DGGE实验操作步骤详细资料.docx

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DGGE实验操作步骤详细资料

DCODESYSTEM安装培训SOP

一、培训前需跟用户确认以下事项

1，试剂准备

（1）变性浓度0%的储存液

（2）变性浓度100%的储存液

（3）50X或10X的TAE缓冲液（后续需要稀释为7L左右的1X缓冲液使用，需要准备约7L

超纯水）

（4）10%过硫酸铵（AP）：

0.1g过硫酸铵溶于1ml的去离子水中

（5）TEMED（直接跟试剂公司购买）

（6）上样缓冲液（如实验室有现成的6X或10Xloadingbuffer，则不需配该项了）

（7）核酸染色剂（EB，GOLDVIEW,SYBRGREEN等核酸染色试剂均可以）

（8）可以进行染色和脱色的容器，磁盘或饭盒等，长宽20cm以上

（9）移液器、枪头

实验前请先确定配置多大浓度的胶以及变性浓度的范围（如20%-70%或者30%-60%，最好可以在相关文献中查到）。

不同浓度的胶适用于不同片段大小的分离。

变性浓度的范围直接关系到片段的分辨力。

变性浓度为0%和100%的溶液可配置，作为储存液，用来实验时配置成不同变性浓度的胶。

详细的配置方法以及所需试剂请参考以下图片。

2，所需其它仪器设备

（1）电源（伯乐公司的basic和HV均可）可以设置电压至200V左右。

（2）核酸成像设备

可以进行核酸的紫外成像仪，成像面积最小16cmX16cm

3，如果需要跑用户自己的样品，请提前准备好尽量新鲜的PCR产物，最好先经过琼脂糖电泳验证条带是否单一，以及亮度如何（上样量为180-300ng/well），储存于-20°C。

二、现场培训

检查仪器外包装、清点仪器及配件，跟用户现场确认。

1，梯度胶的组装和灌制

475梯度仪和注射器等小组件的组装请参考下图

不同尺寸大小的玻璃板及不同垫片厚度的组合，所需要胶的总体积、每个注射器所需的体积和475生成仪上的体积调整设置（上图中volumesettingindicator）都是不同的，具体参考下图

（1）组装制胶架

DGGE实验推荐使用16X16cm的玻璃板组件。

戴手套和口罩进行操作。

在一个干净的平稳的场所，提前将玻璃板、垫片、海绵垫片等小组件彻底清洗干净晾干（新

的可直接用）。

使用非凹槽的垫片，将其放置于长短玻璃板两侧之间，注意垫片上侧的小孔的位置，不可

随意更换。

按照以下图片，将两个夹子将带有垫片的两个玻璃板左右夹紧，下端平整，然后用纸卡片插入两个玻璃板中间，调整垫片的位置和两个夹子的松紧，确保组装的密闭性，玻璃板上端平整，垫片的位置整齐，否则在实验中漏胶或buffer

（2）灌制梯度胶

a,将海绵垫固定在制胶架上，把类似‘三明治’结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用

分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意将短玻璃的一面正对着自己。

b.共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm，短的那根长9cm。

将短的那根与Y

形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在30ml的注射器上。

注意管内不要有残留

的胶液或者水等杂物。

c.在两个注射器上分别标记‘高浓度’与‘低浓度’，并安装上相关的配件，调整梯度传

送系统的刻度到适当的位置!

例如16*16cmgels（1mmthick）：

设体积调整装置到14.5。

d.反时针方向旋转凸轮到起始位置。

为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。

将体积

设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。

例如16*16cm

gels（1mmthick）：

设体积调整装置到14.5。

e.配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。

如选择的浓度范围是20%-70%，则需要通过计算，分别加入不同量的0%和100%储存液来分

别配置。

以配置15ml的20%的胶为例，X为加入0%的体积，Y为加入100%的体积

X+Y=15

X0%+Y100%=15x20%

即可计算出X和Y各加多少

以下的步骤是有时间限制的（7-10min）请确定上述5个步骤准备好了再进行以下操作，且需要对以下步骤操作熟练。

f.在两个离心管中加入APS和TEMED，使其终体积浓度为0.09%（V/V），迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。

用连有聚乙烯管标有‘高浓度’的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶操作同上。

g.通过分别推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动胶溶液到聚丙烯管的末端。

注意不要将胶液推出管外，因为这样会造成溶液的损失，导致最后凝胶体积不够。

操作过程难免有浪费和误差，所以配置的胶的体积应该比设置体积多一些，如设置的14.5，则可配置胶的体积可以为15ml

h.分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把

位置放正确!

（475梯度仪上标注好了topfilling哪面放置高浓度注射器哪面放置低浓度注射器）

i.将两个注射器的聚丙烯管同Y形管相连，Y型管的另一头连接第三个聚丙烯管（9cm）

j.把针连接到聚丙烯管上，放置于玻璃板的中间位置，为了方便，可以用小夹子使其固定。

k.轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地

推动凸轮，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中。

l.小心插入梳子，让凝胶聚合大约一个小时。

m.尽快清洗注射器和聚丙烯管等，避免残留的胶凝聚后不容易清洗。

注意，待胶凝聚的时候正好可以提前打开电泳控制设备，将缓冲液预热至60°C,这样可以更节省时间

2.“三明治芯”的组装

（1）确保浅黄色的“三明治芯”上面的U型白色垫片封闭性好，且干净，无凝胶等附着在

垫片上面

（2）将已经凝聚好的胶夹子整体从制胶底座上拿下来，并小心的取下梳子

（3）将玻璃板固定到三明治芯上，短板在三明治芯的里面，长板在外面。

如同时跑两块胶，

则另一面也同样安装好玻璃板，这样在三明治芯的上端就形成了一个上部的电泳上槽。

如果只跑一块胶，则另一面的玻璃板中间不用放垫片即可。

同样安装到三明治芯上。

（4）将约350ml的runningbuffer倒入上槽内，目的是确认漏不漏液，如果有漏液的情况，

则需将buffer先倒出，重新组装玻璃板，直至不漏液为止。

（tips可以在U型垫片上滴

几滴buffer以便增加润滑性和密闭性）

3.加缓冲液、上样、运行

（1）在电泳槽中加入7Lrunningbuffer

（2）待温度升至设定温度时，关闭系统，将温度控制模块搬下，先放置于黑色的铁架子上，将上述安装好的“三明治芯”放入电泳槽内，注意“三明治芯”上的红色按钮在右边，黑色按钮在左边。

最后再将温度控制模块放上去。

（3）打开power、pump、heater按键。

拿掉clearloadinglid（放在温度控制模块上面的透明的带有电极的长方形组件），用移液器吸取buffer吹洗一下加样孔附近未完全凝聚的碎胶等杂物。

将loadinglid放回，按紧。

（4）缓冲液的温度回升至设定温度，需要大概10-15min

（5）将loadinglid拿掉，同上吹洗点样孔，小心点样（最好用测序胶用的枪头，前端很长很细），将loadinglid放回，按紧。

（6）在电源上设置好电压，开始运行程序。

对于DGGE\CDGE推荐电压130V，不能超过180V。

电压过高电泳过程热量影响电泳结果。

对于TTGE推荐130V，不能超过150V。

电压过高电泳过程热量影响温度梯度

4.电泳结束、成像

（1）关闭按钮（heaterpumppower）关掉电源。

让heater在buffer里冷却约1min

（2）搬走温度控制模块，将“三明治芯”上槽中的buffer倒入电泳槽里。

（3）拆开“三明治芯”，松开制胶夹子，将玻璃板拿下来。

将玻璃板中间的垫片拿出，掰开两块玻璃板，此时胶会自然的脱落在一个玻璃板上。

为了方便操作，可以将胶和一块玻璃板一起进行染色。

（4）250mlrunningbuffer内进行染色（EBSYBRGREENGOLDVIEW均可）

（5）脱色，成像。