括：

生产公司、品名、规格、编号、批号、货号、购进时间、

归属项目，并在色谱柱新盒子上贴上标签，注明：

编号、项目、购买人及日期，填好《色谱柱台账》后依照规定锁入特定位置（分析组06号柜）。

4.2色谱柱开启使用

每启用一根新色谱柱，在色谱柱标签上必须注明启用日期，同时台账也要注明启用日期，启用前由分析组参照说明书进行活化（即预处理方法），新色谱柱使用前最好不接检测器冲洗5min（流动相为纯甲醇或纯乙腈），一般色谱柱说明书无特殊要求建议首先用0.2ml/min的流速将色谱柱平衡过夜，然后将流速升高到1.0ml/min冲洗30分钟，以便将色谱柱的填料充分平衡至最佳状态，这样可以保证色谱柱的使用寿命，并且保证在以后的使用中，获得分析结果的重现性。

注：

1、使用人员需要认真阅读色谱柱说明书，详细了解说明书中色谱柱相关信息，说明书由分析组统一保存。

2、色谱柱活化的目的是确保键合相能充分发挥保留分离的能力并冲洗掉出厂时可能存在的其它溶剂。

3、色谱柱的正确安装方法：

按照管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀的出口相连接，柱的出口与检测器连接。

在连接管线时尽量要设法降低柱外死体积（没有绝对的能降低为0的）。

一般建议管线突出3-5mm（不同品牌色谱柱不同），但是不要用力过大拧色谱柱且要对丝拧，这样多余的管线会在安装的过程中缩回适当的位置。

安装不当会出现下图情况：

讨论问题：

厂家建议为已经开封的色谱柱3个月未使用的尽量也进行活化，建议使用50%乙腈水或甲醇水冲洗30倍柱体积（以1ml/min计不少于120min），然后再用100%乙腈活化。

我们部门是否制定？

活化后做柱效测试，柱效合格才可以真正启用并填写柱效测试记录。

柱效测试方法需要依据说明书中出厂柱效方法进行测试。

以反相色谱柱为例，C18或C8柱（ID:

4.6mm）说明书中一般流动相（具体方法需参考每款说明书）为乙腈：

水（65:

35），流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长254nm，进样量1ul，标准品溶液及浓度：

萘（1mg/ml），甲苯（0.008mg/ml），苯（0.01mg/ml），丙酮（6ul/ml），稀释液（溶剂）均为乙腈-水（75:

25），实际理论塔板数与报告中可存在20%的差异性为接受范围，一般购买入15天内最好进行测试，否则厂家可能会认为是默认验收合格。

如果内检不合格需要尽快出具图谱数据返厂检测，使用人在使用前必须掌握本色谱柱说明书中的耐受pH、温度、压力范围及存放保养注意事项（若使用人看不明白说明书中某项内容，可咨询分析组或厂家技术人员）。

注：

1、对于常规色谱柱pH耐2~8的情况下，流动相的pH一般保持在2.5~7.0较好，高pH的流动相会溶解硅胶，而低pH值的流动相会使固定的键合相脱落。

2、科普：

反相色谱柱以C18为例，普通C18是高纯硅胶基材质，有些色谱柱在实现合成基材的同时，对部分硅羟基进行封端，而且具有较好的机械强度，与普通高纯硅胶基材相比，改善碱性分析物的拖尾因子的同时，也提高了对高pH的条件的耐受性。

杂化技术多种多样（如Waters的XTerra、Xbridge、Atlantis等）

4.3色谱柱的日常清洗

色谱柱的储存液若无特殊说明，均为有机溶剂，反相柱常用甲醇、乙腈或者高比例的甲醇/乙腈-水溶液，正相柱常用脱水处理后的纯正己烷。

使用前，一定要注意色谱柱的储存液与待分析样品的流动相之间是否互溶。

在反相色谱中，如果流动相中缓冲盐的浓度较高（＞0.1mmol/L），必须在用前先用低浓度的甲醇/乙腈-水溶液10%冲洗至少10倍柱体积（至少40min），否则缓冲盐在高浓度的有机相中很容易析出，从而使色谱柱堵塞，无法恢复。

注：

以规格为4.6mm*250mm的色谱柱为例的1倍柱体积计算公式=πR2h（如3.14*0.23*0.23*25）=4.2ml

每日常规清洗流程：

1）对于流动相中含有酸、碱、盐的体系，用前需要采用10%甲醇水或10%乙腈水冲洗至少10倍柱体积（不少于40min以250mm长柱计）然后过渡到流动相中平衡至少10倍柱体积（约40min）至基线平稳方可进行当日试验（注：

内控沃特斯液相基线在0.01AU界面下是条平滑直线，在安捷伦及岛津界面下10mAU），当结束当日试验需要冲洗色谱柱时应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种溶剂替换体积应不少于20倍柱体积（不少于80min以250mm长柱计）

2）对于流动相中无酸、碱、盐的体系，由于色谱柱中保存溶剂为纯甲醇或纯乙腈，可以直接平衡流动相（注：

若流动相中有机相比例低于10%，建议过渡10%甲醇水或乙腈水后再平衡流动相）。

3）使用后色谱柱应保存在纯甲醇或纯乙腈中（特殊色谱柱除外），注意色谱柱接头Peek头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。

绝对禁止将缓冲液留在柱内静置过夜或其他方式长时间（超过12小时）保存，否则极易析晶堵塞色谱柱引起柱压急速升高或破坏填料内部结构。

注：

任何时候更换流动相时应确保溶剂是可以互溶的，不会导致盐结晶，任何时候都要避免系统压力的突然变化。

讨论问题：

1、色谱柱厂家建议使用后冲洗采用梯度洗脱方式，比如10%甲醇水或10%乙腈水，至少半小时的时间变化至100%有机相，我们是否应该要求冲洗改成梯度比较好？

目的：

对色谱柱起到缓冲的作用，有利于色谱柱的使用寿命。

个人建议今后所有色谱柱用后的冲洗均一致改为梯度冲洗。

2、长期的日常冲洗工作做不到位会直接影响色谱柱的使用寿命，目前本部门是靠自觉遵守进行冲洗，并不像总公司（无论总厂研究院或其他质控等各部门）均有色谱柱专门的使用记录（其实总厂的外围种类是超过大家想象的多，没有这些外围追踪很难做到合规），是否靠考虑明年建立每根色谱柱的专用使用记录？

还是大家目前把仪器使用记录中色谱柱的信息写清楚就可以（比如柱效没人关注写全，一旦出问题无从查找）？

4.4色谱柱故障处理方式

最常见的故障问题是峰型拖尾或变形，六大原因：

色谱柱堵塞、色谱柱填料被污染、色谱柱的柱头塌陷（不可逆）、色谱柱的柱床破坏如机械振动或长期压力急升急降（不可逆）、色谱柱填料碎裂典型的如摔碎（不可逆）、固定相流失如太高太低的pH或柱温过高（不可逆）。

堵塞或污染处理比较及时得到有可能会可逆（但是也要看故障程度），一般是柱床上端或过滤片处积累了污染物严重的情况填料也会受污染，可采取以下方法处理：

（1）首先排查是否为本身使用的流动相中盐结晶堵塞导致，如果是可以采用10%甲醇水冲洗（根据压力设置小于0.8ml/min流速）至压力恢复正常。

（2）如果柱压突然增大，咨询色谱柱厂家技术后将色谱柱出、入口端颠倒过来（反冲），建议用30倍柱体积的流动相（具体流动相种类根据色谱柱用检测的项目流动相及进样种类等信息而定，需要和厂家技术确定再执行，各厂家反相柱通常推荐用四氢呋喃、异丙醇、正己烷，注：

正己烷的那段和后段必须是异丙醇），这种强洗脱溶剂需要用纯甲醇或乙腈过渡），每种溶剂冲洗可采用低速（不超过0.5ml/min，以0.5min计每种溶剂洗脱约4个小时）冲洗。

如果柱压仍然很高，可能是柱入口处的过滤片堵塞，不建议拆下（专业人员拆下也只能死马当活马医）；

注：

不是每款色谱柱都可以反冲，有些色谱柱厂家技术人员建议：

生产的时候筛板的不同，填料工艺不同等的原因，一旦反冲柱效可能会降低1半，所以想要反冲要慎重！

维护成功会是下图情况：

（3）如果峰形变坏严重（如出现肩峰或双峰），可能上述方法起不到效果，表明柱入口柱床可能有明显塌陷，可用同型号填料将塌陷处填平（厂家专业人员进行操作）。

讨论问题：

1、按照总厂要求经维修后的色谱柱使用之前，必须经过萘甲醇的系统适用性试验符合规定后方能继续使用，本部门是否制定？

总厂专人专职做这块工作。

个人建议维修后色谱柱可以记录下前后比较数据，如柱效等的变化。

2、建议：

不同厂家的不同型号色谱柱出现故障的处理方式是不同的，比如沃特斯和安捷伦推荐冲洗方式也不同，还是应该咨询厂家技术人员进行。

比如对于买来的色谱柱我们并不清楚色谱柱两端前后的筛板孔径是否一致？

说明书中一般不写这项，但是它会影响使用，故障的时候应联系厂家技术请教维护或维修方法。

4.5色谱柱的再生

反相柱首先用纯甲醇或乙腈冲洗至少30倍柱体积，再分别用至少30倍柱体积的异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，特殊色谱柱怀疑含有难洗脱物质会继续用四氢呋喃冲洗至少30倍柱体积，完成后再以甲醇或乙腈冲洗至少30倍柱体积冲洗。

流程：

甲醇（乙腈）→异丙醇→四氢呋喃（若含难洗脱的污染物）→异丙醇→甲醇（乙腈）

注：

有些色谱柱厂家会

4.6色谱柱的报废

（1）已判定为报废的色谱柱，应在色谱柱上贴上报废的标签，并在“色谱柱登记表”上注明报废原因及报废时间。

（2）已报废的色谱柱应与正常使用的色谱柱分开存放，以防色谱柱的非预期使用。

4.7色谱柱使用注意事项

1、色谱柱在安装、拆卸时动作要轻，防止较强的机械振动以免柱床产生空隙。

避免压力和温度的急剧变化，因为温度变化或者压力突变会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行。

2、装色谱柱时应使流动相流路的方向与色谱柱标签上箭头所示方向一致。

除另有规定外，不宜反向使用，否则会导致色谱柱柱效明显降低，无法恢复。

3、流动相中所使用的各种有机溶剂应尽可能使用色谱纯，水应为纯化水或注射用水,如果流动相含盐，还应将配制好的流动相经0.45μm或0.22μm的滤膜过滤。

另外，装流动相的容器和色谱系统的在线过滤器等装置应清洁，否则将影响色谱柱寿命。

以硅胶为基质的各种键合相对酸和碱都很敏感，一般pH使用范围为2.0～8.0，应参阅色谱柱使用说明书使用。

4、反相柱，可以储存于甲醇或乙腈中，并将色谱柱两端的堵头堵上，以免干枯，室温保存。

5、流动相pH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。

解决方法：

如果因pH值使用不当，很难恢复。

6、应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从纯有机溶剂改变为全部的水，反之亦然。

大多数反相色谱柱的pH稳定范围2-8，尽量不超过该色谱柱的pH范围。

7、一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。

否则反冲会迅速降低柱效。

避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一个保护柱。

注：

一般色谱峰变形是由于柱头污染导致柱头出现不同程度的坍塌现象，导致死体积增加峰形变差。

8、每次使用后均需认真填写液相使用记录中色谱柱的相关信息。

问题：

色谱柱使用说明数据库的建立是很有必要的，这个工作希望大家全员参与进来才能体会意义，是否可行？

（1）Agilent ZORBAX Extend-C18：

安捷伦ZORBAXExtend-C18色谱柱使用创新性的双配位C18-C18键合技术，使得在高pH条件下使用硅胶基色谱柱开发高分离度分离成为可能。

在高pH条件下，不带电的碱性化合物将不与硅胶基质相互作用。

实现了具有出色峰形的高效分离，并且改善了分离度。

高pH分离对于在高pH溶液中更稳定或更易溶解的化合物的分离也是最佳选择。

适用于高pH条件的流动相缓冲液包括三乙胺、呲咯烷、氨基乙酸、硼酸盐和氢氧化铵。

氢氧化铵在pH10.5时，对于多肽和小分子LC/MS分析是非常好的流动相改性剂，与含三氟乙酸的低pH的流动相相比具有更高的灵敏度。

Extend-C18色谱柱在pH2-11.5范围内是稳定的，且对于所有类型化合物都具有良好的峰形。

Extend-C18色谱柱在低pH条件下还可以提供其他选择性。

（2）安捷伦Agilent ZORBAX SB（StableBond）色谱柱（C8、C18）特点

适合分析碱性、酸性和中性化合物；

在低pH值下比较稳定；

可使用含甲酸、乙酸或三氟乙酸的液质流动相

（3）Agilent ZORBAX Eclipse XDB液相色谱柱：

AgilentZORBAXEclipseXDB色谱柱（C18、C8、苯基和氰基）提供四种键合固定相，用于方法开发优化。

这些色谱柱可在宽pH范围（pH2-9）内提供良好的峰形，用一系列色谱柱可进行灵活的其他方法开发。

EclipseXDB色谱柱可以在低pH（2-3）条件下用于方法开发，且同样的色谱柱还可以在中等pH（6-8）范围内进行方法开发。

在中等pH范围内，残留硅醇基活性更大，且更容易发生相互作用，造成峰拖尾。

为了克服这些相互作用，EclipseXDB色谱柱通过专利工艺进行超密键合和双封端，以覆盖尽可能多的活性硅醇基。

最终碱性化合物在pH2-9范围内具有出色的峰形。

可提供粒径为1.8、3.5、5和7µm的EclipseXDB色谱柱，实现高速、高分离度、分析和制备分离。

（4）Agilent ZORBAX Eclipse Plus液相色谱柱：

对于硅胶色谱柱而言，新的Agilent ZORBAX Eclipse Plus色谱柱具有无与伦比的性能。

即使对于非常难分离的碱性化合物，也可获得出色的峰形，从而改善了这些类型的样品的柱效和分离度。

由于安捷伦在硅胶制造和键合技术方面进行了改进，因此能够获得这样优异的性能，并且这些技术完全由它捷伦控制。

Eclipse Plus柱的高性能，使其成为对所有样品进行广东开发的首选色谱柱。

如果需要进行快速方法开始并获得出色的效率，则可以选择具有高分离度，粒径为1.8µm的色谱柱。

对于标准方法，常规5µm柱和快速分离3.5µm柱是您最佳的选择。

由于提供各种粒径的填料，因此可以方便地进行方法转换。

色谱柱通过严格的QA和QC测试，使批与批的重现性也得以改进，从而可以获得所有分析的长期可靠的结果。

（5）WatersXBridge 系列色谱柱

•低pH耐受性达到业界最高水平：

 pH范围1-12，增强了在低pH条件下的稳定性，高pH耐受性提高了10倍以上。

•对所有化合物具最佳峰形和最高柱效

•在整个pH范围内（pH1-12）具无与伦比的稳定性

•低色谱柱压

•C18,C8,ShieldRP18&Phenyl四种键合相