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微生物实验论文
姓名：
袁辉龙
班级：
A1211
学号：
11210020109
指导老师：
李汉全
土壤微生物的分离纯化及鉴定
一．摘要
通过稀释涂布、划线分离等微生物的基本实验操作和步骤，对土壤中的微生物进行分离与纯化，再根据实验中菌落形态观察、革兰氏染色、生理生化试验等结果对所分离细菌和霉菌的分类进行鉴定。
二．关键词：
土壤微生物，划线分离，纯化，芽孢染色，革兰氏染色，荚膜染色，插片，抗菌图谱等。
三．前言：
土壤微生物是构成土壤肥力的重要因素。
土壤中尤以细菌最多，约占土壤微生物总量的70-90%.土壤中不同类型的细菌有不同的作用。
有的能够固定空气中的氮元素，合成细胞中的蛋白质；有的能够分解农作物的秸杆，它们大多是异养菌。
除了细菌以外，土壤中数量较多的其它微生物是放线菌和真菌，而藻类和原生动物等较少。
土壤中的微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。
要研究某种微生物的特性或要确定某些微生物菌株的分类地位，首先须使该微生物为纯培养。
也就是说培养物中所有的细胞只是微生物的某一个或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。
从复杂的微生物群体中获得只含有一种或一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。
单细胞挑取法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法和平板划线法是分离纯化微生物的常规方法。
通过稀释涂布平板法可以在平板上获得单菌落，再通过挑取单菌落进行平板划线分离可获得纯培养。
在稀释涂布平板法中还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。
对微生物分类的主要依据有形态特征、生理生化特征性等。
形态特征包括个体形态和培养形态。
细胞形状、大小、排列，革兰氏染色反应，运动性，鞭毛位置、数目，芽孢有无、形状和部位都是个体形态的特点。
培养形态指微生物在培养基（包括固体和液体培养）中生长的形态特征。
通过细菌的形态特征可以对微生物进行分类鉴定。
各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的终产物的不同，反应出它们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被用作为细菌鉴定和分类的内容。
四、基本原理
1、培养基的配制与灭菌
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。
在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。
但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。
不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性的（嗜碱细菌和嗜酸细菌例外）。
所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。
此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。
2、微生物的分离与纯化
自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
土壤是微生物生活的大本营，可以从中分离到很多有价值的菌株。
本实验将采用平板划线分离法。
3、分离菌株的鉴定
微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、细菌特点及生理生化、分子生物学等方面进行鉴定。
各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。
不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。
不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。
所有这些都反映了它们是有不同的酶系统。
细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：
第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础。
另一方面，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一，细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用，可
以鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。
五、实验器材、试剂与实验方法：
1器材：
试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、培养皿、自动立式压力蒸汽灭菌器、烘箱、玻璃珠、移液枪、枪头、称量纸、药匙、试管架、接种环、酒精灯、超净工作台。
2试剂：
牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、80%乳酸、10%酚液、95%乙醇、75%酒精。
3土样：
取自九江学院图书馆旁大树底下，地下10cm-15cm左右。
4实验方法
4.1配制培养基：
（一）配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基500ml（用1个1000ml三角瓶装）
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。
配方如下：
牛肉膏1.5g蛋白胨5gNaCl2.5g琼脂10g水500mlpH7.0-7.2
1、称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。
牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。
蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2、加热溶解在烧杯中加入少于所需的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。
若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。
3、调pH用pH试纸或酸碱度计检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/LNaoH，边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。
若偏碱，则用１mol/lHCL进行调节。
pH调节通常放在加琼脂之前。
注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4、过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。
5、分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。
分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。
分装量：
固体培养基约试管高度的1/5；分装入三角瓶内的以不超过其容积的一半为宜，半固体培养基以试管高度的1/3为宜。
6、加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。
棉塞的形状、大小和松紧度要适合，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。
要使棉塞总长3/5塞入试管口或瓶口内，以防止棉花脱落。
有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。
有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。
7、包扎加塞后，将三角瓶的棉花外包一层牛皮纸或双层报纸，以防止灭菌时冷凝水沾湿棉塞。
若培养基分装于试管中，则应先把装同类培养基的试管扎成捆后，再于棉花塞外一层牛皮纸。
然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
8、灭菌将上述培养基于121.3摄氏度湿热灭菌20min。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
9、摆斜面灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2；待其凝固，
10、无菌检查将灭菌的培养基放入37摄氏度温箱中培养24-48h，无菌生长即可使用。
或储存于冰箱或清洁的橱内，备用。
（二）配制高氏一号琼脂培养基200ml（用1个100ml三角瓶和2支试管分装）
高氏一号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。
配方如下：
可溶性淀粉4g，KNO30.2g，NaCl0.1g,K2HPO4.3H2O0.1g,FeSO4.7H2O0.002g,琼脂3~4g,水200mL,pH7.2~7.4。
1、称量和溶解先计算后称量,按用量先称取可溶性淀粉,放入小烧杯中,并用少量冷水将其调成糊状,再加至少于所需水量的沸水中,继续加热,边加热边搅拌,至其完全溶解.对微量成分ＦeSO4.7H2O可先配制成高浓度的储备液后再加入,方法是先在100ml水中加入1g的ＦeSO4.7H2O,配成0.01mg/ml的储备液,再在200ml的培养基中加入以上储备液0.02ml即可.待所有的药品完全溶解后,补充水分到所需的总体积.如果要配制固体培养基,其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制.
2、pH调节`分装包扎灭菌及无菌检查同上
（一）
（三）配制马丁氏培养基1000ml（用2个500ml三角瓶和2支试管分装）
马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。
配方如下：
K2HPO41g，MgSO4.7H2O0.5g,蛋白胨5g,葡萄糖10g,琼脂15~20g,水1000mL，自然pH
1、称量和溶解先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需水量的水中。
待各成分溶解后，补充水分至所需体积。
再将孟加拉红配成1%的水溶液，在200ml的培养基中加入以上孟加拉红溶液0.66ml，混匀后，再加入琼脂加入融化，方法同
（一）
2、pH调节`分装包扎灭菌及无菌检查同上
（一）
4.2制备土壤稀释液：
1、取土壤
取表层以下10~20cm处的土壤样品，放入灭菌的袋中备用，或放在4oC冰箱暂存。
2、制备稀释液（要无菌操作）
（1）制备土壤悬液：
取土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的无菌水瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底为最好），振荡5~10min，使土样充分打散，即成10-2的土壤悬液。
（2）稀释：
用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL,放入4.5m无菌水中,即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3~10-7的稀释液。
注意：
操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支移液管，每次吸土液，要将移液管插在液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。
示意图如下：
0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml
10-210-310-410-510-610-7
稀释过程示意图
（图中左侧梯形为三角瓶，其中加入49.5ml无菌水与0.5g土样，土壤溶液稀释度为10-2
依此类推，右侧三试管中土壤稀释度分别为：
10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）
4.3混菌菌种分离的方法
1）细菌取10-6，10-7两管稀释液各1ml，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。
然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中（装量以铺满皿底的2/3为宜），迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混均，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板，倒平板时注意无菌操作。
2）放线菌取10-3、10-4两管稀释液，在每管中加入10%酚液5~6滴，摇匀，静置片刻，然后分别从两管吸出1ml加入相应标号的平皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。
3）霉菌取10-2、10-3两管稀释液各1ml，分别接入相应的平皿中，每个稀释度接两个平皿。
在熔好的马丁氏固体培养基中，每100ml加入灭菌的乳酸1ml，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌平板。
4）酵母菌在3）即可能分离到。
4.4纯培养
将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28~30oC恒温培养，细菌培养1~2d，放线菌培养5~7d，霉菌3~5d。
可用于观察菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。
4.5.分离菌株的鉴定。
（1）记录菌种的培养特征。
（2）细菌的革兰氏染色，记录菌体特征与染色特性。
<1>制片：
制片方法与简单染色相同。
<2>初染：
加适量（以刚好覆盖菌为宜）的结晶紫染色液染色2.0min，水洗。
<3>媒染：
碘液媒染2min，水洗。
<4>脱色：
连续滴加95%乙醇脱色20—30s至流出液无色，立即水洗。
<5>复染：
滴加番红复染2min，水洗。
<6>镜检：
干燥后，油镜镜检观察.
（3）细菌的芽孢染色。
<1>制片：
按常规方法涂片、干燥及固定。
<2>加热染色：
向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。
<3>脱色：
待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。
<4>复染：
用0.5%番红水溶液复染2min。
<5>水洗：
用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。
<6>镜检：
将载玻片晾干后油镜镜检。
（4）细菌的荚膜染色
1.涂片：
在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水（或用接种环挑1-2滴水），用无菌的接种环挑取少量菌种与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，涂布面积约1cm2。
2.干燥：
涂片在室温下使其自然干燥，也可以小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
3.固定：
手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过微火三次（手指触摸反面不烫手为宜），待玻片冷却后，再加染色液。
4.染色：
玻片置于玻片搁架上，加适量（以盖满菌膜为度）草酸铵结晶紫（或石炭酸复红染液）于菌膜部位，染色1-2min。
5.水洗：
斜置载玻片，在自来水龙头（或洗瓶）下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
6.干燥：
自然干燥或用吸水纸吸去涂片上的水，用吸水纸时切勿将菌体擦掉。
7.镜检：
用高倍镜和油镜观察并绘细菌形态并绘图于记录表中
（5）
无核有核
（6）霉菌:
青霉：
菌落青色，扫帚壮孢子丝。
曲霉：
分生孢子梗由一根直立的菌丝形成，形似“太阳”状。
根霉:
基内菌丝有假根和匍匐枝。
（7）放线菌：
要用插片法进行插片才能进行观察，观察其气生菌丝和孢子丝。
六、结果及分析
6.1结果
见表1、图1、表2、表3、表4、表5
表1革兰氏染色的细菌
序号
菌种
菌种的特征
1
G-细菌（带芽孢）
杆状，有些芽孢椭圆比菌体细胞大，端位。
2
G+细菌（带芽孢）
杆状，芽孢不是太明显，芽孢透明，也是端位。
3
G-细菌（带芽孢）
椭圆状，有明显的芽孢，也是端位，芽孢似椭圆。
4
G+细菌
杆状，无芽孢，
5
G+细菌
杆状，无芽孢。
6
G+细菌
杆状，无芽孢。
7
G-细菌（带芽孢）
球状，有芽孢，而且芽孢明显，似椭圆状，芽孢端位。
8
G-细菌（带芽孢）
杆状，有芽孢，芽孢出现在端位。
9
G-细菌
球状，无芽孢。
10
G-细菌（带芽孢）
椭圆形状，有芽孢，芽孢出现在端位。
11
酵母菌
椭圆型，属于真核生物，颜色有深浅变化，有明显的细胞核。
12
酵母菌
椭圆型，属于真核生物，有细胞核。
在此放置您的文字
表3分离出的霉菌
序号
形态特征
形态图片
1
其孢子丝呈现扫帚状，为青霉。
2
有直立菌丝的顶端膨大呈球状，而且形似“太阳”状，球状结构的表面放射性的有一连串的孢子，但是孢子的颜色不一样，为曲霉
3
有许多的假根和匍匐枝，而且有些还有孢囊，为根霉
表4分离的放线菌
序号
孢子丝形态及分类
放线菌形态图片
1
大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。
孢子丝形态呈螺旋状、轮生等多种形态。
孢子也有球形、椭圆形杆状和瓜子状等等。
2
大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过不同分列的方式产生成串的分生孢子。
孢子丝形态呈螺旋状。
孢子也有球形、椭圆形杆状和瓜子状等等。
表5抗菌图谱
6.2分析
1.细菌
从表1和图1中可以看出来，我们的实验小组从土壤中分离出来的细菌有很多，其中有G+细菌、G-细菌、G+细菌（带芽孢的）、G-细菌（带芽孢）等等，有些是球状，也有些是杆状的等等都有。
种类
对应的试管号
G+细菌
4、5、6
G+细菌（带芽孢）
2
G-细菌
9
G-细菌（带芽孢）
1、3、7、8、10
2、酵母
从表1和图1中可以看出来，酵母菌为真核生物，有明显的细胞核，另外在实验中可以利用显微镜观察细胞的形态就可以来区别细菌和酵母菌。
而且酵母细胞也比较大，一般都比细菌要大，利用高倍镜也可以看到其细胞核。
3、霉菌
从表3中可以看到，我们组在取的土壤中分离到了2中霉菌，另外我们用稀饭又培养到了根霉，通过对这3种霉菌进行纯培养后，我们对其进行压片处理，并且观察其形态特征以及孢子丝的特点，我们可以确定这3种霉菌分别为青霉、曲霉和根霉。
4、放线菌
从表4中可以看出来，我们的实验小组分离到了放线菌，并且对其进行纯培养和插片处理，发现了它的孢子丝为松的螺旋状，我们可以初步判断其可能为链霉菌属的一种。
然后我们利用放线菌进行发酵实验，让其产生代谢产物，并且检测其活性，我们从中发现放线菌4的代谢产物对藤黄微球菌的生长有抑制作用，放线菌2和3的代谢产物对苏云孢杆菌的生长有抑制作用，放线菌1的代谢产物对它们的生长好像没有抑制作用。
参考文献
【1】沈萍、陈向东主编微生物学实验（第四版）-北京:
高等教育出版社，2007.11
ISBN978-7-04-022082-7
【2】周德庆编著微生物学教程—3版.—北京：
高等教育出版社，2011.4ISBN978-7-04-031404-5
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