不同产地当归炮制前后质量研究.docx

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不同产地当归炮制前后质量研究

目录

摘要

1.当归的炮制方法及工艺参数

1.1药材

1.2炮制品

1.2.1酒炙法

1.2.2包装

2.薄层色谱（TLC）鉴别

2.1试药及对照品与设备

2.1.1试药及对照品

2.1.2设备

2.2实验方法

2.2.1利用当归对照药材建立的薄层色谱鉴别方法

2.2.1.1对照药材溶液的制备

2.2.1.2供试品溶液的制备

2.2.1.3薄层色谱条件

2.2.2利用阿魏酸对照品建立的薄层色谱鉴别方法

2.2.2.1对照品溶液的制备

2.2.2.2供试品溶液的制备

2.2.2.3薄层色谱条件

2.3实验结果

2.3.1利用当归对照药材建立的薄层鉴别图谱

2.3．2利用阿魏酸对照品建立的薄层鉴别图谱

2.3.3讨论分析

3当归炮制前后HPLC特征图谱及阿魏酸的含量

3.1试剂与仪器

3．2方法与结果

3.2.1色谱条件

3.2.2对照品溶液的制备

3.2.3供试品溶液的制备

3.3特征图谱方法学考察

3.3.1精密度试验

3.3.2稳定性试验

3.3.3重现性试验

3.4炮制前后特征图谱分析

3.4.1特征图谱的建立

3.4.2特征峰的指认

3.5阿魏酸含量测定方法学考察

3.5.1标准曲线

3.5.2精密度试验

3.5.3稳定性试验

3.5.4重复性试验

3.6当归炮制前后阿魏酸的含量测定

4讨论

4.1样品提取方法的选择

4.2样品提取溶剂的选择

4.3波长选择

4.4流动相

4.5色谱柱

4.6柱温和流速选择

5实验结果

不同产地当归炮制前后质量研究

摘要：

目的研究不同产地炮制前后的质量变化。

方法采用高效液相色谱法、薄层色谱法等测定四川、甘肃等产地当归炮制前后当归素、异当归素的含量变化。

结果炮制使不同产地当归中当归素、异当归素的含量增加，而产地不同，当归的有效成分量不同。

结论炮制能使不同产地当归中有效成分增加，显著提高中药当归的生物活性，产地不同，药物质量评价不同。

当归为伞形科植物当归的干燥根。

具有补血活血，调经止痛，润肠通便的功效。

主要用于血虚诸证；月经不调；经闭；痛经；症瘕结聚；崩漏；虚寒腹痛；痿痹；肌肤麻木；肠燥便难；赤痢后重；痈疽疮疡；跌扑损伤。

1.当归的炮制方法及工艺参数

1.1药材

当归药材及饮片样品由浙江中医药大学中药饮片厂加工炮制而成，每批药材样品各自加工成相应的炮制品，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为当归药材及饮片。

样品编号如下表所示。

3个产地当归药材和炮制品来源

品种

批号

产地

来源

当归药材

080728

四川中江

浙江中医药大学中药饮片厂

080606

甘肃渭源

浙江中医药大学中药饮片厂

080605

甘肃岷县

浙江中医药大学中药饮片厂

酒当归

080728

四川中江

浙江中医药大学中药饮片厂

080606

甘肃渭源

浙江中医药大学中药饮片厂

080605

甘肃岷县

浙江中医药大学中药饮片厂

1.2炮制品

1.2.1酒炙法

将当归薄片55.0kg，加黄酒5.5kg拌匀，润透。

启动炒药机（型号：

自控温鼓式炒药机CGY-750W）。

加热铁锅_5_min至60℃。

A．将闷润好的当归薄片置30kg置预热好的热锅中，温度为70~110℃炒_30_min至干，取出，晾凉。

B．将闷润好的当归薄片置30kg置预热好的热锅中，温度为100~130℃炒_22_min至干，取出，晾凉。

1.2.2包装

酒当归饮片按每包装袋1kg称重，装入相应的塑料包装袋内，封口，贴上标签。

原药材55kg，共收酒当归饮片_38.84kg。

成品收率70.6_%

2薄层色谱（TLC）鉴别

2.1实验材料

2.1.1试药及对照品

当归对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：

120927-200613）；阿魏酸对照品（朗泽植提）。

乙醚、甲醇、环己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷等试剂为分析纯。

2.1.2　实验仪器

薄层色谱扫描系统（瑞士CAMAG公司），包括半自动点样仪Linomat5-150743及自动成像系统Visualizer-151204。

硅胶预制薄层板GF-254（青岛海洋化工厂），用前105℃活化。

R-210旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司），KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

2.2实验方法

2．2.1　利用当归对照药材建立的薄层色谱鉴别方法

2.2.1.1　对照药材溶液的制备

取对照药材粉末约0.5g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入乙醚30mL，密塞，超声处理（200W，40KHz）10min，过滤，滤液在60℃下减压蒸干，用95%乙醇定容至1mL，即得到对照药材溶液，冷藏备用。

2.2.1.2　供试品溶液的制备

取当归药材及饮片样品粉末约0.5g，精密称定，分别置100mL具塞锥形瓶中，精密加入乙醚30mL，密塞，超声处理（200W，40KHz）10min，过滤，将滤液在60℃下减压蒸干，分别用95%乙醇定容至1mL，即得到当归药材和饮片的供试品溶液，冷藏备用。

2.2.1.3薄层色谱条件

采用瑞士CAMAG公司的薄层色谱系统进行自动点样和图像采集。

点样：

2uL，条带状点样，条带宽度为6mm，点样距两边各为12mm，条带距底边12mm.

展开剂：

正己烷-乙酸乙酯（4：

1）为展开剂。

精密量取正己烷20mL，乙酸乙酯5mL。

展开缸：

双槽展开缸，10cm×10cm。

展开：

展开缸预平衡15分钟，上行展开，展距约为9cm。

检视：

置366nm紫外灯下检视。

2.2.2利用阿魏酸对照品建立的薄层色谱鉴别方法

2.2.2.1对照品溶液的制备

取阿魏酸5mg，精密称定，置于5mL容量瓶中，混匀，得浓度为1.0mg/mL的对照品溶液，冷藏备用。

2.2.2.2供试品溶液的制备

取当归药材及饮片样品粉末约3.0g，精密称定，加入1％的碳酸氢钠溶液50mL，超声10min，离心过滤，滤液用稀盐酸调pH至2-3，用乙醚萃取两次，每次20mL，合并萃取液，蒸干，用甲醇定容至1mL，即得。

2.2.2.3　薄层色谱条件

采用瑞士CAMAG公司的薄层色谱系统进行自动点样和图像采集。

点样：

3uL，条带状点样，条带宽度为6mm，点样距两边各为12mm，条带距底边12mm.

展开剂：

环己烷：

二氯甲烷：

乙酸乙酯：

甲酸＝4：

1：

1：

0.1为展开剂。

展开缸：

双槽展开缸，10cm×10cm。

展开：

展开缸预平衡15分钟，上行展开，展距约为9cm。

检视：

置366nm紫外灯下检视。

2.3实验结果

2.3.1利用当归对照药材建立的薄层鉴别图谱

当归药材和酒当归样品的薄层色谱图如下图所示：

12345678

各点依次为：

1.对照药材、

2.四川中江（药材）080728、3.甘肃渭源（药材）0806064.甘肃岷县（药材）080605

5.四川中江（酒当归）080728、6.甘肃渭源（酒当归）0806067.甘肃岷县（酒当归）080605、

8.对照药材

（T:

16℃，RH:

35%）

2.3.2利用阿魏酸对照品建立的薄层鉴别图谱

当归药材和酒当归样品的薄层色谱图如下图所示：

12345678

各点依次为：

1.阿魏酸

2.四川中江（药材）080728、3.甘肃渭源（药材）0806064.甘肃岷县（药材）080605

5.四川中江（酒当归）080728、6.甘肃渭源（酒当归）0806067.甘肃岷县（酒当归）080605、

8.阿魏酸

（T:

14℃，RH:

55%）

从图中可以看到当归炮制前后，成分变化不明显，其中有些成分的斑点颜色加深，可能炮制后成分含量增加，而也有成分斑点颜色减弱，可能成分减少。

3当归炮制前后HPLC特征图谱及阿魏酸的含量测定研究

3.1仪器与试剂

岛津LC-20AB高效液相色谱仪，包括DGU-20A3在线脱气机、SIL-20A自动进样器、SPD-M20A检测器、CTO-20A柱温箱和Class-VP色谱工作站；KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；METTLERTOLEDOAL104电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

甲醇、乙腈为色谱级（美国Merck公司），其他试剂为分析纯。

阿魏酸对照品由朗泽植提公司提供。

3.2方法与结果　

3.2.1色谱条件　

色谱柱为YMC-PackODS-A（250mm×4.6mm,5μm）（YMCCo.Ltd,Japan），柱温为35℃，流速为1mL/min，检测波长为254nm，流动相为乙腈和0.2%的乙酸水溶液，梯度洗脱程序如下表所示：

流动相线性洗脱梯度程序

时间/min

0.2%乙酸水溶液（A）/%

乙腈（B）/%

0

95

5

30

80

20

65

60

40

75

50

50

85

45

55

95

45

55

110

35

65

120

15

85

125

95

5

3.2.2对照品溶液的制备　

取阿魏酸5mg，精密称定，置于5mL容量瓶中，混匀，得浓度为1.0mg/mL的对照品溶液，冷藏备用。

3.2.3供试品溶液的制备

精密称取样品粉末1.0g置100mL具塞锥形瓶中，加甲醇30mL，置超声机中超声提取30min，取出放冷，用滤纸滤过，药渣连同滤纸放回锥形瓶中，再加甲醇30mL，置超声机中超声提取30min，取出放冷，用滤纸滤过，合并两次滤液，减压蒸干，用甲醇定容至10mL，即得。

进样前以0.45μm微孔滤膜滤过。

3.3特征图谱方法学考察

3.3.1精密度试验

取甘肃渭源当归药材，依法制备供试品溶液并连续进样6次进行指纹图谱测定，以1号峰为标准峰计算各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.196%，相对峰面积的RSD均小于2.53%。

结果见下表。

精密度试验相对保留时间

峰1

峰2

峰3

峰4

峰5

峰6

峰7

峰8

峰9

峰10

1

1.000

1.365

1.446

2.176

2.467

2.714

2.763

2.818

2.850

3.768

2

1.000

1.363

1.443

2.172

2.463

2.710

2.759

2.814

2.846

3.763

3

1.000

1.364

1.445

2.177

2.467

2.715

2.764

2.819

2.851

3.769

4

1.000

1.364

1.444

2.174

2.465

2.712

2.760

2.816

2.848

3.765

5

1.000

1.362

1.443

2.172

2.463

2.710

2.759

2.814

2.846

3.762

6

1.000

1.366

1.447

2.182

2.476

2.724

2.773

2.829

2.861

3.782

均值

1.000

1.364

1.445

2.175

2.467

2.714

2.763

2.818

2.850

3.768

SD

0.000000

0.001216

0.001521

0.003714

0.004834

0.005292

0.005381

0.005511

0.005608

0.007374

RSD/%

0.000

0.089

0.105

0.170

0.196

0.195

0.194

0.195

0.196

0.195

精密度试验相对峰面积

峰1

峰2

峰3

峰4

峰5

峰6

峰7

峰8

峰9

峰10

1

1.000

2.035

0.460

0.252

1.165

0.291

0.448

5.544

1.588

0.894

2

1.000

2.014

0.459

0.245

1.137

0.289

0.446

5.473

1.597

0.875

3

1.000

2.007

0.446

0.243

1.106

0.287

0.446

5.470

1.606

0.933

4

1.000

2.005

0.447

0.247

1.164

0.296

0.454

5.458

1.553

0.890

5

1.000

2.068

0.446

0.246

1.156

0.295

0.450

5.438

1.551

0.897

6

1.000

2.060

0.445

0.242

1.099

0.288

0.440

5.421

1.535

0.902

平均值

1.000

2.031

0.450

0.246

1.138

0.291

0.447

5.467

1.572

0.898

SD

0.000000

0.027296

0.006863

0.003474

0.028854

0.003605

0.004612

0.042410

0.028930

0.019208

RSD/%

0.000

1.343

1.523

1.413

2.535

1.239

1.030

0.775

1.840

2.138

3.3.2稳定性试验

取甘肃渭源当归药材，依法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12h进样测定，以1号峰为标准峰计算各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.209%，相对峰面积的RSD均小于2.44%。

结果见下表。

稳定性实验相对保留时间

峰1

峰2

峰3

峰4

峰5

峰6

峰7

峰8

峰9

峰10

0

1.000

1.363

1.443

2.172

2.463

2.710

2.759

2.814

2.846

3.763

2

1.000

1.364

1.445

2.177

2.467

2.715

2.764

2.819

2.851

3.769

4

1.000

1.364

1.444

2.174

2.465

2.712

2.760

2.816

2.848

3.765

6

1.000

1.362

1.443

2.172

2.463

2.710

2.759

2.814

2.846

3.762

8

1.000

1.366

1.447

2.182

2.476

2.724

2.773

2.829

2.861

3.782

12

1.000

1.363

1.443

2.172

2.463

2.709

2.758

2.813

2.845

3.761

平均值

1.000

1.364

1.444

2.175

2.467

2.714

2.763

2.818

2.850

3.768

SD

0.000000

0.001187

0.001585

0.003921

0.005052

0.005623

0.005729

0.005872

0.005984

0.007836

RSD/%

0.000

0.087

0.109

0.180

0.204

0.207

0.207

0.208

0.209

0.208

稳定性实验相对峰面积

峰1

峰2

峰3

峰4

峰5

峰6

峰7

峰8

峰9

峰10

2

1.000

2.014

0.459

0.245

1.137

0.289

0.446

5.473

1.597

0.875

3

1.000

2.007

0.446

0.243

1.106

0.287

0.446

5.470

1.606

0.933

4

1.000

2.005

0.447

0.247

1.164

0.296

0.454

5.458

1.553

0.890

5

1.000

2.068

0.446

0.246

1.156

0.295

0.450

5.438

1.551

0.897

6

1.000

2.060

0.445

0.242

1.099

0.288

0.440

5.421

1.535

0.902

7

1.000

2.088

0.452

0.267

1.403

0.325

0.484

5.381

1.563

1.014

平均值

1.000

2.040

0.449

0.248

1.178

0.297

0.453

5.440

1.568

0.918

SD

0.000000

0.030440

0.005761

0.002197

0.028763

0.004029

0.005139

0.022252

0.031056

0.021344

RSD/%

0.000

1.492

1.282

0.884

2.442

1.358

1.133

0.409

1.981

2.324

3.3.3重现性试验

取甘肃渭源当归药材6份，依法分别制备供试品溶液，同法进样测定，记录色谱图并积分。

以1号峰为标准峰计算各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.108%，相对峰面积的RSD均小于5%。

结果见下表。

重现性实验相对保留时间

峰1

峰2

峰3

峰4

峰5

峰6

峰7

峰8

峰9

峰10

1

1.000

1.354

1.435

2.163

2.461

2.702

2.751

2.806

2.838

3.750

2

1.000

1.357

1.438

2.165

2.458

2.698

2.747

2.802

2.834

3.745

3

1.000

1.354

1.434

2.159

2.455

2.695

2.744

2.798

2.831

3.741

4

1.000

1.356

1.437

2.164

2.459

2.700

2.749

2.803

2.836

3.748

5

1.000

1.357

1.438

2.165

2.461

2.702

2.751

2.805

2.837

3.749

6

1.000

1.357

1.438

2.167

2.463

2.704

2.753

2.807

2.840

3.752

平均值

1.000

1.356

1.437

2.164

2.460

2.700

2.749

2.804

2.836

3.748

SD

0.000000

0.001145

0.001444

0.002354

0.002534

0.002760

0.002838

0.002904

0.002948

0.003826

RSD/%

0.0000

0.0845

0.1005

0.1088

0.1030

0.1022

0.1032

0.1036

0.1040

0.1021

重现性实验相对峰面积

峰1

峰2

峰3

峰4

峰5

峰6

峰7

峰8

峰9

峰10

1

1.000

1.472

0.342

0.221

0.597

0.202

0.297

3.796

1.135

0.514

2

1.000

1.574

0.442

0.198

0.636

0.217

0.323

4.188

1.248

0.560

3

1.000

1.576

0.450

0.215

0.631

0.207

0.317

4.259

1.187

0.575

4

1.000

1.475

0.534

0.270

0.580

0.229

0.306

3.609

1.898

0.510

5

1.000

1.552

0.493

0.235

0.605

0.218

0.308

3.874

1.225

0.539

6

1.000

1.585

0.480

0.224

0.610

0.220

0.316

4.082

1.205

0.565

平均值

1.000

1.539

0.457

0.227

0.610

0.215

0.311

3.968

1.316

0.544

SD

0.000000

0.047401

0.059402

0.022323

0.019386

0.008958

0.008435

0.228507

0.262452

0.024953

RSD/%

0.0000

3.0798

13.0025

9.8209

3.1794

4.1582

2.7105

5.7584

19.9386

4.5882

3.4炮制前后特征图谱分析

3.4.1特征图谱的建立

将各供试品溶液按2.1项下色谱条件测定，得到各样品的HPLC特征图谱，结果见下图：

不同产地当归药材HPLC图谱

阿魏酸

不同产地当归饮片HPLC图谱

阿魏酸

当归药材HPLC特征图谱（甘肃渭源）

3.4.2特征峰的指认

按照2.1项下液相条件和分析方法对阿魏酸对照品溶液进行分析，进样体积为10uL，确定阿魏酸的位置，如下图所示；同时，以甲醇为空白溶剂，进样10uL，确定空白溶剂中没有杂质存在。

阿魏酸HPLC图谱

阿魏酸

甘肃渭源当归药材HPLC图谱

（红色为阿魏酸，蓝色为空白）

3.5阿魏酸含量测定方法学考察

3.5.1标准曲线

移取适量的对照品溶液于容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成系列标准溶液，浓度分别为1.0mg/mL、0.1m