微生物检验基础知识讲师手册.docx
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微生物检验基础知识讲师手册
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时间（h）
讲师活动
辅助讲授方式
（讨论、情景模拟、练习、其它）
相关活动
（运用案例、运用道具）
开场导入
1-4
2分钟
讲师进行自我介绍，并对本次课程实施的相关情况进行说明。
无
无
第一单元：
基础微生物学
5-36
58分钟
一、微生物概述
病毒界病毒
原核生物界细菌
生物分类系统真菌界酵母菌
霉菌
真核原生界藻类
原生动物
动物界
植物界
微生物并非生物分类学上的名词，是所有形体微小的低等生物的通称。
（一）微生物定义
微生物是一群形体微小，结构简单，肉眼看不到，只能借助光学显微镜或电子显微镜放大数100或数1000倍甚至数万倍才能看到的微小生物。
（二）按其大小、结构、化学组成分为三大类：
1、真核细胞型微生物（真核）：
真菌（酵母菌、霉菌、担子菌）、藻类、原生虫
2、原核细胞型微生物（拟核）：
细菌类（细菌、螺旋体防线菌、立克次氏体、衣原体、支原体等）、蓝细菌
3、非细胞型微生物：
病毒根据活的细胞不同分为植物病毒、动物病毒、噬菌体（寄生在放线菌体内）
（三）主要微生物的形态结构、分类
1、细菌
（1）分类
细菌按形态分
①球菌：
呈球形或椭圆形，大多数球菌直径为0.5-1m；有
单球菌、双球菌、链球菌、四叠球菌、八叠球菌、葡萄球菌。
②杆菌：
呈杆状或圆柱形；大多数杆菌直径与球菌相似，长约0.5-1.25m，宽约0.7-8m；有长杆菌、短杆菌、球杆菌、棒状杆菌。
③螺旋菌：
呈弧状、弯曲状；有弧菌、螺旋菌。
（2）细菌结构
A、基本结构及功能
①细胞壁：
细胞最外层赋予细胞特定形态，保护细胞不受高压和机械压力的破坏。
化学成分主要由粘肽（共有的）、蛋白质、脂类等组成。
②细胞膜作为渗透屏障，选择性渗透细菌体内外物质的交换，维持新陈代谢、参与呼吸作用。
化学成分基本相同，由磷脂质、蛋白质、碳水化合物组成。
③细胞浆（质）：
是细胞膜包围着的部分，是细菌的基础物质、内在环境，是细菌合成蛋白质、核酸的场所。
基础成分是水、蛋白质、核酸、脂类
④极核：
位于细胞浆内，控制着细胞新陈代谢、生长繁殖、细菌的遗传变异信息。
B、特殊结构及功能
①荚膜：
某些在细胞壁外包一层粘性物质，相对稳定的附于细胞壁外。
具有保护、能源供应的作用。
化学组成主要是多糖或多肽类。
②鞭毛：
菌体内长出的细长丝状物细菌的运动器官。
化学成分主要是蛋白质，少量糖类、脂类。
③纤毛：
比鞭毛更细、短、直、硬，数量更多的毛发状细物。
功能：
获得营养。
由蛋白质亚单位组成。
④芽孢：
某些细菌在生活的一定阶段，能在体内形成一个特殊的休眠体。
●孢子的形成
活菌——核细胞聚集（在恶劣生长条件下）——核周围有一层厚臂形成（孢子）——细胞分解，孢子释出——适宜生长条件下，孢子的膜胀破，新细胞形成。
●杀灭芽孢条件：
121℃、20分钟
160℃、2小时
判断灭菌是否彻底，一般以芽孢是否被杀灭作为标准。
（3）微生物生长与繁殖
•大多数微生物个体很小，并且繁殖速度很快。
•大肠杆菌在适宜情况下每二十分钟分裂一次，如果按这个速度繁殖，6.5小时后就可达到上百万个微生物。
大肠杆菌的个体繁殖:
时间（分钟）世代微生物数
0020=1
20121=2
40222=4
60323=8
:
:
:
40020220=1,048,576
:
:
:
144072272=4.72*1021
生长周期
生长曲线:
代表细菌在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。
滞留适应期（延迟期）
对数生长期
稳定期（最高生长期）
衰亡期
2、酵母菌
酵母菌的菌体为单细胞，通常为卵原形，也有的酵母为球形、柠檬形、香肠形及菌丝状，菌体无鞭毛，不能游动。
酵母菌比细菌的细胞个体要大的多，有的能形成假菌丝。
酵母菌属于真核生物，具有有性繁殖和无性繁殖。
无性繁殖以芽殖或裂殖为主（其中芽殖是酵母菌最主要的无性繁殖方式），有性繁殖的方式是产生子囊孢子。
3、霉菌
在培养基上生长的看到绒状，絮状蜘蛛网状的菌丝体。
一部分菌丝生长在基质中吸收养分，成为基内菌丝或营养菌丝，另一部分向空中生长，成为气生菌丝。
霉菌的菌丝有两种类型：
有隔菌丝（菌丝中有隔膜）和无隔菌丝（菌丝中无隔膜）。
霉菌的繁殖方式以产生孢子的形态繁殖分为有性孢子和无性孢子（为主）。
（四）微生物的菌落形态
1、菌落：
繁殖的菌体常以母细胞为中心聚集在一起，形成一个可见的，具有一定形态的子细菌群体。
或者说生长在固体培养基上，来源于一个细胞，肉眼可见的细胞群体。
2、获得单个菌落的方法
倾注法：
可作菌落计数，分离培养。
涂布法：
可作菌落计数，分离培养。
划线法：
只用于分离培养。
3、菌落形态
1细菌
a.大小：
<1mm为露滴状菌落,1-2mm为小菌落,2-4mm为中等小菌落,4-6mm大菌落,>6mm为巨大菌落。
b.形态：
圆形、不规则状，假根状等。
c.隆起度：
扩展，台状、低凸状、乳头状等。
d.菌落边缘：
边缘整齐、锯齿状、毛刷状等。
e.表面性状：
光滑、褶皱、同心环状等。
f.表面光泽：
金属光泽、腊状等。
g.颜色透明度：
透明、半透明、不透明等。
2酵母菌
大多数菌落与菌落相似，但菌落大而厚，而且湿润、粘稠、易被挑起。
菌落多呈乳白色，少数为红色（如红酵母）
3霉菌
菌丝扩散生长，菌丝粗而长，形成的菌落比较疏松，呈绒毛状，絮状，蜘蛛网状，菌落比较大。
生长初期无色，但生长到一定时期产生孢子而有颜色。
4、影响菌落特征的因素
•同一种微生物菌落有着相似的菌落特征。
•取决于菌落的细胞结构和生长行为。
•菌落形态大小受邻近菌落影响。
•同一菌落也受细胞空间位置不同有微小的差异。
二、影响微生物的生长条件
（一）水分
水分活性，Aw：
WaterActivity,即水溶液中能够自由运动的水分子的比例；指相同温度下纯水蒸汽压与食品中水的蒸汽压的比率，可以通过对食品体系中的有效含水量来测定。
1、Aw＜0.9，大部分细菌生长受到抑制
2、不同种类微生物对干燥的抵抗力不同：
革兰氏阳性菌抵抗力大于阴性菌，球菌大于杆菌，霉菌、酵母菌的孢子和具有芽孢的细菌抵抗力强
3、不同环境对干燥的抵抗力不同：
糖、淀粉、蛋白质等物质存在时，抵抗力强。
温度越低，抵抗力强。
（二）温度影响微生物生命活动的重要因素之一
种类最低最佳最高
嗜热菌40—4555—7560—90
嗜温菌5—1530—4535—47
嗜冷菌-5—512—1515—20
低温菌-5—525—3030—35
（三）酸碱度
1、大部分细菌在PH=5-8生长良好，霉菌、酵母菌在PH=2-6生长良好。
2、PH小于2时，任何微生物都不能生长。
3、致病菌不能在PH低于4.5的条件下生长。
芽孢不能在PH低于4.5的条件下生长。
（四）气体
1、需氧菌：
仅在有氧的环境中生长，如霉菌。
2、厌氧菌：
仅在无氧的环境中生长。
3、兼性厌氧菌：
在有氧和无氧的环境中均能生长。
如有些芽孢、酵母菌。
（五）营养元素
碳、氢、氧、氮、硫、磷、矿物质。
单元回顾：
微生物的定义、结构、分类、生长条件
无
无
第二单元：
乳中微生物
37-46
30分钟
一、乳中的微生物
1、病原微生物：
不改变乳的性质，但对人、畜健康有害，通过乳传播各种流行病。
如溶血性链球菌、乳房炎链球菌、沙门氏菌。
2、有害微生物：
引起乳的腐败变质。
如低温菌、蛋白分解菌、脂肪分解菌、产酸菌、大肠杆菌。
3、有益微生物：
在干酪、酸性奶油及酸奶乳品方面的作用。
（一）乳中的细菌
1、乳酸菌
（1）乳链球菌
①乳链球菌：
椭圆形、一般呈双球或短链球状、不形成孢子、G+。
可能来自毛、粪、挤乳桶。
②嗜热链球菌：
椭圆形、一般呈双球或短链球状、G+。
③乳脂链球菌：
球形或椭圆形、连接两个呈短链球状、不形成孢子、G+。
④粪链球菌：
椭圆形、一般呈双球或短链球状、不形成孢子、G+。
存在于动物肠道粪便。
⑤嗜柠檬酸链球菌：
球形、连成两个或呈锁链状、不形成孢子、G+。
（2）明串珠菌属
（3）乳酸杆菌
①保加利亚乳杆菌：
呈棒状、有时呈长、大链状。
②嗜酸乳杆菌：
菌体细长形，可单独存在或2-3个形成短链状存在。
主要存在于动物肠道。
③干酪乳杆菌：
呈细长链状，不形成孢子、G+。
2、肠杆菌科
⑴埃希氏菌属：
只含有大肠埃希氏菌，是一种G-短杆菌。
污染源主要是牛粪便、牛体和挤乳员的手。
⑵肠杆菌属：
主要是产气肠杆菌。
存在于土壤、水、粪便，菌体为短杆状，有时单个、有时量各或短链状，不形成孢子、G-。
⑶耶尔森氏菌属
3、丙酸菌：
分解碳水化合物产酸产气、G+短杆菌。
4、丁酸菌：
菌体呈单个或两个相连接，形态有时呈链状，G+。
污染源是牛粪、含有牛粪的土壤和水源。
5、假单孢菌属：
低温下生长繁殖，可分解脂肪产生脂肪分解臭。
6、小球菌属：
产生色素、G+球菌，存在于土壤、水、动物皮肤。
7、产碱杆菌属：
G-、存在于动物肠道、水。
8、孢子杆菌：
有枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌等，G+芽孢杆菌，存在于土壤、水、尘埃、饲料。
（二）乳中酵母菌、霉菌
①易脆酵母：
能使乳糖形成酒精和二氧化碳，生产牛乳酒的菌种。
②园酵母菌属：
发酵乳糖，污染时使干酪和炼乳罐头膨胀。
③假丝酵母菌属：
氧化分解力很强，使乳酸分解成CO2＋H2O,用于酒精发酵。
④有害菌：
根霉、毛霉、曲霉、青霉、串株霉等。
产生霉味、变质、发黑、斑点
⑤有益菌：
米曲霉、百地霉、沙门柏干酪青霉主要用于干酪、酸败乳、酸性奶油生产中，产生特殊风味。
（三）乳中的噬菌体
是侵入微生物中病毒的总称。
分布：
存在加工乳、乳清发酵剂的地方
分为潜伏期、裂殖期
杀灭条件：
1）加热破坏：
65℃、5分；75℃、15分；90℃、40分
2）消毒剂：
次氯酸钠、含活性氯的漂白粉溶液处理器具；有效氯剂喷雾、空气。
3）紫外线照射：
菌体浓度、照射量、距离。
二、牛乳微生物的污染来源
（一）乳房中的微生物
在一般健康乳牛的乳房内，总有一些细菌存在。
由于这些细菌能适应乳房的环境而生存，因此，就把这些细菌统称为乳房细菌。
乳房内细菌主要存在于乳头管及其分枝处。
其中以小球菌属和链球菌属最为常见，其它棒状杆菌属和乳杆菌属等也可出现。
（二）挤乳过程中的微生物
1、环境：
牛舍空气、垫草、饲料、牛的粪便和土壤等，都含有大量的微生物。
2、不洁的牛体附着的尘埃和牛粪：
含菌量可达几亿到几百亿，挤乳时它们极易散落到牛乳中。
多数属于带芽孢杆菌、大肠菌群等。
3、乳房、乳头的清洗程度：
挤乳时都要用温水彻底清洗乳房。
未清洗7058个/ml、已清洗718个/ml。
4、挤乳用具和盛乳容器：
附着的细菌多为耐热球菌，还有八叠链球菌和杆菌。
5、挤乳工人和其他管理人员也会把微生物带入乳液。
如：
挤乳前，工人的手未严格清洗消毒，可能将微生物带入乳液；工作人员如是呼吸道或肠道传染病的带菌者，可能将病原菌传播到乳液中。
（三）挤乳后微生物的污染和繁殖
乳液挤出后，应进行过滤、冷却，在此过程中所接触的空气、过滤器、容器等，都可能使其再污染微生物。
原料乳如果不及时加工或冷藏，乳液中的微生物就会增殖。
（四）控制微生物的繁殖和污染
控制
环境：
挤乳前应将牛舍通风，并用清水喷洒地面，以减少舍中的尘埃。
挤乳后再进行喂饲。
清洗：
在挤乳前，牛的乳房和乳头、挤乳工人的手应经严格的清洗消毒。
贮奶桶在使用后应及时进行清洗消毒。
挤乳：
挤乳时要弃去最先挤出的少数乳液。
设备与运输：
管道、设备、滤布等应定时清洗杀菌。
冷却：
乳液挤出后，应及时进行冷却，使乳温下降至10℃以下。
贮存时间：
尽量缩短。
三、原料奶质量对UHT的影响
（一）细菌总数
1.其中的致病菌可能产生非常耐热的毒素。
2.其中的嗜冷菌会产生非常耐热的酶类。
3.大量的细菌繁殖会加快产酸，导致蛋白不稳定。
（二）芽孢与耐热芽孢在贮存过程中会逐渐转变为细菌的营养体。
（三）嗜冷菌会产生蛋白酶和脂肪酶。
四、灭菌和消毒
（一）概念
1、灭菌：
杀死物体中所有的微生物包括病源及非病源微生物的方法（包括芽孢和繁殖体）。
2、消毒：
（用物理或化学方法）杀死物体中病原微生物的方法。
3、防腐：
阻止或抑制微生物生长繁殖的方式。
4、商业无菌：
罐头食品经过适度的热杀菌以后不含有致病的微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病微生物，这种状态称为商业无菌。
（商业无菌必须符合以下条件：
不含有致病微生物、不含微生物毒素、在正常的仓储、运输条件下微生物不繁殖。
）
5、无菌：
不含有活的微生物。
6、无菌操作：
防止微生物进入机体或物体的方法。
（二）物理因素
1、温度：
高温之所以能引起微生物死亡，主要是由于高温使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，代谢发生故障而死亡。
灭菌（消毒）类型
温度与时间
杀菌范围
灭菌物品
干热灭菌法
火焰灭菌
火焰灼烧
全部微生物
耐热物品、接种环、试管口等
热空气灭菌
160℃2h
芽孢、繁殖体
玻璃器皿、金属用具、等耐热物品
湿热灭菌法
煮沸法
100℃15-20min
繁殖体
消毒刀剪、注射器、针头等
流通蒸汽灭菌法
100℃15-30min
繁殖体
易被高压蒸汽灭菌破坏的物品
间歇灭菌法
反复多次流通蒸汽
芽孢、繁殖体
巴氏消毒法
低温长时间
61-65℃30min
90％细菌、全部病原菌
啤酒、葡萄酒、牛奶等
高温短时间
71-72℃15min
超高温瞬时
＞1321-2s
高压蒸汽灭菌法
121℃15-30min
全部微生物
普通培养基、生理盐水、玻璃器皿等
湿热灭菌法比干热灭菌法好：
（1）湿热灭菌时菌体蛋白质由于吸收水分较易凝固。
（2）湿热的穿透力比干热大。
（3）湿热灭菌时蒸汽与物体接触，凝结成水。
放出潜热，提高物体温度。
2、紫外线：
非电离辐射、穿透力弱
（1）灭菌机制：
菌体中核酸吸收紫外线照射后，由于产生光化学作用而损坏核酸中DNA，导致微生物变异致死。
（2）作用范围：
不能穿过普通玻璃，杀菌作用仅局限于物体表层，一般用于空气消毒、表面消毒。
3、过滤：
采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。
（1）原理：
通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，把各种微生物菌体留在筛子上面，达到除菌的目的。
（2）适用范围：
适用于一些对热不稳定的、体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。
（3）优缺点：
最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。
缺点是比细菌还小的病毒仍然留在液体培养基内。
（三）化学因素
1、消毒防腐剂
（1）作用原理：
●使病原微生物蛋白质变性或凝固，发生沉淀。
●破坏菌体的酶系统，影响病原体的代谢。
●降低微生物表面张力，能破坏细胞膜的通透性，使细胞发生破裂或溶解。
（2）常见种类、用途
类别
名称
常用浓度
应用范围
作用机理
备注
重金属盐类
红汞
2%
皮肤、粘膜、小创伤消毒
蛋白变性酶失活
不能用于食品
硝酸银
1％
新生儿滴眼
同上
硫柳汞
0.1％
皮肤、手术部位消毒
同上
毒性小、杀菌力强
氧
化
剂
高锰
酸钾
0.1％
皮肤、粘膜、蔬菜、水果、碗、筷等消毒
与蛋白质中活性基团反应酶失活
过氧
化氢
3％
皮肤、伤口和食品的消毒
同上
过氧
乙酸
0.05-0.5％
塑料、玻璃制品、布、环境卫生、水果、蔬菜等
同上
高效、广谱、有点刺激性
卤素及其化合物
氯气
0.2-1ppm
饮用水消毒
同上
漂白粉
0.5-5％
饮用水、水果、蔬菜、环境卫生
同上
碘酒
2或3-5％
一般皮肤或手术部位皮肤消毒
同上
酚类
石炭酸
2-5％
吸管、空气消毒
破坏细胞膜
来苏尔
1-2％
手、皮肤消毒
同上
3-5％
器械、地面消毒
醇类
乙醇
70-75％
皮肤、体温计外科器械消毒
脱水、蛋白质变性
不适合伤口粘膜处消毒
醛类
甲醛
2-10％
房间、器械、衣服消毒
蛋白质变性
不适用于食品生产场所
表面活性剂
新洁
而灭
0.05-1％
皮肤、器械消毒
破坏细胞膜、改变通透性
杜灭芬
0.05-1％
皮肤、器械消毒
同上
染料
龙胆紫
2-4％
外用药水
干扰细胞氧化过程
酸类
醋酸
3-5ml/M3
空气消毒
乳酸
0.33-1mol/L
空气消毒
碱类
石灰水
1-3％
地面消毒
2、化学治疗剂：
能直接干扰病原微生物的生长繁殖，用于治疗感染性疾病的化学药物。
单元回顾：
微生物的危害、污染来源、消毒灭菌
第三单元：
坏包分析基础知识
47-66
84分钟
一、坏包分析的目的
1、了解坏包的概念、类型（酸包、苦包、胀包及其他现象）
2、初步鉴定引起坏包的微生物类群
3、分析坏包造成原因
4、排除微生物事故（故障排除有直接排除法和系统排除法）
5、坏包分析鉴定是系统排除故障的其中一部分
6、直接排除法：
是根据经验判断操作过程中失误，直接进行排除，优点：
时间短、成本低，缺点：
不能真正找到原因。
7、系统排除法：
根据生产过程个参数及信息的收集，进行分析判断，查找产生故障的原因。
优点：
能够找到真正原因，能够彻底排除；缺点：
耗时长、浪费人力、物力；投入成本高。
1、启动条件
1）包装无明显破损。
2）由微生物污染引起的坏包。
酶类及化学反应用不同的查验方式
注：
酶或化学反应也可改变和破坏产品。
因而在对是由微生物造成的腐败还是酶或化学原因造成的破坏时，必须采取完全不同的查验方式。
2、样品选择
1）目地样：
同一批次，同一取样原因，取坏包表现性状相同的任意1—2包进行细菌的培养及初步鉴定。
如表现性状不同，针对不同表现性状的坏包分别取1—2包进行细菌的培养及初步鉴定；如不同取样原因，针对取样原因分别取表现性状相同的坏包任意1—2包进行细菌的培养及初步鉴定。
2）随机样：
不同时段出现坏包，针对时段分别取表现性状相同的坏包任意1—2包进行细菌初步鉴定；相同时段出现坏包，针对不同表现性状的坏包分别取1—2包进行细菌初步鉴定。
3.记录样品
记录样品、描述所观察到的产品腐败类型（信息须全面）
名称、批号、取样原因、时间、样品感官、pH值、酸度、气体形成，包装密封性，微生物鉴定结果等。
4.样品处理准备（已开包、未开包）
1）酸包：
检测时发现产品感官及pH值有明显变化时，需快速将酸包产品的内容物移入无菌容器内（移入时需用75%的酒精棉对操作员手及开包产品的移出口进行擦试灭菌），并需快速检测。
如不能检测，需冷藏保存2小时内进行检测。
2）胀包：
使用75%酒精棉对样品外表面擦试消毒后放于超净台内待检。
检测时，以无菌操作在无横纵封处剪一半圆或三角取样。
5.检测：
以无菌操作进行检测
目的：
分离引起腐败的微生物，表明产品出现的问题是否由于微生物造成的
检测项目：
A:
低酸产品：
检测细菌、芽孢、耐热芽孢，必要时检测霉菌、酵母菌。
当pH值降到5.2以下，需检测乳酸菌。
乳酸菌检测见GB/T4789.35-2003。
B:
高酸产品：
检测细菌、霉菌、酵母菌。
1）细菌：
取1ml混合均匀的样品接种于培养皿中，及时将凉至46℃的脑心浸液培养基注入平皿约15ml，并转动平皿使之混匀；另用接种环蘸取牛奶在脑心浸液培养基平板上划线；同时将脑心浸液培养基注入平皿内做空白对照；36±1℃培养48小时。
2）芽孢、耐热芽孢：
取5-10ml样品于两个灭菌试管（18×180mm）中，分别在80℃和100℃的水浴中保温10min，也可根据坏包情况选择适合的保温温度和时间，冷却。
a:
取80℃水浴中保温样品1ml接种于培养皿中，及时将凉至46℃的脑心浸液培养基注入平皿约15ml，并转动平皿使之混匀；另用接种环在凝固的脑心浸液培养基上作芽孢的划线，（30-35）℃培养72h。
b:
取100℃水浴中保温样品1ml接种于培养皿中，及时将凉至46℃的脑心浸液培养基注入平皿约15ml，并转动平皿使之混匀；另用接种环于凝固的脑心浸液培养基平板上作耐热芽孢的划线；同时将脑心浸液培养基注入平皿内做空白对照；分别作（30-35）℃/72h、（50-55）℃/72h培养。
3）霉菌、酵母菌：
取1ml混合均匀的样品接种于培养皿中，及时将凉至46℃的霉菌、酵母菌培养基注入平皿约15ml，并转动平皿使之混匀；另用接种环于凝固的霉菌、酵母菌平板上作划线，在（28±1）℃的条件下培养5天。
6、坏包分析注意事项
1）对已开包的酸包胀包要马上转移到无菌瓶中，已防二次污染。
2）根据坏包性状，如样液粘稠、凝固等情况下也可以只做划线培养。
3）根据坏包的不同表现状态适当的选择培养项目。
4）做微生物培养的同时测定感官、理化指标，注意其有何变化。
5）检查包装完整性。
1、菌落形态记录
2、单、复染色（制片、染色、显微镜观察）
1）细菌染色方法有单染和复染，单染有苯胺黑染色和美兰染色；复染有革兰氏染色。
单染色目的：
鉴别球菌和杆菌。
（对于球菌，不一定需要G染色，因为G-球菌不会成为液体食品中的腐败菌，可直接进行H2O2酶实验；对于杆菌，需进行G染色，鉴别G-或G+,有无芽孢形成等。
）
2）、为什么要染色：
细胞与背景色差增大，轮廓清晰
3）单染色原理：
用一种染色剂对涂片进行染色，简便易行，适于进行微生物的形态观察。
在一般情况下，细菌菌体多带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。
因此，常用碱性染料进行单染色，如美兰、孔雀绿、结晶紫和中性红等。
4）革兰式染色原理：
G+菌：
细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。
Gˉ菌：
肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。
5）染色步骤：
涂片固定——结晶紫初染1min水洗吸干——碘液媒染1min水洗吸干——95%乙醇脱色30S水洗吸干——沙黄复染1min水洗吸干——镜检
染色各步骤的作用：
固定目的：
A、杀死微生物，固定细胞结构。
B保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。
D改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。
各试剂的作用：
1）结晶紫：
结晶紫可使菌体着色——初染
2）碘液：
能使菌体与初染颜色更加紧密（增强染液与菌体间的作用力。
）——媒染
3）酒精：
95%酒精能分辨出菌体着色的牢固程度（测知染料与被染物之间结合的牢固程度，具有鉴别细菌的作用）。
——脱色
4）沙黄：
番红复染能使革兰氏阴性菌着第二种色（使已脱色的菌体重新染上与前染液颜色成明显对比的颜色。
）。
——复染
3、镜检：
革兰氏阴性菌红色，革兰氏阳性菌紫色
4、革兰氏染色过程中应注意的事项：
1）接种环接的菌不能太多，防止涂片太厚，不易脱色。
2）干燥（固定）：
要在酒精灯的高处微微加热，使水分蒸发，切勿紧靠火焰或加热时间过长，防止菌体烧焦变形。
5、显微镜操作：
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