第十一章植物组织培养.docx

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第十一章植物组织培养

第十一章植物组织培养（2学时）

教学目的与要求：

掌握植物组织培养基的配置、快速繁殖技术、植物脱毒技术；了解人工种子的应用及离体种质的保存。

11.1 植物组织培养的实验程序和技术要点

11.2 培养基及其配制

11.3 无性系快速繁殖技术

11.4 植物脱毒技术

11.5 人工种子

11.6 种质离体保存

教学过程：

植物组织培养（tissueculture）是指所有类型的植物离体部分的无菌培养技术。

第一节组织培养的实验程序和技术要点

一、无菌培养物的建立：

建立无菌培养物的三项技术：

（1）外植体的选择

（2）灭菌（3）诱导培养

对于易褐变的外植体还要有防止褐变的措施。

1、外植体的选择

（1）遗传表型选择：

（2）生理状态的选择：

（3）取外植体的部位：

（4）取外植体的季节和时间：

（5）外植体大小与诱导成功率：

2、外植体的灭菌

消毒原则

既要彻底消灭外植体表面的微生物，又要保持外植体正常活力。

消毒剂

良好的消毒作用，又要易被无菌水冲掉或自行分解掉。

消毒程序

消毒剂种类、浓度和消毒时间。

目前常用消毒方法：

首先70～75％酒精，30秒，表面杀菌，后用其他消毒剂消毒；

如：

0.1％升汞，5～10分钟

2～5％次氯酸钠，5～30分钟

茎尖、茎段、叶片消毒程序：

——70％乙醇30秒——无菌水2～3次——2～5％次氯酸钠10～15分——无菌水3～5次

种子的消毒程序：

——10％次氯酸钠20～30分——无菌水3～5次

根的消毒程序：

——自来水冲洗——纯乙醇漂洗——0.1％升汞5～10分——无菌水3～5次

3、诱导培养

（1）外植体的切割：

叶片0.5～0.8cm2；茎段和顶芽以１cm长为宜。

（2）接种：

形态学下端插入培养基（如茎切段），叶平铺。

不可将切块深埋于培养基中，以防无氧呼吸。

（3）最佳培养基的筛选：

主要因素:

基本培养基，植物生长物质的种类、浓度和配比。

二、培养物的增殖（茎芽的增殖）

是离体繁殖也称微型繁殖的关键步骤。

1、通过愈伤组织诱导不定芽的形成

不定芽（adventitiousbuds）

是指从非正常（叶腋和茎尖）出芽的位置上诱导而形成的芽，如从根、叶和愈伤组织

中诱导的芽。

优点：

繁殖速度快。

不足：

遗传不稳定性；再生能力会下降。

2、增强腋芽生枝能力

含CTK、GA和生长素等的培养基，可增强枝条腋芽生枝能力。

特点：

此途径开始速度慢，但经一个时期后，枝条数目以对数增加；

此途径为茎尖培养，所以不发生基因型的变化。

注意：

（1）繁殖代数不是越多越好；

（2）每次继代培养，应求增殖系数最高，即产生数量最多的增殖体。

三、根的诱导培养

♠        一般在增殖的芽长到１－２厘米时，即可转入生根培养基培养。

♠        生根培养基配方的筛选原则：

发根快、多而粗壮，茎基部不形成愈伤组织。

♠        生根培养基应去除CTK，降低生长素浓度，甚至在无激素的培养基上进行发根。

四、试管苗的移栽

1、壮苗；

2、炼苗；

3、移栽的适期：

小苗刚发根或幼根小于１厘米时为移栽适期。

第二节无菌技术

污染源：

外植体、培养基、培养容器、接种室和接种器械等。

灭菌消毒方法：

高压蒸汽灭菌、干热灭菌、化学药物和紫外线等。

一、外植体的灭菌（前面已述）

二、培养基的灭菌

1、高温高压灭菌

高压锅：

压力1.1公斤/厘米2,,温度121℃时间15～20分钟一般微生物在115℃、15分钟就能被杀灭

2、抽滤灭菌法

对象：

在高温高压下容易被破坏的成分（GA、IAA、ZT、ABA、尿素和某些维生素等）或液体培养基可采取抽滤灭菌法。

操作：

先将滤膜（孔径为0.45微米）、过滤器和抽滤瓶等进行高压灭菌，然后在无菌条件下让溶液经滤膜流入抽滤瓶中或已冷却的培养基中。

三、器皿及工具的灭菌

1、玻璃器皿、金属用具可用湿热灭菌法（高压灭菌），也可用高热灭菌法（电烘干箱）

2、工作服、帽、口罩等布制品用前用紫外灯灭菌，并定期洗涤晒干后用纱布或牛皮纸包好

放入高压锅内，在115℃下灭菌20～30分钟。

四、无菌室、超净工作台或接种箱的灭菌

1、无菌室用前必须用紫外灯灭菌20～30分钟，并定期用高锰酸钾和福尔马林薰蒸。

2、超净工作台用前要检查风速、滤膜性能，并用紫外灯灭菌20～30分钟，关闭紫外灯后，

用70％酒精拭擦台面及工作台内的工具。

3、接种箱用前紫外灯灭菌20～30分钟，并定期用高锰酸钾和福尔马林薰蒸。

五、工作人员准则

工作人员进入接种室要更换工作服，专用拖鞋、戴上帽和口罩，手要用70％酒精拭擦，在工作期间避免谈笑。

第三节培养基及其配制

一、培养基的种类

（1）基本培养基：

包括大量元素和微量元素、维生素和氨基酸，还有碳源和水。

常见的有

MS、White、Nitsch、B5和N6等。

完全培养基：

根据各种不同试验要求，在基本培养基中附加一些物质，如各种植物生长物质以及其它有机附加物（如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物、麦芽等）。

（2）根据培养基的物理状态分：

液体培养基和固体培养基

（3）根据培养基的无机盐分：

高盐（MS）、中盐（Miller）、低盐（White）培养基

（4）根据培养物分：

愈伤组织培养基、芽增殖培养基、生根培养基、细胞培养基和原生质体培养基等

2、培养基的组成分

（1）无机营养成分：

植物生长发育必需的元素为14种：

大量元素N、P、K、Ca、S、Mg

微量元素Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、Cl、Ni

（2）有机营养成分：

A碳源：

为生长发育提供碳骨架和能源，维持培养基的渗透平衡。

主要为糖类，常用蔗糖。

一般用量为2～5%。

B含Ｎ物质：

构成蛋白质和核酸等生物大分子的组成分，并提供激素。

如维生素B、氨基酸和有机复合物。

（３）植物生长物质：

A生长素：

主要用于诱导细胞的分裂（愈伤组织的形成）和根的分化，如IAA，NAA，IBA，2,4－D。

B细胞分裂素：

主要用于促进细胞分裂和由愈伤或器官上分化不定芽，也用于茎芽的增殖，常用6-BA、KT、ZT。

（４）琼脂与ＰH值：

琼脂是由海藻得来的多糖类物质，一般用0.7～1.0％。

PH一般为５～６间，常用5.8。

PH>6.0，培养基变硬；PH<5.0，琼脂不凝固。

二、培养基的制备

1、母液的配制和保存：

培养基母液是指按培养基配方配制浓度高１０－１００倍的高浓度溶液。

2、配制培养基：

v      100ml大量元素+10ml微量元素+10ml铁盐+10ml有机物+生长物质+30g蔗糖+7g琼脂，定容1L，煮沸溶解后灭菌备用。

v      灭菌后的培养基一般隔天再用，因pH变动（偏酸0.1-0.3pH）。

v      培养基在低温暗中可保存一段时间（<1个月）。

v      

第四节无性系快速繁殖技术

无性繁殖系（克隆，Ｃlone）是指单个植物细胞或单株通过无性繁殖所产生的群体（包括细胞系）。

无性系快速繁殖（rapidpropagation）

微型繁殖（micropropagation）

微型繁殖一般涉及４个步骤：

无菌培养物的建立；

茎芽的增殖；

根的诱导；

试管苗的移栽。

第五节植物脱毒技术

一、培育无病毒苗的意义

二、脱病毒方法（茎尖脱病毒培养方法）

1、茎尖脱毒培养的原理：

主要是根据病毒在植物体输导组织传播的，因而造成分布不均一性。

即老叶及成熟的组织或器官中病毒含量较高，幼嫩的及未成熟的组织和器官中病毒含量较低，而生长点（0.1-1mm区域）由于输导组织尚未形成等，因而几乎不含病毒。

病毒在体内分布具有不均匀性

——理论假说

（1）传导抑制

（2）能量竞争

（3）激素抑制

（4）酶缺乏

（5）抑制因子

针对植物分生组织病毒含量低提出的解释：

（1）传导抑制病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中，维管组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。

（2）能量竞争病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。

（3）激素抑制在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。

（4）酶缺乏可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。

（5）抑制因子1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存在有某种抑制因子。

2、茎尖脱毒方法

茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响

要考虑脱毒效果和茎尖离体培养的成活率，一般取0.2－0.5mm茎尖为培养材料。

举例——马铃薯脱毒培养

Ø      取带幼叶和茎尖的茎段，0.1％升汞消毒5～10分钟，无菌水清洗3～5次。

用解剖针小心由外向内剥去幼叶，露出生长点。

Ø      切下生长点，去掉较大叶原基，仅保留靠近生长点的叶原基。

Ø      培养在MS+0.05mg/LNAA+0.05mg/LBA，25±2℃，2000Lx，16h光照，2周左右生长点发育为幼芽。

Ø      8周后发育为具数片真叶的幼苗，无激素培养基上生根，根长0.5～1.0mm时移栽。

脱毒苗农艺性状鉴定方法：

       指示植物鉴定法

o        抗血清方法

❑      电子显微镜检查法

指示植物法

指示植物鉴定法是利用病毒在其他植物（指示植物）上产生的枯斑和某些病理症状，作为鉴别病毒及病毒种类的标准。

对依靠汁液传播的病毒，可采用摩擦损伤汁液传播鉴定法，对不能依靠汁液传播的病毒，则采用指示植物嫁接法。

理想的指示植物：

容易并能快速生长，具有适宜于接种的大叶片，能在较长时期内保持对病毒的敏感性，易接种，在较广的范围内具有同样的反应。

常用的指示植物有：

千日红、野生马铃薯、曼陀罗、辣椒、酸浆、心叶烟、黄花烟、豇豆、莨菪等。

指示植物类型：

一种是接种后产生系统性症状，其出现的病毒扩展到植物非接种部位，通常没有局部病斑明显；另一种是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环斑构成。

抗血清鉴定法

不同病毒产生的抗血清都有各自的特异性，用已知病毒的抗血清来鉴定未知病毒，这种抗血清就成为高度专一性的试剂，特异性高，一般几分钟到几小时可完成鉴定。

所以，抗血清法是目前快速定量测定植物病毒的常规方法。

电子显微镜检测法

可以直接观察、检查出有无病毒存在、病毒颗粒的大小、形状和结构，根据这些特征，对病毒的分类鉴定具有很重要的作用。

但电子显微镜是昂贵、先进的复杂技术设备。

6.影响茎尖培养和脱毒的关键因素：

1）接种体的大小：

2）植物激素的浓度和培养温度：

生长素（2,4-D;IAA;NAA）：

是最主要的，不可缺少，浓度为0.1-1mg/L。

细胞分裂素（6-BA;KIN;ZEA）：

浓度为0.05-0.1mg/L，不能太高，否则会抑制茎尖的正产生长发育，有些植物不需要。

赤霉素：

有利于茎尖的伸长和成活，浓度为0.1ml/L。

第六节人工种子

一、人工种子（artificialseeds）

又称合成种子（syntheticseeds）

或体细胞种子（somaticseeds）

植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织（芽、枝尖等）包裹在含有营养物质和具有保护功能的外壳形成的在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。

人工种子组成：

胚性组织

人工胚乳

人工种皮

人工种子和天然种子的比较

二、人工种子的优越性和局限性

1、优越性：

（1）快速繁殖，特别对自然下不结实的或种子昂贵的植物，如兰花；

（2）培养无病毒苗；

（3）克服顽拗型种子难贮藏的缺点，如热带水果（龙眼、荔枝、芒果等）；

（4）在人工种子制作中加入抗菌素、矿质元素等，提高种子活力；

2、局限性：

（1）要求无菌条件；

（2）成本高（超过天然种子）；

（3）各方面技术尚未完善，如人工种皮理想材料等。

三、植物人工种子的制作技术

1、体细胞胚的诱导

2、体细胞胚发生的同步调控

（1）用DNA抑制剂处理细胞培养物

（2）分离过筛

（3）利用气体调控胚状体的同步发生

（4）利用渗透压调控胚状体的同步生长

3、人工种皮制作常用褐藻酸盐（钙）为人工种皮物质，因具有凝聚好、使用方便、无毒和价格便宜等优点。

4、包埋人工种子的包埋中加入的营养物质、植物激素和抗菌物质等，构成了人工胚乳。

5、贮藏与发芽

储藏：

低温（如２℃）和干燥条件下，人工种子处于强迫休眠状态，而保持其在贮藏中的活力。

发芽：

温度、光和培养基（如ＭＳ）。

人工种子的芽或根突破“种皮”大于２mm，称发芽；大于５mm称成苗。

第七节种质离体保存

1、意义：

种质资源是育种工作的基础。

2、优点：

所占空间小；能避虫害等，便于交流；能快速大量繁殖以供生产所需；保存费用较低廉。

3、方法：

常温限制生长保存

中低温控制生长保存

超低温长期保存等

（1）超低温种质保存的基本原理

超低温（-196℃的液氮低温）下，细胞的物质代谢和生长活动处于停滞状况。

因此，细胞、组织和器官在适宜的技术处理下在超低温保存过程中不会发生遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的能力。

此技术具有长期安全稳定、节省空间等优点。

（2）超低温保存技术

影响因素：

材料特性冻存技术措施——（预处理、冷冻保护剂、降温冰冻方法、化冻方法等）

1）保存材料的选取：

茎尖、幼胚和小苗等具有组织结构的材料。

2）冷冻前材料预处理：

预处理使材料适应将来的低温条件。

把材料在含高糖、DMSO、脯氨酸等的培养基中于0℃下培养数日。

3）添加冷冻防护剂：

可降低细胞因脱水产生渗透胁迫和冰晶的形成，从而提高细胞的抗冻性。

常用的冷冻防护剂有DMSO、甘油、脯氨酸、糖类、乙二醇等。

4）材料的冷冻方法：

A：

慢冻法（两步冰冻法）

第一步用慢速降温法降到一定的预冻温度（一般-40℃），保存一段时间。

第二步是将材料投入液氮中使之迅速冰冻。

B快冻法（玻璃化法）：

材料在高浓度的玻璃化保护剂处理后，快速投入液氮中，使保护剂和细胞内水分来不及形成冰晶，从而使细胞和保护剂一起进入一种不结冰、无定形的玻璃化的固化状态。

C预冻法：

材料逐步冷冻－20℃→－30℃→→→－70℃→液氮

D干冻法：

材料脱水至一定的程度（如豌豆脱水到27%-40%），再投入液氮。

5、材料的保存：

液氮罐或液氮冰箱中。

6、保存材料的解冻：

快速解冻。

7、保存材料恢复培养：

（1）恢复培养和植株的再生：

（2）活性鉴定：

TTC法等可测细胞活力。