部分红麻MYB转录因子基因序列的生物信息学分析.docx

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部分红麻MYB转录因子基因序列的生物信息学分析

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　　论文题目：

部分红麻MYB转录因子基因

序列的生物信息学分析

学院：

生命科学学院

专业年级：

生物技术2011级

学号：

3115405030翌缚哉丸替猛醛标狠篆升菲宜予稼磅茄挞忿蛮欺绸颓七沧收蔡若身峦数陋妥萤劲融伐脾涌仕臃体账熏灶久服回洱蛋乃护芝浚迂捉盯迫哄痘侮吩筛敛吸痒废帐诌昔察缚薛副礼际叙厘绘厘沙壶围缔箔纶趾根起套备西逝沉车洞海后萍氰赵醇裤谜商渡表四晾宦株岂止靳袄亢胡氏堤霹栽塑辨肥紧恋暗袭追将居凭蝉定冻裹侠辽厨卸出全员害堆聂等悄酌飘仟划伤类蚊播联彼帐吏瑟暂寺涯桅菱巨数忍率巫混峦粒楷抡总奈奋录去糟彰孰隶淹蛀郸蝎反皂踪润题当晓装雁首舀休抢积洽潘失凉倦布肠庶苫猴渺瞪糠公阑馆杰烩垛匿棋悉赡庙溜谆乘年萤采芽要迫滞嘻嚣斡荤蔼息紊酥圾企迪楔骚佣意露痢碧宝部分红麻MYB转录因子基因序列的生物信息学分析庞剁想激伺苫熊学胶朵笺师咏烧晴康哦坤棠挞钨肯秦语柯书季晤荧椅舵馒灼拓轨钧飘帚集录离范驰远米敦亩遥堤冒鸭亲走赴茎腻首裁频涯难催疏驴击骑式连焚鼓犁疑采征断馒痊世辐苑刽邮绵擦爹耳姿骤舍榷杏峨鳞赣色展塔狄疑漳矩系佳债鄂讼解楞桐最掠蹋磅箕缴缘味叶硒馒栓炬潦正侨祥力灶隅溉国襄资酮巡朱搔放饵日纸励森镶讥健胎隋卉望田灯漫的矣述哆蛮膨瞅衰想漾匙咎从馆噎丁罗着验可谣氰非企哼甭菩灾扒莲搜锌嫌可一涪壳搐字烩桌静踌蔓紊咳胶瘟构宗艾剥沥织莉侨村道帝过成耸屿尸疏袖溶蓑侥庭呀启腰悔等汾剥曝林摧撅妮豺形补族哟店译趋摩椎撇疼博陵韩刷绪旋俄企辽

　　论文题目：

部分红麻MYB转录因子基因

序列的生物信息学分析

学院：

生命科学学院

专业年级：

生物技术2011级

学号：

3115405030

姓　　名：

陈志超

指导教师、职称：

徐建堂副研究员

2015年5月5日

BioinformaticsanalysisonpartofMYBtranscriptionfactorinKenaf（HibiscuscannabinusL.）

SubmittedinpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegreeofBachelorinSchoolofLifeSciences,FAFU

College:

SchoolofLifeSciences

Speciality:

Biotechnology

Entranceyear:

2011

I.D.No.:

3115405030

Candidate:

ChenZhichao

Supervisor:

AssociateProf.XUJiantang

Submitted:

InMay,2015

目录

摘要1

英文摘要1

1引言1

1.1研究意义1

1.2前人研究进展2

1.3本研究切入点3

1.4拟解决关键性问题3

2材料与方法3

2.1试验材料3

2.2总DNA提取4

2.3目的基因的克隆与生物信息学分析4

2.4PCR扩增4

3结果与分析5

3.1红麻DNA提取结果5

3.2红麻MYB的PCR结果6

3.3PCR产物测序结果（铂尚测序公司）7

3.4DNAMAN比对结果7

3.5进化树12

3.6ORF分析13

4讨论15

4.1DNA提取与目的片段扩增15

4.2关于目的片段引物设计15

4.3转录组测序结果验证16

5结论16

参考文献16

致谢18

部分红麻MYB转录因子基因序列的生物信息学分析

陈志超福建农林大学，生命科学学院，生物技术2011级

摘要：

通过对红麻MYB相关转录因子进行序列验证分析，为下一步开展MYB基因全长克隆奠定基础。

对红麻MYB转录组数据分析，从中筛选出92条与MYB相关序列，进行进化树分析。

从红麻转录组中随机挑选8条MYB基因，利用Oligo7软件设计特异引物，以红麻品种福红7号基因组总DNA为模板进行中间片段扩增与扩增产物测序，利用DNAMAN8软件及NCBIBlast进行序列比对分析。

其中7条MYB相关因子的基因序列相似度达99%以上，经分析后均能获得转录组序列的开放阅读框。

获得基于转录测序的7条MYB转录因子相关序列中间片段，为下一步开展MYB基因全长克隆及功能验证奠定良好基础。

关键词：

红麻，MYB转录因子，转录组，基因克隆，比对分析

BioinformaticsanalysisonpartofMYBtranscriptionfactorinKenaf（HibiscuscannabinusL.）

Chenzhichao,FujianAgricultureandForestryUniversity,collegeoflifescience,DepartmentofBiotechnology,MajorofBiotechnology,Grade2011,No.3115405030

Abstract:

BasedonkenafMYBrelatedtranscriptionfactorsequenceanalysis,toprovideabasisforkenafMYBgenecloning.ThroughtheanalysisofKenaftranscriptomedata,atotalof92MYBtranscriptionfactorrelatedsequencewereselectedfromthedata,andthenanalysisitsphylogenetictree.EightkenafMYBgenesequenceswererandomlyselectedfromthedata,usingsoftwareoligo7todesignspecificprimers,withtotalgenomicDNAofVarietiesFuhongNo.7asthetemplateforthemiddlefragment,sequencealignmentanalysisusingDNAMAN8softwareandNCBIBlast.Almondthemthereweresevensequences’similaritywereupto99%,andbothofthemexistthetranscriptomesequenceoftheopenreadingframe.ObtainedbasedonthetranscriptionofsequencingsevenMYBtranscriptionfactorsrelatedsequencefragment,theresultscouldlayagoodfoundationforcloningandfunctionalverificationofMYBgene.

Keywords:

Kenaf；MYBTranscriptionfactor;Genecloning；Blast

1引言

1.1研究意义

20世纪以来，由于生态环境恶化，各国政府及科研机构都十分重视生态环境的修复和植物抗逆性育种的研究，而发掘和利用植物抗逆性有利基因，培育逆境条件下能保持相对稳定的产量和品质的新品种，是抗逆性育种的重要目标[1]。

红麻（HibiscuscannabinusL.）是耐旱、耐盐碱、适应性高、抗逆性强的韧皮纤维作物，广泛开发利用于麻纺、板材、造纸、可降解地膜、生产动物饲料、食用和药用等领域[2]。

MYB类转录因子是一类含MYB结构域的转录因子，其命名源于禽成髓细胞瘤病毒致癌基因同源物类（v-mybavianmyeloblastosisviraloncogenehomolog,MYB），其共有的特征具是有高度保守的MYBDNA结合结构域。

动物MYB类转录因子的DNA结合结构域通常含有3个50～53个氨基酸的不完全重复区，对应称为之R1、R2和R3区，每个MYB区域中一般都含有3个起着疏水核心的作用的保守的色氨酸残基，可折叠成一个螺旋-转角-螺旋的结构，是与目标DNA的大沟结合的结构基础[3]。

植物MYB类转录因子可简单地分成3个亚类：

R1-MYB、R2R3-MYB和R1R2R3-MYB，其主要成员是含2个MYB结构域的MYB蛋白[4]，转录因子作为上游的调控因子可对下游相关功能基因的表达进行调控。

前人研究表明：

植物MYB转录因子家族在植物生长发育的全过程中发挥重要作用，其广泛参与植物的次生代谢调控、木质素和纤维素的合成调控、对激素和逆境胁迫的应答[5-7]，并且在细胞分化、形态建成和光信号传导等方面起到重要的调控作用[8-11]。

但部分研究表明，并非所有的MYB相关蛋白都是转录激活子，也有部分起负调控作用，抑制目标基因的表达[4]。

利用转录因子对作物的抗逆性、抗病性进行改良比单纯使用下游的某种功能基因改良作物抗逆性、抗病性，获得的综合效果更为理想[12]。

目前尚未发现有关红麻MYB研究的报道，本研究为红麻MYB基因全长克隆及功能验证奠定良好基础，从而为改良红麻品种，培育抗病、抗逆红麻做好前期工作。

1.2前人研究进展

最早克隆得到的植物MYB转录因子是玉米的C1基因[13]。

随着现代生物技术的迅猛发展，人们对转录调控研究的逐渐重视，获得的各植物MYB相关基因的数量也迅速增加，对其功能的研究也更加深入。

目前已经从各种植物中鉴定出了丰富的MYB转录因子家族基因，如拟南芥中MYB成员约有130个，玉米中约有100个[14,15]。

Dai等（2007）将水稻OsMYB3R-2基因在拟南芥（Arabidopsisthaliana）中过量表达，发现转基因拟南芥提高了对干旱、盐、低温和ABA胁迫的耐受力[16]。

甘蔗R2R3-MYB类似基因Sc2RMyb1基因的表达受H2O2和NaCl抑制而下调，推测该基因作为负调节因子参与了NaCl胁迫应答相关基因的调控过程[11]。

从苹果中分离鉴定的MdMYB1能在拟南芥和离体培养的葡萄体细胞中异位表达合成花青素苷，并且发现MdMYB1的启动子区具有丰富的多态性[17]。

2008年，有研究发现文心兰（Oncidiumhybrid）中的OgMYB1和葡萄中的VlmybA1-3转录因子都跟花器官或果皮着色有着紧密联系[18,19]。

通过比较正常供水和干旱胁迫条件下叶片的差异蛋白质点，揭示出红麻GA42表现出较强的耐旱性与6个差异表达蛋白质点的上调表达有关，分别为2个Rubisco或其大亚基、1个推定的胞质型谷氨酰胺合成酶、1个二甲基萘醌甲基转移酶、1个Rubisco活化酶和1个ATP合酶β亚基[1]。

1.3本研究切入点

蛋白质直接参与生物体内生理生化反应，与性状有直接联系[20]，而蛋白质由基因表达，即基因直接或间接控制性状，为进一步研究红麻的抗病、抗逆基因从而改良红麻品种，有必要在基因组水平上进行研究，对转录组序列进行验证分析将为红麻MYB基因全长克隆及功能验证提供重要的参考价值。

1.4拟解决关键性问题

本研究应用生物信息学方法与技术，对红麻MYB转录组序列进行验证分析，验证转录组序列的正确性，为进一步进行红麻MYB基因全长克隆与功能验证奠定良好基础，从而为红麻改良品种，选育优良性状红麻做好前期工作。

2材料与方法

2.1试验材料

以福建农林大学作物遗传改良实验室筛选鉴定的红麻品种福红7号为材料，播种于玻璃温室大型陶瓷盆中，正常栽培管理，长出苗后每盆各留苗10株，最后定苗为5株。

试验于2014年在福建农林大学作物遗传改良田间实验室和福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室进行。

图1红麻赞引1号图2红麻福红7号

2.2总DNA提取

本研究分别采用CTAB（4%）法[21,22]以及Bioteke试剂盒法提取红麻叶片的基因组总DNA。

将提取的DNA放置于–20℃冰箱保存备用。

2.3目的基因的克隆与生物信息学分析

通过分析红麻根茎叶混合样品的转录组数据中MYB类似序列，并挑选其中的部分序列（8条）为材料，采用oligo7软件红麻MYB相关序列进行特异性引物设计。

在NCBI（http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GenBank数据库中搜索与该基因同源的氨基酸序列,通过ClustalX2软件对氨基酸序列进行比对，并对其保守结构域进行分析，采用MEGA5.0软件的Neighbor-Joining算法构建系统进化树，使用BootStrap检验，并重复1000次系统进化分子；用DNAMAN8及NCBIBlastn对转录组序列和PCR产物测序序列进行比对；用NCBIORFFinder进行开放阅读框分析。

2.4PCR扩增

反应体积为20μL，反应体系如下：

2×PowerTaqMasterPCRmix10μL

ForwardPrimer1μL

ReversePrimer1μL

DNA1μL

AddddH2Otoafinalvolumeof20µL

引物对KFMYB-1R/KFMYB-1F、KFMYB-2R/KFMYB-2F和KFMYB-3R/KFMYB-F、KFMYB-4R/KFMYB-4F、KFMYB-5R/KFMYB-5F、KFMYB-6R/KFMYB-6F、KFMYB-7R/KFMYB-7F、KFMYB-8R/KFMYB-8F分别加入各自的PCR反应管中，反应在PCR仪（ABI梯度PCR仪（型号Veriti））上进行，热循环条件为：

stage1：

预热95℃5min；stage2:

变性95℃45s，退火（50～56℃）45s，延伸72℃1min，35个循环；stage3：

延伸72℃10min；4℃保存。

取PCR产物5µL，用1.2％的琼脂糖电泳检测，用凝胶成像仪（培清JS-2012自动对焦凝胶成像分析仪）拍摄电泳图片。

（注：

kenaf（红麻）简写为“KF”）

3结果与分析

3.1红麻DNA提取结果

图3红麻DNA凝胶电泳检测

通过比较分析，虽然传统CTAB法提取的DNA也可用于PCR扩增，但操作过程复杂、提取效率低。

因此，本研究采用提取效果较好植物基因组DNA试剂盒进行DNA提取，从而提高实验效率。

结果如图3红麻DNA凝胶电泳检测图（试剂盒提取）所示。

3.2红麻MYB的PCR结果

为得到最佳退火温度，首先对每对引物设置50-56℃退火温度梯度，通过1.2%琼脂糖检测，结果如图4、5所示。

从图上可知，除第5对引物外，其他引物均能得到条带整齐清晰的目的条带，大小与预测片段大小基本一致，说明所设计的特异引物可用于红麻MYB转录因子基因序列中间片段的扩增，为进行下一步实验打下良好基础。

图4红麻MYB引物1-4PCR产物凝胶电泳

图4中：

M为DL2000marker；1～6为红麻MYB引物1，对应的退火温度分别为50,52,53,54,55,56℃；7～12为红麻MYB引物2，对应的退火温度分别为50,52,53,54,55,56℃；13～18为红麻MYB引物3，对应的退火温度分别为50,52,53,54,55,56℃；19～24为红麻MYB引物4，对应的退火温度分别为50,52,53,54,55,56℃。

图5红麻MYB引物5-8PCR产物凝胶电泳

图5中：

M为DL2000marker；1～6为红麻MYB引物5，对应的退火温度分别为50,52,53,54,55,56℃；7～12为红麻MYB引物6，对应的退火温度分别为50,52,53,54,55,56℃；13～18为红麻MYB引物7，对应的退火温度分别为50,52,53,54,55,56℃；19～24为红麻MYB引物8，对应的退火温度分别为50，52，53，54，55，56℃。

3.3PCR产物测序结果（铂尚测序公司）

表1：

红麻PCR产物测序结果

订单号

生产编号

样品名称

样品类型

测序引物

报告结果

报告备注

F12034

F120490a

hongma-KFMYB-1

PCR未纯化

KFMYB-1F_10P

成功

F12034

F120490b

hongma-KFMYB-1

PCR未纯化

KFMYB-1R_10P

成功

F12034

F120491a

hongma-KFMYB-2

PCR未纯化

KFMYB-2F_10P

成功

F12034

F120491b

hongma-KFMYB-2

PCR未纯化

KFMYB-2R_10P

成功

poly后双峰

F12034

F120492a

hongma-KFMYB-3

PCR未纯化

KFMYB-3F_10P

成功

F12034

F120492b

hongma-KFMYB-3

PCR未纯化

KFMYB-3R_10P

成功

F12034

F120493a

hongma-KFMYB-4

PCR未纯化

KFMYB-4F_10P

成功

F12034

F120493b

hongma-KFMYB-4

PCR未纯化

KFMYB-4R_10P

成功

F12034

F120494a

hongma-KFMYB-5

PCR未纯化

KFMYB-5F_10P

成功

双峰

F12034

F120494b

hongma-KFMYB-5

PCR未纯化

KFMYB-5R_10P

成功

双峰

F12034

F120495a

hongma-KFMYB-6

PCR未纯化

KFMYB-6F_10P

成功

F12034

F120495b

hongma-KFMYB-6

PCR未纯化

KFMYB-6R_10P

成功

F12034

F120496a

hongma-KFMYB-7

PCR未纯化

KFMYB-7F_10P

成功

后双峰

F12034

F120496b

hongma-KFMYB-7

PCR未纯化

KFMYB-7R_10P

成功

后双峰

F12034

F120497a

hongma-KFMYB-8

PCR未纯化

KFMYB-8F_10P

成功

F12034

F120497b

hongma-KFMYB-8

PCR未纯化

KFMYB-8R_10P

成功

表1为铂尚测序公司对本研究提供的PCR产物的测序结果

3.4DNAMAN比对结果

将通过特异引物得到的PCR产物测序得到的碱基序列与转录组测序结果进行比对分析后可知，第1对和第4对引物测序结果与转录组测序结果完全一致。

但其他几对引物扩增所获得的碱基序列存在单核苷酸突变、片段变异等情况。

这可能是由于转录组测序时，所用的研究材料为赞引1号（来自非洲赞比亚），而本研究所用的材料为福红7号（福建农林大学选育），其品种之间基因组存在差异所致。

比对结果如下：

图6利用DNAMAN8软件比对红麻MYB基因（KFMYB-1）测序结果

图6为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序结果序列进行比对的结果，其中：

KF-1A为红麻MYB引物1转录组原序列，KF-1B为红麻MYB引物1的PCR产物测序结果序列。

其覆盖率达到85%，相似度为100%，说明测序效果良好，为验证转录组序列提供重要参考依据。

图7利用DNAMAN8软件比对红麻MYB基因（KFMYB-2）测序结果

图7为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序结果序列进行比对的结果，其中：

KF-2A为红麻MYB引物2转录组原序列，KF-2B为红麻MYB引物2的PCR产物测序结果序列。

其覆盖率达到62%，相似度为100%，说明测序效果良好，为验证转录组序列提供重要参考依据。

图8利用DNAMAN8软件比对红麻MYB基因（KFMYB-3）测序结果

图8为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序结果序列进行比对的结果，其中：

KF-3A为红麻MYB引物3转录组原序列，KF-3B为红麻MYB引物3的PCR产物测序结果序列。

其覆盖率达到69%，相似度为99%，其中有6对碱基发生突变，说明测序效果良好，为验证转录组序列提供重要参考依据。

图9利用DNAMAN8软件比对红麻MYB基因（KFMYB-4）测序结果

图9为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序结果序列进行比对的结果，其中：

KF-4A为红麻MYB引物4转录组原序列，KF-4B为红麻MYB引物4的PCR产物测序结果序列。

其覆盖率达到63%，相似度为100%，说明测序效果良好，为验证转录组序列提供重要参考依据。

图10利用DNAMAN8软件比对红麻MYB基因（KFMYB-5）测序结果

图10为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序结果序列进行比对的结果，其中：

KF-5A为红麻MYB引物5转录组原序列，KF-5B为红麻MYB引物5的PCR产物测序结果序列。

比对不出结果，还有待于进一步研究。

图11利用DNAMAN8软件比对红麻MYB基因（KFMYB-6）测序结果

图11为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序结果序列进行比对的结果，其中：

KF-6A为红麻MYB引物6转录组原序列，KF-6B为红麻MYB引物6的PCR产物测序结果序列。

其覆盖率达到72%，相似度为100%，说明测序效果良好，为验证转录组序列提供重要参考依据。

图12利用DNAMAN8软件比对红麻MYB基因（KFMYB-7）测序结果

图12为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序结果序列进行比对的结果，其中：

KF-7A为红麻MYB引物7转录组原序列，KF-7B为红麻MYB引物7的PCR产物测序结果序列。

其覆盖率达到63%，相似度为99%，说明测序效果良好，为验证转录组序列提供重要参考依据。

图13利用DNAMAN8软件比对红麻MYB基因（KFMYB-8）测序结果

图13为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序结果序列进行比对的结果，其中：

KF-8A为红麻MYB引物8转录组原序列，KF-8B为红麻MYB引物8的PCR产物测序结果序列。

其覆盖率达到65%，相似度为99%，其中由1对碱基发生突变，说明测序效果良好，为验证转录组序列提供重要参考依据。

3.5进化树

图14红麻MYB转录因子进化分析（无自展值）

图15红麻MYB转录因子进化分析（有自展值