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沙门氏菌检验

沙门氏菌检验

1.范围

本法适用于食品中沙门氏菌的检验。

2.设备和材料

处微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

2.1冰箱:

2℃~5℃。

2.2恒温培养箱:

36℃±1℃,42℃±1℃。

2.3均质器。

2.4振荡器。

2.5电子天平:

感量0.1g。

2.6无菌锥形瓶:

容量500mL,250mL。

2.7无菌吸管:

1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。

2.8无菌培养皿:

直径90mm。

2.9无菌试管:

3mm×50mm、10mm×75mm。

2.10无菌毛细管。

2.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2.12全自动微生物生化鉴定系统。

3.培养基和试剂

3.1缓冲蛋白胨水(BPW)。

3.2四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液。

3.3亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液。

3.4亚硫酸铋(BS)琼脂。

3.5HE琼脂。

3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂。

3.7沙门氏菌属显色培养基。

3.8三糖铁(TSI)琼脂。

3.9蛋白胨水、靛基质试剂。

3.10尿素琼脂(pH7.2)。

3.11氰化钾(KCN)培养基。

3.12赖氨酸脱羧酶试验培养基。

3.13糖发酵管。

3.14邻硝基苯β-D-半乳糖苷(ONPG)培养基。

3.15半固体琼脂。

3.16丙二酸钠培养基。

3.17沙门氏菌O和H诊断血清。

3.18生化鉴定试剂盒。

4.检验程序

沙门氏菌检验程序见图1。

36℃±1℃,18h~24h

42℃±1℃,18h~24h36℃±1℃,18h~24h

36℃±1℃,40h~48h36℃±1℃,18h~24h

图1沙门氏菌检验程序

5.操作步骤

5.1前增菌

称取25g(mL)样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中,以8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min。

若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。

如需测定pH值,用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2.无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中,如使用均质袋,可直接进行培养,于36℃±1℃培养8h~18h。

如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃~5℃不超过18h解冻。

5.2增菌

轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1mL,转种于10mLTTB内,于42℃±1℃培养18h~24h。

同时,另取1mL转种于10mLSC内,于36℃±1℃培养18h~24h。

5.3分离

分别用接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板(或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板)。

与36℃±1℃分别培养18h~24h(XLD平板、HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板)或40h~48h(BS琼脂平板),观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。

表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

选择性琼脂平板

沙门氏菌

BS琼脂

菌落为褐色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可成黑色或棕色;有些菌株成灰绿色的菌落,周围培养基不变。

HE琼脂

蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色;有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色。

XLD琼脂

菌落呈粉红色,带或不带黑色中心,有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心,或呈现全部黑色的菌落;有些菌株为黄色菌落,带或不带黑色中心。

沙门氏菌属显色培养基

按照显色培养基的说明进行判定。

5.4生化试验

5.4.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可以菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种懒氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于36℃±1℃培养18h~24h,必要时可延长至48h。

在三糖铁琼脂和懒氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属的反应结果见表2。

表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和懒氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

三糖铁琼脂

懒氨酸脱羧酶试验培养基

初步判断

斜面

底层

产气

硫化氢

K

A

+(-)

+(-)

可疑沙门氏菌属

K

A

+(-)

+(-)

可疑沙门氏菌属

A

A

+(-)

+(-)

可疑沙门氏菌属

A

A

+/-

+/-

非沙门氏菌

K

K

+/-

+/-

+/-

非沙门氏菌

注:

K:

产碱,A:

产酸;+:

阳性,-:

阴性;+(-):

多数阳性,少数阴性;+/-:

阳性或阴性。

5.4.2接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。

于36℃±1℃培养18h~24h,必要时可延长至48h,按表3判定结果。

将已挑菌落的平板储存于2℃~5℃或室温至少保留24h,以备比必要时复查。

表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

反应序号

硫化氢(H2S)

靛基质

pH7.2尿素

氰化钾(KCN)

懒氨酸脱羧酶

A1

A2

A3

+/-

注:

+阳性;-阴性;+/-阳性或阴性。

反应序号A1:

典型反应判定为沙门氏菌属。

如尿素、KCN和懒氨酸脱羧酶3项中有1项异常,按表4可判定为沙门氏菌。

如有2项异常为非沙门氏菌。

表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

pH7.2尿素

氰化钾(KCN)

懒氨酸脱羧酶

判定结果

甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结果)

沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群生化特征)

沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结果)

注:

+表示阳性;-表示阴性。

醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

隐形为沙门氏菌,同事赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

表5沙门氏菌属生化群的鉴别

项目

卫矛醇

山梨醇

水杨苷

ONPG

丙二酸盐

KCN

注:

+表示阳性;-表示阴性。

5.4.3或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。

5.5血清学鉴定

5.5.1抗原的准备

一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

O血清不凝集时,讲菌株接种在琼脂量较高的(如2%~3%)培养基上再检查;如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。

H抗原发育不良时,将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央,俟菌落蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小试管1次~2次,自远端取菌培养后再检查。

5.5.2多价菌体抗原(O)鉴定

再玻片上划出2个约1cm×2cm的区域,挑取1环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清,在另一区域下部加入1滴生理盐水,作为对照。

再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。

将玻片倾斜摇动混合1min,并对着黑暗背景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。

5.5.3多价鞭毛抗原(H)鉴定

5.5.4血清学分型(选做项目)

用A~F多价O血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。

在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株,不能分型。

被A~F多价O血清凝集者,依次用O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2和O11因子血清做凝集试验。

根据试验结果,判定O群。

被O3、O10血清凝集的菌株,再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验,判定E1、E2、E3、E4各亚群,每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果,没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。

不被A~F多价O血清凝集者,先用9种多价O血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种血清所包括的O群血清逐一检查,以确定O群。

每种多价O血清所包括的O因子如下:

O多价1A,B,C,D,E,F群(并包括6,14群)

O多价213,16,17,18,21群

O多价328,30,35,38,39群

O多价440,41,42,43群

O多价544,45,47,48群

O多价650,51,52,53群

O多价755,56,57,58群

O多价859,60,61,62群

O多价963,65,66,67群

H抗原的鉴定

属于A~F各O群的常见菌型,依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2项的H抗原。

表2A~F群常见菌型H抗原表

O群

第1相

第2相

A

B

B

C1

C2

D(不产气的)

D(产气的)

E1

E4

E4

a

g,f,s

i,b,d

k,v,r,c

b,d,r

d

g,m,p,q

h,v

g,s,t

i

2

5,z15

2,5

6,w,x

不常见的菌型,先用8种多价H血清检查,如有其中一种或两种血清凝集,则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查,以第1相和第2相的H抗原。

8种多价H血清所包括的H因子如下:

H多价1a,b,c,d,i

H多价2eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51

H多价3k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40

H多价41,2;1,5;1,6;1,7;z6

H多价5z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38

H多价6z39,z41,z42,z44

H多价7z52,z53,z54,z55

H多价8z56,z57,z60,z61,z62

每一个H抗原成分的最后确定均应根绝H单因子血清的检查结果,没有H单椅子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。

检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出啊第1相H抗原的,可在琼脂斜面上移种1~2代后再检查。

如仍只检出一个相的H抗原,要用位相变异的方法检查其另一个相。

单相菌不必做位相变异检查。

位相变异试验方法如下:

小玻管法:

将半固体管(每管约1mL~2mL)在酒精灯上溶化并冷至50℃,取已知相的H因子血清0.05mL~0.1mL,加入于溶化的半固体内,混匀后,用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内,俟凝固后,用接种针挑取待检菌,接种于一端。

将小玻管平放在平皿内,并在其旁放一团湿棉花,以防琼脂中水分蒸发而干缩,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可以从另一端挑取细菌进行检查。

培养基内血清的浓度应有适当的比例,过高时细菌不能生长,过低时同一相细菌的动力不能抑制。

一般按原血清1:

200~1:

800的量加入。

小倒管法:

将两端开口的小玻管(下端开口要留一个缺口,不要平齐)放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面,灭菌后备用。

临用时在酒精灯上加热融化,冷至50℃,挑取因子血清1环,加入小套管中的半固体内,略加搅动,使其混匀,俟凝固后,将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查,或转种1%软琼脂斜面,于37℃培养后再做凝集试验。

简易平板法:

将0.35%~0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取因子血清1环,

滴在半固体平板表面,放置片刻,待血清吸收到琼脂内,在血清部位的中央点待检菌株,培养后,在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。

用Vi因子血清检查。

已知具有Vi抗原的菌型有:

伤寒沙门氏菌,丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙门氏菌。

根据血清学分型鉴定的结果,按照GB4789.4-2010中附录A或有关沙门氏菌属抗原判定菌型。

6.结果与报告

综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25g(mL)样品中检出或未检出沙门氏菌。

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