分子综合性实验论文终稿 任佳.docx
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分子综合性实验论文终稿任佳
编号
实验类型
综合性试验
成绩
生物学综合实验
ComprehensiveExperimentofBiology
论文题目
Pfu酶的表达，纯化及功能分析
作者姓名
任佳
学号
2010114010117
所在院系
生命科学学院
学科专业名称
生物科学
导师
王友如
论文完成时间
2013年03月02日
Pfu酶的表达，纯化及其功能分析
任佳
指导老师：
王友如
（湖北师范学院生命科学学院，生物科学1001班，湖北，黄石435002）
摘要：
目的：
利用重组大肠杆菌DH5α表达pfu酶，并对其功能进行分析。
方法：
含pfuDNA聚合酶基因的重组大肠杆菌DH5α。
经1mMIPTG诱导表达10-12小时后,用超声波破壁，再用用80℃,30min热变性去除部分杂蛋白,粗酶液经Ni离子亲和层析进一步纯化。
最后用PCR检验酶的活性。
结果：
获得了高纯度的重组pfu酶,并发现其具有较高的活性，利用该酶成功扩增出VHB的DNA片段。
关键词：
pfuDNA聚合酶；IPTG诱导；纯化；活性。
Expression,purificationandfunction
researchofpfuDNApolymerase
RenJia
Tutor:
WangYouru
（CollegeofLifeScience,HubeiNormalUniversity,Huangshi,HubeiProvince））
Abstact:
Aim：
ExpresspfuDNApolymeraseinE.ColiDH5α，thenpurifyitandresearchitsfunction.Method:
E.ColiDH5αcontainingpfuDNApolymerasesgene,10-12hafter1mMIPTGaddition,werewall-brokenbyultrasonicwave.Theextractionwerepurifiedbyheattreatment（80℃，30mintodenatureE.Coliproteins）,followedbymetal-affinitychromatographyonNi2+-Sepharosecolumns.Conclude:
WegotpfuDNApolymeraseafterpurification,thenfoundthattheenzymeswerecharacterizedanddisplayedhighDNApolymeraseactivity.WeuseitsuccessfullyinamplificationofVHBgene.
Keywords：
PfuDNApolymerases；IPTGaddition；Purification；Activity.
PfuDNA聚合酶是从超高温古生菌强烈炽热球菌（Pyrococcusfuriosus）中分离得到的，拥有3′→5′外切酶活性,这使它在PCR扩增过程中能够校正错误,是已知DNA聚合酶中出错率最低的,特别适用于需要高保真度的PCR扩增[1]，被认为有潜力取代目前广泛使用的Taq酶。
Pyrococcusfuiosus最早是在意大利Vulcano地热海底沉淀物中发现的。
PfuDNA聚合酶基因编码一个775个氨基酸的多肽,分子量90,109D。
这种酶最初是直接从Pyrococcusfuiosus中分离得到的,但因这种极端嗜热的厌氧菌很难培养,难以获取大量的酶。
本项目通过修饰引物使Pfu基因末端引入His-tag编码序列，从已有Pfu基因的载体上把它克隆下来，重新连接入更易表达的pET-28a载体中，并在大肠杆菌DH5α中大量表达，通过纯化使其与商用Pfu酶活性相当并对其功能做具体研究，发现其具有较高的活性。
目录
1.前言1
2材料与方法2
2.1材料2
2.1.1实验材料2
2.1.2仪器设备2
2.1.3试剂及溶液3
2.2方法7
2.2.1Pfu酶的表达…………………………………………………….7
2.2.2目的蛋白的纯化10
3结果与分析13
3.1SDS-PAGE电泳结果分析14
3.2PCR结果分析14
4讨论16
5总结…………………………………………………………………………..16
5.1纯化过程中可能出现的问题…………………………………………17
5.2PCR过程中可能出现的问题17
6参考文献17
致谢18
Pfu酶的表达，纯化及其功能分析
任佳
指导老师：
王友如
（湖北师范学院生命科学学院，生物科学1001班，湖北，黄石435002）
1.前言.
Pfu最初是直接从Pyrococcusfuriosus中提取出来的[2][3]，但是这种嗜热性厌氧菌很难生长到一定的规模而获得大量这种蛋白质酶，所以在杆菌中表达重组的Pfu酶是一个较好的选择。
Lu和Erickson[3]利用pET载体，成功的在大肠杆菌中表达出Pfu酶，并且可以轻易的进行毫克量的生产。
Dabrowski[4]在酶的末端加上一个His标签，然后用Ni2+亲和层析一步分离提取出Pfu酶。
Mathur已于1996年申请得到了生产重组PfuDNA聚合酶的专利。
Pfu酶价格比Taq酶更昂贵一些。
使用自制酶不仅能够更加方便的进行实验研究，而且还可以节省一定的科研经费。
通过简化纯化步骤，优化工艺流程，则可以为商业化生产DNA聚合酶打下基础并提供借鉴，从而进一步降低DNA聚合酶的生产成本，促进DNA聚合酶更广泛的运用和推广。
Pfu酶是目前已知的保真性最好的DNA聚合酶，被认为可能取代Taq酶。
Pfu酶扩增效率通常比T“l酶差，这是由于Pfu酶具有3’·5’的外切酶活性（高保真性）所引起的，不是由于Pfu酶的质量不稳定所致。
Pfu酶在扩增2kb以下的DNA片段和Taq没有多大差别[5]。
用Pfu酶扩增时，引物的纯度要求较高，长度要求大于18base，Tm在55—80·之问。
引物的浓度在0．1-0．5jM之间，比Taq酶略高。
Pfu酶具有3’·5’的外切酶活性可能会降解弓{物，特别是溶液中没有dNTP的情况Pfu酶具有3w5的外切酶活性可能会降解引物，特别是溶液中没有dNTP的情况下。
所以，Pfu酶必须最后加入到反应体系中，并立即进行PCR反应。
本次实验中我们利用重组大肠杆菌DH5α表达pfu酶，并对其功能进行分析。
方法：
含pfuDNA聚合酶基因的重组大肠杆菌DH5α。
经1mMIPTG诱导表达10-12小时后,用超声波破壁，再用用80℃,30min热变性去除部分杂蛋白,粗酶液经Ni离子亲和层析进一步纯化。
最后用PCR检验酶的活性。
2.材料与方法.
2.1材料
2..1.1实验材料.
含pfuDNA聚合酶基因的重组大肠杆菌DH5α，pfuDNA聚合酶（宝生物（大连）有限公司），DNAmaker,蛋白质maker（TIANGENBIOTECH（BEIJING）CO.,LTD），Ni-NTA亲和层析介质，
2.1.2仪器设备.
His-Tag亲和层析柱（17-5268-01型，飞羿科技）
稳压稳流电泳仪（DYY-5型，北京市六一仪器厂）
全温培养箱（HZQ-2金坛市医疗仪器厂）
冷冻离心机（TGL-16LA，GL-2M型，湖南星科仪器有限公司）
雪山制冰机（FM40型，YKKY）
超纯水机（AYJ1-0501-U型，艾科浦）
节能型智能恒温槽（DH-2120型，宁波新芝生物科技有限股份公司）
振荡培养箱（BS-1E型，江苏省金坛市亿通电子仪器厂）
单人单面净化工作台（SW-CJ-1FD型，苏州净化设备有限公司）
高压灭菌锅（YXQ-LS-50S型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）
PCR仪（Biometra，Germany）
凝胶紫外成像仪（GeneCompanyLimited）
pH计（MT-8061型，深圳市卡迪亚科技有限公司
电子天平（TE412-L，CP64型，德国Satorins公司）
超声波细胞粉碎机（XO-650型，南京先欧生物科技有限公司）
水平摇床（WD-9405B型，沃德生物医学仪器公司）
调温电热套（KOM型，武汉精华科教仪器有限公司）
2.1.3试剂及溶液.
活化、扩配、诱导、表达：
1LB液体培养基：
药品成分
质量g
胰蛋白胨
10
酵母提取物
5
NaCl
10
加950mL去离子水，用NaOH调pH至7.0，定容至1L，分装，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃以下，加入50μLKana储液至终浓度为50μg/mL。
（LB固体培养基：
在100mlLB液体培养基中，加入1.5g琼脂粉）
2100mg/mlKana：
Kana0.4g溶于4ml无菌水中，-20℃冻存备用。
31mol/LIPTG贮存液：
IPTG0.18g溶于4ml无菌水中，-20℃冻存备用。
450mMPh=7.4PBS,500MNaCl缓冲液。
PAGE电泳检测：
115%分离胶：
a.分离胶缓冲液：
1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）：
Tris-碱18.17g，溶于80ml去离子水中，用浓盐酸调pH至8.8，定容至100ml。
2浓缩胶：
b.浓缩胶缓冲液：
1.0mol/LTris-HCl（pH6.8）：
Tris-碱12.1g，溶于50ml去离子水中，用浓盐酸调pH至6.8，定容至100ml
310%SDS：
在900ml水中溶解100gSDS，加热至68℃助溶，定容至1L，分装备用
430%丙烯酰胺（W/V）：
丙烯酰胺29g，N,N-甲叉双丙烯酞胺1g，加去离子水60ml，加热溶解，定容至100ml。
用0.45um孔径滤器过滤，溶液pH不大于7.0，棕色瓶4℃保存。
55×SDS电泳缓冲液：
1L
药品成分
0.125MTris
1.25MGlycine
0.5%（W/V）SDS
质量g
15.1
94
5.0
加入约800ml的去离子水，搅拌溶解，加入去离子水定容至1L后，室温保存。
62×SDS上样缓冲液：
药品成分
体积ml
0.5mmol/LTris-HCI（pH6.8）
2
10%SDS（W/V）
1.25
0.5%溴酚蓝（W/V）
0.2
甘油
2.5
加入去离子水定容至9.5ml，在使用前，加入50μlβ-巯基乙醇到9.5ml上述溶液中，即为2×SDS上样缓冲液。
2×NonreducedSDS—PAGELoadingBuffer用等量的蒸馏水代替β—巯基乙醇即可。
7考马斯亮蓝R-250：
90ml甲醇：
H20（1：
1v/v）和10ml冰乙酸的混和液中溶解，0.25g考马斯亮蓝R250，用滤纸过滤除去颗粒状物质。
8质量浓度10%过硫酸铵（AP）：
将1g过硫酸氨溶解于10ml的水中，分装为小管，-20℃保存。
洗镍柱：
12M盐酸胍：
2Strippingbuffer:
药品成分
质量g
20mMTris
2.422
500mMNaCl
29.25
50mMEDTA
14.6125
加入约800ml的去离子水，搅拌溶解，加HCl调pH至8.0。
加入去离子水定容至1L后，室温保存。
30.3MNaOH（或者1MNaOH）：
45×bindingbuffer：
50mMTris6.055g
500mMNaCl29.25g
加去离子水800ml，用盐酸调pH值至8.0，用去离子水定容至1L
51.5MNaCl：
60.1M硫酸镍：
7配咪唑：
用1×bindingbuffer配
透析液：
每100mLBingdingBuffer加70ulβ-巯基乙醇。
浓缩用试剂：
PEG8000
琼脂糖凝胶电泳所用溶液及试剂：
1琼脂糖
250×TAE（Tris-乙酸）：
药品成分
质量g,/体积ml,
Tris碱
24.2
冰乙酸
5.71
5mol/1EDTA（pH8.0）
10
加去离子水定容至100ml，使用时用去离子水稀释50倍，即为工作液。
36×上样缓冲液：
2%（W/V）溴酚兰10ml
1%（W/V）蔗糖50ml
混匀后，加去离子水定容至100ml，分装，4℃储存备用。
45×TBE缓冲液1000ml（试剂组成：
TrisBase，硼酸和0.5MEDTA）
药品成分
用量
TrisBase
54g
硼酸
27.5g
0.5MEDTA（pH8.0）
20mL
使用时，如果用于琼脂糖电泳，可以稀释10倍，配成0.5×使用。
如果用于PAGE，配胶时加入量为1/5（配10ml胶加入2ml），电泳可以使用0.5×的。
5溴化乙锭EB贮存液：
配制成10mg/mL的母液
称取1.0g溴化乙锭，加入到200ml容器中。
加入去离子水100ml，充分搅拌数小时完全溶解溴化乙锭。
.将溶液转入棕色瓶，室温避光保存，用铝纸或黑纸包裹容器，贮存在室温，溴化乙锭最终工作浓度为0.5ug/ml。
2.2方法.
2.2.1Pfu酶的表达。
1．活化菌种，.挑单菌落。
取-20℃保存的冻存菌种PET-28a-pfu（实验组）和DH5a（阴性对照组）分别按1:
100接入2支2ml的LB液体培养基中，实验组中按1:
1000的比例加入100mg/ml的Kana2ul，于37℃摇床中培养过夜。
对已活化成功的菌种进行涂平板，实验组中要加同样比例的Kana，对照组不加。
涂平板要在超净工作台上进行，用灭菌后的接种环蘸取活化成功的菌液，在倒好的平板上以“井”字形或“之”字形划线。
划线完成后把平板用封口膜封号，倒放于37℃摇床中培养过夜，并做好标记。
第二天来观察菌落的生长情况，若可以观察到明显的单菌落，就在超净工作台上分别用灭菌的枪头挑单菌落于2ml的LB液体培养基中重新活化，写好标记，实验组要加2ulKana。
然后把试管放入37℃摇床中培养过夜。
这样就可以初步筛选目的菌。
2.用IPTG诱导。
对已活化成功的菌种按1:
50转接入新的5ml的LB液体培养基中（剩余的菌种保存在-4℃），实验组中按1:
1000的比例加入100mg/ml的Kana5ul，放入37℃摇床中培,1-2小时，待OD值为0.2左右时就利用IPTG诱导，分别往各管中按1:
1000的比例加入1M的IPTG5ul，诱导过夜（10-12小时）。
3.全细胞电泳鉴定目的蛋白。
将菌液分装于几个1.5ml的EP管中，8000转离心5分钟，去上清，加入25ml无菌水和25ml2×SDS上样缓冲液，吹吸重悬，混合均匀。
用封口膜封好EP管管口，在沸水中煮10分钟，8000转离心5分钟后就可以上样了。
配置SDS-PAGE电泳鉴定有无目的蛋白。
a）安装双垂直板电泳槽；
b）配12%的分离胶15mL，浓缩胶5mL；
SDS-PAGE电泳的配方：
表112%分离胶（15mL
成分
体积（mL）
双蒸水
1.6
30%丙烯酰胺
2.0
1.5MTris-Hcl（PH8.8）
1.3
10%过硫酸铵（APs）
0.05
10%SDS
0.05
TEMED
0.002
表212%浓缩胶（5mL）。
成分
体积（mL）
双蒸水
1.4
30%丙烯酰胺
0.33
1.5MTris-Hcl（PH6.8）
0.25
10%过硫酸铵（APs）
0.02
10%SDS
0.02
TEMED
0.002
c）制样：
取样品20µL加样品缓冲液以20µL混合，100℃加热5min，15000×g，4℃离心1min；
d）上样：
用微量注射器加样10-15µL
e）电泳：
在凝胶上加60V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到160V/cm继续电泳直到染料到达底部；
f）固定和染色：
用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热5min；
g）脱色：
30min更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板呈现淡蓝色。
2.2.2目的蛋白的纯化。
当电泳结果显示有目的蛋白时就可以把保留的菌种扩大培养进一步纯化。
取过夜菌按1:
50转接入新的100ml的LB液体培养基中，实验组中按1:
1000的比例加入100mg/ml的Kana5ul，放入37℃摇床中培,1-2小时，待OD值为0.2左右时就利用IPTG诱导，分别往各管中按1:
1000的比例加入1M的IPTG5ul，诱导过夜（10-12小时）。
8000转离心5分钟得沉淀，加PBS缓冲液（50Mm,，PH=7.4，500MmNaCl）10ml.冰浴超生波破壁（处理3次，每次30s，间隔30s）直到液体澄清为止。
得到的细胞裂解液在80℃的恒温水浴箱中水浴30min，使杂蛋白变性失活。
水浴后取上清，8000转离心5分钟得上清。
注意保留热处理及离心前后的样品以便于电泳分析。
离心后的上清用镍柱纯化后，透析，浓缩，SDS-PAGE检验纯度。
His-tagNi亲和层析法纯化融合蛋白
预处理：
a）用2M盐酸胍10mL与树脂打散混合洗涤；
b）用StrippingBuffer洗20min；蒸馏水洗30min；
c）1.5M盐酸胍洗30min，蒸馏水洗30min；
d）用1MNaOH洗1h；用BindingBuffer洗20min；蒸馏水洗30min；
e）用1.5MNaCl洗1h；用BindingBuffer洗20min；蒸馏水洗30min；
f）Ni柱再生：
150mL0.1MNiSO4洗，蒸馏水洗，BindingBuffer平衡。
平衡：
6倍柱床体积BindingBuffer（pH=8.0）平衡。
上样：
把蛋白质上清接入Ni柱进口端。
洗脱：
上样完后，继续用BindingBuffer（pH=8.0）淋洗。
之后开始用不同梯度的咪唑（50mM、250mM）洗脱。
对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。
（7）蛋白质的SDS-PAGE电泳检测方法同上。
（8）透析
a）处理透析袋：
浸没在蒸馏水中，加少许EDTA，用蒸馏水煮沸30min；
b）将蛋白样品转移到透析袋中，加入2-3滴巯基乙醇，浸入透析液中，加转子，密封，在0-4℃下透析；
c）透析2-3次，一次2-3个小时。
（9）浓缩：
用干燥的PEG8000包裹透析袋，在0-4℃下浓缩，以提高浓度。
2.2.3用PCR检测酶活性。
1.PCR的原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制[6][7]。
标准的PCR过程分为三步：
（1）．DNA变性（90·～96·）：
双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。
（2）．退火（25·～65·）：
系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
（3）．延伸（70·～75·）：
在耐热性DNA聚合酶（在72·左右最佳的活性）的作用下，以dNTPs为原料，从引物的5·端·3·端延伸，合成与模板互补的DNA链。
2.本实验中PCR扩增设计。
加料
CK+
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
CK1-
CK2-
双蒸水
16.5
16.7
16.5
16.3
16.1
15.9
15.7
16.3
16.1
15.9
15.7
16.6
16.6
Buffer
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
模板
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0
0
P1引物
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
P2引物
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
dNTPS
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
Pfu酶
0.2
商用
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.4
0.6
0.8
1.0
0.2商用
0.2
总体ul
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
加好后，混匀，稍加离心并标记。
说明：
-纯化后的pfu酶用量中为了精确的加入微量的pfu酶，2-6用的是0.2×pfu酶，其他用的是pfu酶原液，上表中记录的是实际加入的体积。
所以1-10实际加入1×pfu酶的体积分别为0，0.04，0.08，0.12，0.16，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0-ul；
3.PCR反应条件
94℃3min
58℃30s
30个循环
68℃90s（45s）
68℃3min
10℃5min
反应结束后取10µl用1.5%的琼脂糖电泳进行鉴定
4.琼脂糖电泳观察PCR结果。
制备琼脂糖凝胶（1%）
制备凝胶板加样电泳染色结果观察。
（1）制备凝胶和胶板：
45ml（1×TBE）+0.4g琼脂糖（三角瓶），煮胶，溶解，冷却至60℃（不烫手），倒板（4-6mm），室温下充分凝固，竖直拔下梳子。
（2）加样：
8ulDNAMark（加在第一孔）每管20μPCR产物+4μl10×buffer，混匀（按PCR体系顺序每孔各加5ul）。
（3）电泳：
电压3-5V/cm，约80-90V，注意电极方向。
（4）染色：
EB染色约15min。
（5）观察：
紫外透射分析仪下观察。
3结果与分析。
3.1纯化后的pfu酶的SDS-PAGE电泳图分析。
含pfuDNA聚合酶基因的重组大肠杆菌DH5α。
经1mMIPTG诱导表达10-12小时后,用超声波破壁，再用用80℃,30min热变性去除部分杂蛋白,粗酶液经Ni离子
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