沙门氏菌检验.docx
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沙门氏菌检验
沙门氏菌检验
1.范围
本法适用于食品中沙门氏菌的检验。
2.设备和材料
处微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
2.1冰箱：
2℃～5℃。
2.2恒温培养箱：
36℃±1℃，42℃±1℃。
2.3均质器。
2.4振荡器。
2.5电子天平：
感量0.1g。
2.6无菌锥形瓶：
容量500mL，250mL。
2.7无菌吸管：
1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
2.8无菌培养皿：
直径90mm。
2.9无菌试管：
3mm×50mm、10mm×75mm。
2.10无菌毛细管。
2.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.12全自动微生物生化鉴定系统。
3.培养基和试剂
3.1缓冲蛋白胨水（BPW）。
3.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液。
3.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液。
3.4亚硫酸铋（BS）琼脂。
3.5HE琼脂。
3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂。
3.7沙门氏菌属显色培养基。
3.8三糖铁（TSI）琼脂。
3.9蛋白胨水、靛基质试剂。
3.10尿素琼脂（pH7.2）。
3.11氰化钾（KCN）培养基。
3.12赖氨酸脱羧酶试验培养基。
3.13糖发酵管。
3.14邻硝基苯β-D-半乳糖苷（ONPG）培养基。
3.15半固体琼脂。
3.16丙二酸钠培养基。
3.17沙门氏菌O和H诊断血清。
3.18生化鉴定试剂盒。
4.检验程序
沙门氏菌检验程序见图1。
36℃±1℃，18h～24h
42℃±1℃，18h～24h36℃±1℃，18h～24h
36℃±1℃，40h～48h36℃±1℃，18h～24h
图1沙门氏菌检验程序
5.操作步骤
5.1前增菌
称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。
若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。
如需测定pH值，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2.无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8h～18h。
如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或2℃～5℃不超过18h解冻。
5.2增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18h～24h。
同时，另取1mL转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h～24h。
5.3分离
分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。
与36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD平板、HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表1。
表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平板
沙门氏菌
BS琼脂
菌落为褐色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可成黑色或棕色；有些菌株成灰绿色的菌落，周围培养基不变。
HE琼脂
蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。
XLD琼脂
菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。
沙门氏菌属显色培养基
按照显色培养基的说明进行判定。
5.4生化试验
5.4.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可以菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种懒氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。
在三糖铁琼脂和懒氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。
表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和懒氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果
三糖铁琼脂
懒氨酸脱羧酶试验培养基
初步判断
斜面
底层
产气
硫化氢
K
A
＋（－）
＋（－）
＋
可疑沙门氏菌属
K
A
＋（－）
＋（－）
－
可疑沙门氏菌属
A
A
＋（－）
＋（－）
＋
可疑沙门氏菌属
A
A
＋/－
＋/－
－
非沙门氏菌
K
K
＋/－
＋/－
＋/－
非沙门氏菌
注：
K：
产碱，A：
产酸；＋：
阳性，－：
阴性；＋（－）：
多数阳性，少数阴性；＋/－：
阳性或阴性。
5.4.2接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。
于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。
将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备比必要时复查。
表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
反应序号
硫化氢（H2S）
靛基质
pH7.2尿素
氰化钾（KCN）
懒氨酸脱羧酶
A1
＋
－
－
－
＋
A2
＋
＋
－
－
＋
A3
－
－
－
－
＋/－
注：
＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。
反应序号A1：
典型反应判定为沙门氏菌属。
如尿素、KCN和懒氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。
如有2项异常为非沙门氏菌。
表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
pH7.2尿素
氰化钾（KCN）
懒氨酸脱羧酶
判定结果
－
－
－
甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）
－
＋
＋
沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特征）
＋
－
＋
沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）
注：
＋表示阳性；－表示阴性。
醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
隐形为沙门氏菌，同事赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
表5沙门氏菌属生化群的鉴别
项目
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ
Ⅵ
卫矛醇
＋
＋
－
－
＋
－
山梨醇
＋
＋
＋
＋
＋
－
水杨苷
－
－
－
＋
－
－
ONPG
－
－
＋
－
＋
－
丙二酸盐
－
＋
＋
－
－
－
KCN
－
－
－
＋
＋
－
注：
＋表示阳性；－表示阴性。
5.4.3或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
5.5血清学鉴定
5.5.1抗原的准备
一般采用1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
O血清不凝集时，讲菌株接种在琼脂量较高的（如2%～3%）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。
H抗原发育不良时，将菌株接种在0.55%～0.65%半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3%～0.4%半固体琼脂的小试管1次～2次，自远端取菌培养后再检查。
5.5.2多价菌体抗原（O）鉴定
再玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。
再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。
将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。
5.5.3多价鞭毛抗原（H）鉴定
5.5.4血清学分型（选做项目）
用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。
在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株，不能分型。
被A～F多价O血清凝集者，依次用O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集试验。
根据试验结果，判定O群。
被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。
不被A～F多价O血清凝集者，先用9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。
每种多价O血清所包括的O因子如下：
O多价1A，B，C，D，E，F群（并包括6,14群）
O多价213,16,17,18,21群
O多价328,30,35,38,39群
O多价440,41,42,43群
O多价544,45,47,48群
O多价650,51,52,53群
O多价755,56,57,58群
O多价859,60,61,62群
O多价963,65,66,67群
H抗原的鉴定
属于A～F各O群的常见菌型，依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2项的H抗原。
表2A～F群常见菌型H抗原表
O群
第1相
第2相
A
B
B
C1
C2
D（不产气的）
D（产气的）
E1
E4
E4
a
g,f,s
i,b,d
k,v,r,c
b,d,r
d
g,m,p,q
h,v
g,s,t
i
无
无
2
5，z15
2,5
无
无
6，w，x
无
不常见的菌型，先用8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以第1相和第2相的H抗原。
8种多价H血清所包括的H因子如下：
H多价1a,b,c,d,i
H多价2eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51
H多价3k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40
H多价41,2；1,5；1,6；1,7；z6
H多价5z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38
H多价6z39,z41,z42,z44
H多价7z52,z53,z54,z55
H多价8z56,z57,z60,z61,z62
每一个H抗原成分的最后确定均应根绝H单因子血清的检查结果，没有H单椅子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。
检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出啊第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1～2代后再检查。
如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。
单相菌不必做位相变异检查。
位相变异试验方法如下：
小玻管法：
将半固体管（每管约1mL～2mL）在酒精灯上溶化并冷至50℃，取已知相的H因子血清0.05mL～0.1mL，加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。
将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。
培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。
一般按原血清1:
200～1:
800的量加入。
小倒管法：
将两端开口的小玻管（下端开口要留一个缺口，不要平齐）放在半固体管内，小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。
临用时在酒精灯上加热融化，冷至50℃，挑取因子血清1环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种1%软琼脂斜面，于37℃培养后再做凝集试验。
简易平板法：
将0.35%～0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1环，
滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。
用Vi因子血清检查。
已知具有Vi抗原的菌型有：
伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林沙门氏菌。
根据血清学分型鉴定的结果，按照GB4789.4-2010中附录A或有关沙门氏菌属抗原判定菌型。
6．结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。
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