基因工程试验综合.docx

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基因工程试验综合

实验一大肠杆菌基因组DNA提取与检测

一、目的要求

1．学习并掌握用试剂盒提取细菌基因组DNA；

2.学习使用分光光度计检测基因组DNA浓度

二、基本原理

　　本实验利用TaKaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKitVer.2.0试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA。

该试剂盒采用了溶菌酶裂解细胞，由细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA，然后使用特殊的相分离法除去蛋白质、多糖、脂质等杂质，再结合DNA制备膜技术纯化细菌基因组DNA。

三、实验材料

1.实验菌株：

大肠杆菌TG1

2.实验试剂：

LB液体培养基

TaKaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKitVer.2.0试剂盒

无水乙醇

3.实验仪器：

移液枪，低温离心机，水浴锅，eppedorf管，振荡器

四、操作步骤　　

1.大肠杆菌的培养：

从平板培养基上挑选单菌落接种至1～4ml的液体培养基中过夜培养。

2.取1～4ml的过夜培养菌液，10,000rpm离心2分钟，弃上清。

3.用150μl的SPBuffer（含RNaseA1）充分悬浮细菌沉淀。

注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。

4.加入20μl的Lysozyme溶液，均匀混合后室温静置5分钟。

5.加入30μl的EDTABuffer，均匀混合后室温静置5分钟。

6.加入200μl的SolutionA，剧烈振荡后65℃保温10分钟。

注）①若SolutionA出现沉淀，请于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。

②65℃保温10分钟后，溶液将由乳浊液变成透明液。

如果此时溶液没有变成透明，说明细菌没有裂解，基因组DNA将不能释放。

7.加入400μl的SolutionB，剧烈振荡15秒。

注）若SolutionB出现沉淀，请于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。

8.加入650μl的SolutionC，上下颠倒均匀混合。

9.12,000rpm离心1分钟。

10.先弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）移入预先置于1.5ml离心管上的FilterCup中，12,000rpm离心1分钟。

注）有机相（上层）请务必除尽，否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上。

11.弃FilterCup，在滤液中加入450μl的DBBuffer，混合均匀。

12.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。

13.将上述操作11的混合液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

14.将500μl的RinseA加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

15.将700μl的RinseB加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

注）请确认RinseB中已经加入了指定体积的100%乙醇。

请沿SpinColumn管壁四周加入RinseB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。

16.重复操作步骤15。

17.将SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm离心1分钟。

18.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入60μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1分钟。

注）把水或ElutionBuffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。

19.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。

20.取5μlDNA洗脱液用琼脂糖电泳进行检测

20.取10μlDNA洗脱液用分光光度计检测其浓度及纯度，其余-20℃保存

实验二基于16SrRNA基因的PCR扩增、电泳和胶回收

一、实验目的

1.了解PCR扩增DNA的技术及原理；

2.学习PCR扩增仪的使用；

3.学习琼脂糖凝胶的制备和电泳方法；

4.了解DNA胶回收的原理及方法。

二、实验原理

随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，16SrDNA基因同源性分析是一种常用的细菌分子鉴定方法。

细菌中包括三种核糖体RNA，分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。

16SrDNA是编码原核生物核糖体RNA小亚基16SrRNA的基因，长度为1540bp，相比较5SrRNA和23SrRNA而言，长度适中，又具有保守性和存在的普遍性，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，因此，现在一般普遍采用16SrRNA作为序列分析对象对细菌进行测序分析。

16SrDNA鉴定是利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。

包括细菌基因组DNA的提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤，是一种快速获得细菌种属信息的方法。

聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是在引物指导下由酶催化的对特定模板的扩增反应，是一种体外DNA扩增技术。

PCR的工作原理（图1）类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。

PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。

反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。

PCR反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的DNA聚合酶作用下，以变性的单链DNA为模板，从引物3ˊ端开始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA链。

这样经过一个周期的变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA。

PCR反应一般30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。

常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，变性温度为95℃，复性温度为37℃～55℃，延伸合成温度为72℃，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95℃左右的高温而不失活），反应循环数为30。

图1PCR反应原理

PCR是否成功，需要利用琼脂糖电泳进行检测。

琼脂糖电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

PCR后往往有非特异条带出现，为了获得专一的目的条带，所要对PCR产物进行切胶回收。

胶回收是利用特殊硅基质材料在高盐、低pH值情况下吸附DNA，在低盐、高pH值情况下释放DNA的原理纯化获得目标DNA。

DNA胶回收后同样需要利用电泳进行检测。

三、实验材料

1、实验器材

PCR扩增仪，台式高速离心机，移液器，灭菌后的PCR管，电泳仪，凝胶成像仪等。

2、实验试剂

（1）模板DNA（0.1µg/µl）。

（2）TaqDNA聚合酶（5U/µl），10×扩增缓冲液，dNTP（1mmol/l）

（3）引物27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和518R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）（20µmol/l）

（4）TAE缓冲液（50×）（pH8.0）：

每升溶液中含有242gTris，57.1ml冰乙酸，100ml0.5mol/lEDTA。

电泳时稀释成1×浓度使用。

（5）溴酚兰-甘油指示剂：

先配制0.1%溴酚兰水溶液，然后取1份0.1%溴酚兰溶液与等体积的甘油混合即成。

（6）0.5μg/ml溴乙啶染液：

称取5mg溴乙啶，用重蒸水溶解定容到10ml，取1ml此溶液用1×TAE缓冲液稀释到1升，最终浓度为0.5μg/ml。

（7）琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根，中国）

四、实验步骤

1、准备PCR反应溶液

（1）按以下次序，将下列成分在0.5ml灭菌Eppendorf管内混合：

模板DNA1µl

10×扩增缓冲液5µl

4×dNTPs（包括四种dNTP,100µmol/l）1µl

27F1µl

518R1µl

TaqDNA聚合酶1µl（2.5U）

加水至终体积50µl

（2）用手指轻弹Eppendorf管底部，使溶液混匀。

在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底。

（3）加石蜡油10µl封住溶液表面。

2、PCR扩增反应

将混有菌体的PCR管置于PCR扩增仪内，95℃5分钟，使模板DNA完全变性。

然后按95℃变性30秒，50℃退火45秒，72℃延伸2分钟，重复循环30次，循环结束后72℃延伸10分钟。

反应完毕，将样品取出置-4℃待用。

3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

（1）制胶：

称取琼脂糖粉末，置于三角瓶中，加入TAE缓冲液配成0.8%的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，待溶液温度降至65℃时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。

在室温放置0.5～1h，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳。

然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。

（2）加样：

取5µlPCR产物，加入1/4体积的溴酚兰-甘油指示剂，混匀后小心地加到样品槽中。

同时另取一个已知分子量的标准DNA水解液，在同一凝胶板上进行电泳。

（3）电泳：

维持恒压100V，电泳0.5～1h，直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部，停止电泳。

（4）染色：

将凝胶取出后浸入0.5mg/ml溴乙啶溶液中，染色0.5～1h。

染液可反复多次使用。

（5）观察：

将凝胶板置于254nm波长紫外灯下进行观察，DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。

4、PCR产物胶回收

使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

（1）柱平衡步骤：

向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（请使用当天处理过的柱子）

（2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。

（3）向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100µl，则加入100µlPN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。

注意：

对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。

（4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000rpm（~13,400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

注意：

吸附柱容积为800μl，若样品体积大于800μl可分批加入。

（5）向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

注意：

如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2-5min再离心。

（6）重复操作步骤5。

（7）将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm（~13,400×g）离心2min，尽量除尽漂洗液。

将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

注意：

漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

（8）将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。

12,000rpm（~13,400×g）离心2min收集DNA溶液。

注意：

洗脱体积不应小于30μl，体积过少影响回收效率。

洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。

若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

DNA也可以用缓冲液（10mMTris-Cl,pH8.0）洗脱。

为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm（~13,400×g）离心2min，将DNA溶液收集到离心管中。

5、胶回收产物的琼脂糖凝胶电泳

同上

实验三基因克隆---连接、转化

实验目的和要求

了解基因克隆技术的流程和原理，掌握将外源DNA与载体进行连接的方法，掌握对感受态细胞进行转化的步骤。

实验原理

通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。

pMD18-TVector（大连宝生物公司）是一种高效克隆PCR产物（TACloning）的专用载体。

它是TaKaRa独自研究开发，由pUC18载体改建而成的。

在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3'端添加“T”而成。

因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

本制品是以最为常用的pUC18载体为基础研制而成，所以它具有同pUC18载体完全相同的功能。

此外，本制品中的高效连接液LigationSolutionI可以在极短的时间内（30分钟-1小时）完成连接反应，大大地方便了实验操作。

另外，本制品中还含有ControlInsert（500bp），可用于Control反应。

其用途是克隆PCR产物。

α互补和蓝白筛选的原理：

许多载体（包括pMD18-T）都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子和编码其N端氨基酸（α肽链）的片断基因。

宿主具有编码β半乳糖苷酶的C端基因。

当二者产物组合在一起，就具有活性酶的产生，此现象称为α互补。

由α互补形成的具有功能活性的β半乳糖苷酶,可以用X-gal显色测定出来，它能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和蓝色底物。

当外源DNA片断插入到多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽链，而导致不能形成功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色的，而没有插入外源片断的则是蓝色的。

仪器

超净工作台、金属浴、恒温摇床、台式离心机、制冰机、微量移液器

试剂

（1）pMD18-TVector试剂盒；

（2）PCR扩增回收纯化的片段；

（3）LB液体培养基：

蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g；加800ml去离子水，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1000ml，高压（1.034×100000Pa）灭菌20min，4℃保存； 

（4）LB固体培养基：

在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%，高温、高压灭菌20min后降温至50~60℃，在无菌状态下铺制平板，室温放置过夜后，置于4℃保存； 

（5）氨苄青霉素贮存液：

用无菌双蒸水配成100mg/ml，分装，-20℃保存。

使用时终浓度为100μg/ml。

（6）X-gal（20mg/ml）的配制：

将20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存； 

（7）IPTG（200mg/ml）的配制：

将0.2gIPTG溶于1ml去离子双蒸水中，0.22μm滤膜除菌，-20℃保存备用；

操作步骤

（一）目的片段与载体的连接

按照连接试剂盒说明书进行操作。

1.在微型离心管中制备下述连接反应液，全量为10l。

DNA

适量

pMD18-TVector

1.0μL

SolutionⅠ

ddH2O

5.0μL

适量

总体积

10.0μL

2.16℃反应30分钟（过夜反应也不影响连接效率）。

注）①室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

③长片段PCR产物（2kbp以上）进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时。

（二）转化

将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞（已制备好）中

3.全量（10l）连接产物转化至100lDH5a感受态细胞中，冰中放置30分钟。

4.42℃金属浴加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。

5.加入890μlLB培养基，37℃振荡培养60分钟。

6.每个LB培养平板中加入40μlX-gal和4μlIPTG，然后吸取100μl菌液，用无菌玻棒将溶液涂匀，均匀涂布于含Amp的LB固体培基平板上；37℃培养箱中正放1h，待菌液完全被吸收后，将平板倒置，过夜培养16h。

注意事项：

1.LigationSolutionI请于冰中融解。

2.pMD18-TVector的使用量

取0.5μl实验也可得到满意的结果。

实际操作时，可按实验需要确定T载体的使用量。

pMD18-TVector1μl（50ng）的摩尔数约为0.03pmol。

3.InsertDNA的使用量

在进行克隆时，VectorDNA和InsertDNA的摩尔比一般为：

1：

2～10。

我们可以根据自己的实验情况选择合适的VectorDNA和InsertDNA的摩尔数比。

InsertDNA使用量的计算方法如下：

InsertDNA的使用量（ng）=nmol数×660×InsertDNA的bp数

4.克隆时使用的InsertDNA片段（PCR产物）尽量进行切胶回收纯化，PCR产物中的短片段DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。

5.感受态细胞可使用适合于pUC系列载体的感受态细胞，如：

JM109，DH5a等。

6.阳性对照实验。

为了确认实验操作的正确性以及实验试剂的有效性，我们建议进行阳性对照实验。

按照实验操作方法，使用试剂盒中提供的ControlInsert。

实验四质粒的提取与阳性克隆检测

一、目的要求

1．学会用质粒小抽试剂盒提取质粒；

2．掌握质粒DNA双酶切的原理和操作方法。

二、基本原理

质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。

通常采用碱裂解法裂解细菌，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。

离心吸附柱中采用的硅基质材料，能高效、专一吸附DNA。

以下操作步骤适用于从1-5ml过夜培养的大肠杆菌LB（Luria-Bertani）培养液中，快速提取多至20μg纯净的高拷贝质粒DNA。

提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选等。

限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。

根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）。

Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。

III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。

三、仪器与试剂

台式离心机、移液器、水浴锅、电泳仪，紫外成像系统

质粒小抽试剂盒（离心柱型）；限制性内切酶：

BamHI（takara:

编号1010A）和pstI

（takara:

编号1073A）；琼脂糖；TAEbuffer

四、操作步骤

1、挑取单克隆培养过夜

在平板上挑取白色克隆，置于1mLLB液体培养基中，200rpm震荡培养过夜。

2、质粒提取

使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

2.1.柱平衡步骤：

向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（请使用当天处理过的柱子）

2.2.取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

2.3.向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

注意：

如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

2.4.向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

注意：

温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。

此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。

如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

2.5.向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。

12,000rpm（~13,400×g）离心10min。

注意：

P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。

如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

2.6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。

12,000rpm（~13,400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

2.7.可选步骤：

向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm（~13,400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。

如果宿主菌是endA+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。

如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可省略。

2.8.向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

2.9.重复操作步骤2.8。

2.10.将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm（~13,400×