注射用重组人白介素.docx

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注射用重组人白介素

注射用重组人白介素—4外源DNA残留量的检测

摘要目的检测本实验室生产制备的重组人白介素—4原液中外源DNA的残留量方法提取大肠杆菌基因组DNA，经过酶切变性处理后，加入地高辛标记探针，再用探针进行杂交实验。

结果包括DNA纯度及浓度检测、基因组DNA酶切效率的检测、探针标记效率的检测、杂交的免疫检测，显示五个结果均正常。

结论供试品（注射用人重组白介素—4原液）中外源DNA的含量小于0.1ng/μL，本批次产品合格。

关键词白细胞介素—4外源DNA残留DIG探针标记

DetectionofexogenousresiduesDNAfromInjectiveRecombinantHumanIL-4

AbstractObjectiveDetecttheexogenousDNAinhumanrecombinantinterleukin-4concentrateresidueswhichproducedbyourownlab.MethodExtractE.coil’sgenomeDNA,dealwiththeenzymedenaturation,addtagsdigoxinprobe,probehybridizationexperiments.Testresultsincludingfive:

DNApurityandconcentration,genomicDNAenzymeefficiencyofdetection,probedetection,theefficiencyofhybridizationofimmunedetection,experimentshowsfiveresultswerenormal.ConclusionThetestshowsthatthesamples（concentrate）employingrecombinantinterleukin-4injectionofexogenousDNAcontentislessthan0.1ng/muL,sothisbatchproductisqualified.

KeywordInterleukin-4theexogenousresiduesDNADIGlabeledprobe

前言

基因工程药物中宿主细胞残余DNA对人体可能造成插入突变，导致抑癌基因失活，癌基因被激活等严重危害，外源大肠埃希氏菌DNA进入人体后,可能导致肿瘤的发生[1]，因而对基因工程药物中外源DNA的控制具有重要意义。

注射用重组人白介素—4中外源DNA经变性为单链后，吸附于固相尼龙膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成双链DNA，称为杂交[2]，应用DNA杂交技术，将特异性单链DNA经地高辛（DIG）探针标记后，与吸附在尼龙膜上的注射用重组人白介素—4单链DNA杂交，加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体与地高辛标记的探针相结合，再加入碱性磷酸酶的作用底物CSPD，通过相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测注射用重组人白介素—4中外源DNA残留量[4]。

目前，基因工程药物在攻克肿瘤、心血管系统等一些疑难病症等领域，发挥着巨大的作用[8]。

本实验室生产的注射用重组人白介素—4，采用大肠杆菌作为工程菌，提取pET32a（+）载体与pUC18/mIL24质粒,用限制性内切酶NdeI酶切得到带有互补粘性末端的载体和目的基因片段,用T4DNA连接酶连接后转入JM109中,涂布在加有氨卞青霉素的固体LB培养基上,培养过夜[11]。

挑取阳性菌落，经质粒酶切验证、DNA测序，确认质粒构建正确且无突变后,转入大肠杆菌BL21感受态细胞,从而获得pET32/rmIL24质粒的BL21（DE3）表达工程菌。

控制相关条件促使人的白介素-4基因（目的基因）表达，生产重组蛋白药物人白介素—4（约15KD）。

经目的基因工程菌的发酵，收集菌体沉淀，超声破菌后离心，3M盐酸胍洗涤，7M盐酸胍溶解，制得包涵体，逐步降低变性剂浓度复性后，再经脱盐、分子筛层析、离子交换层析等系列纯化后[3]，得到产品原液。

重组的蛋白产品功能一般与天然相似，但由于生产方法不同，其纯度要求、毒副作用和体内药物代谢动力学性质仍与天然的产品有很大区别[9]，所以对原液进行相关检测是必要的，外源DNA的含量超标，核酸残留量控制不好，可使药物产生毒副作用[7]，本实验借鉴southernblot的技术手段，应用DNA与DNA杂交的原理，检测产品原液中外源DNA的残留量，以达到质量监控的目的。

材料与方法

1.实验材料

1.1样品来源本实验室生产制备的重组人白介素-4原液。

1.2实验设备

1.2.1实验器材

名称厂家型号

软片冲洗机虎丘影像科技（苏州）有限公司HQ—320XT

移液器1000μLeppendorf100～1000μL

移液器100μLeppendorf10～100μL

移液器10μLeppendorf0～100μL

移液器2.5μLeppendorf0～2.5μL

1.2.2实验材料

名称厂家型号

细菌基因组DNA提取试剂盒TIANGENBiotechH7208

DNA酶切BsuRI（HaeⅢ）fermentasER0151

杂交试剂盒（DetectionStarterKitⅡ）Roche11585614910

马来酸成都科龙试剂厂500g

氯化钠天津海龙药业有限公司1000g

氨基丁三醇重庆青阳药业有限公司500g

柠檬酸钠成都科龙试剂厂500g

SDS（十二烷基硫酸钠）湖南尔康制药有限公司500g

甲醇成都科龙试剂厂500mL

冰醋酸成都科龙试剂厂500mL

1.3溶液配制

1×TAE：

量取8mL50×TAE（称取Tris242g，Na2EDTA.2H2O37.2g于1L烧杯中，加入800ml无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm），充分搅拌溶解。

加入57.1ml冰醋酸，充分混匀，继续加入无菌水定容至1L。

）加至382mL无菌水中，混匀，室温保存。

washingbuffer（1L）：

称取马来酸（顺丁烯二酸）11.6g，氯化钠8.775g,适量无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）溶解，调pH至7.5，定容至1L后，加入3ml0.3%吐温20，充分混匀。

maleicacidbuffer（1L）：

称取马来酸（顺丁烯二酸）11.6g，氯化钠8.775g,加入适量无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）溶解，调pH至7.5，定容至1L。

blockingbuffer（1×）：

用Maleicacidbuffer稀释试剂盒中的blockingbuffer10×（瓶号⑥）至1×，即取2mL10×blockingbuffer加入18mLMaleicacidbuffer,现配现用。

抗体溶液：

试剂盒中的抗体（瓶号④）溶液经10000r/min，5min离心，取上层液体用1×blockingbuffer1：

10000稀释（1μL抗体溶液+10mL1×blockingbuffer）。

detectionbuffer：

称取Tris碱12.1g，NaCl5.85g，适量无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）溶解，调PH至9.5，定容至1L。

1%蛋白酶K溶液：

称取蛋白酶K0.1g,溶于10mL无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）中,分装储存﹣20℃。

0.3%牛血清白蛋白溶液：

称取BSA0.3g,溶于1mL无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）中,分装储存﹣20℃。

蛋白酶缓冲液（pH8.0）：

量取1MTris溶液（PH8.0）1mL、5MNaCl溶液2mL、0.5M乙二胺四乙酸二钠溶液（PH8.0）2.0mL、20%SDS溶液（PH8.0）2.5mL，加无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）至10mL。

TE缓冲液（pH8.0）：

量取1MTris溶液（PH8.0）10mL、0.5M乙二胺四乙酸二钠溶液（PH8.0）2.0mL，加UP水（电阻率＞18.2MΩ.cm）至1000mL。

1%鱼精DNA溶液：

精密称取鱼精DNA0.1g于10mL量瓶中，用TE缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮藏于﹣20℃。

DNA稀释液：

取1%鱼精DNA溶液50μL，加TE缓冲液至10mL。

20×SSC（1L）：

称取氯化钠175.32g，柠檬酸钠88.23g，加无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）1L溶解。

1%SDS（1L）：

称取10g十二烷基硫酸钠溶于1L无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）中。

2×SSC0.1%SDS（1L）：

取100mL1%SDS，100mL20×SSC，加无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）800mL，混匀。

1×SSC0.1%SDS（1L）：

取100mL1%SDS，50mL20×SSC，加无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）850mL，混匀。

2.实验方法

2.1培菌（PET32a-NdeI-hil4，于2007年5月保种）

2.1.1配制LB培养基：

称取蛋白胨2g、酵母浸出物1g、氯化钠2g于200mL蓝口玻璃瓶中，加入无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）200mL。

2.1.2121℃，20min高压蒸汽灭菌LB培养基。

2.1.3待培养基冷却，超净工作台内加入氨苄西林钠100μL（浓度为0.2g/ml），接种PET32a-NdeI-hil4菌液20μL，37℃，220r/min摇床培养，过夜。

2.2提取细菌基因组DNA（细菌基因组DNA提取试剂盒）

2.2.1分别取细菌培养液1～5mL于标记A、B的离心管中（细菌提取量约为1.0×108个细胞），10000rpm,离心1分钟,尽量吸尽上清。

2.2.2向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮，加入4μLRNaseA（100mg/mL）溶液，目录号：

RT405-11，振荡15s，室温放置5min.

2.2.3向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。

2.2.4加入220μL缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10min,简短离心去除管内壁水珠。

（注：

加入缓冲液GB时可能产生白色沉淀，一般70℃放置10min会消失，不影响后续实验，如果溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可导致提取DNA量少和提取的DNA不纯。

）

2.2.5加入220μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以除去管内壁的水珠。

2.2.6将上步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收集管中），12000rpm，30s离心，倒废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

2.2.7吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前应加入17mL无水乙醇），12000rpm，30s离心，倒废液，吸附柱CB3放入收集管中。

2.2.8吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW（使用前应加入50mL无水乙醇），12000rpm，30s离心，倒废液，吸附柱CB3放入收集管中。

2.2.9吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000rpm，30s离心，倒废液，吸附柱CB3放入收集管中。

2.2.10将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm，离心2min，倒掉废液，吸附柱CB3室温放置30min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（漂洗液中的乙醇残留，会影响后续的酶反应试验。

）

2.2.11将吸附柱CB3转入一个干净的离心管，向吸附膜中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000rpm，离心2min，溶液收集入离心管中。

（注：

为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液加入到吸附柱CB3，室温放置2min，12000rpm,2min离心，洗脱缓冲液不得少于50μL，加入体积小会影响回收效率。

若用水做洗脱液，应用氢氧化钠溶液调至PH7.0～8.5，PH低于7.0会降低效率。

）

2.2.12DNA溶液保存于—20℃。

2.3DNA溶液浓度、纯度检测

2.3.11%琼脂糖凝胶检测DNA溶液的纯度

2.3.1.1制胶：

称取0.6g琼脂糖于100mL三角瓶中，加入60mL1×TAE，微波炉反复打热至琼脂糖完全融化，取出，稍冷加入两滴goldView，凝胶倒入插有梳子的电泳板，待凝备用。

2.3.1.2上样：

拔除样品梳，取出凝胶置入电泳槽中，点样孔放负极，加入适宜体积1×TAE（没过琼脂糖凝胶为准），电泳孔中用加样枪依次点入8μLMaker（DNAladdermix）；DNA溶液5μL+DNAloadingbuffer2μL（事先混匀，再用加样枪吸取点入电泳槽）。

2.3.1.3电泳：

接通电源，120V电泳45分钟。

2.3.2浓度测定

2.3.2.1稀释DNA溶液：

取10μLDNA溶液加入290μLTE缓冲液中（稀释30倍）。

2.3.2.2用TE缓冲液调零，分别于260nm、280nm处测OD值，稀释30倍后的DNA浓度为6.1669μg/mL，所以经基因组试剂盒提取的DNA浓度为6.1669×30=185.007μg/mL

2.4基因组DNA酶切

2.4.1离心管中按体积加入以下物质（构建20μL酶切体系）

10×BufferR2μL

DNA（1.5～2.0μg）10.8μL

BsuRI（HaeⅢ）2μL

无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）5.2μL

2.4.2离心管封口膜封口，37℃水浴3小时。

2.4.31%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效率。

2.4.3.1制胶：

称取0.6g琼脂糖于100mL三角瓶中，加入60mL1×TAE，微波炉反复打热至琼脂糖完全融化，取出，稍冷加入两滴goldView，凝胶倒入插有梳子的电泳板，待凝备用。

2.4.3.2上样：

拔除样品梳，取出凝胶置入电泳槽中，点样孔放负极，加入适宜体积1×TAE（没过琼脂糖凝胶为准），电泳孔中用加样枪依次点入8μLMaker（DNAladdermix）；DNA酶切后混合溶液5μL+DNAloadingbuffer2μL（事先混匀，再用加样枪吸取点入电泳槽）。

2.4.3.3电泳：

接通电源，120V电泳45分钟。

2.5DIG探针标记

2.5.1取10μL模板DNA溶液（浓度经酶切后为2μg/μL）于0.5mL离心管中，另加入6μL无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm），使终体积为16μL。

2.5.2水浴锅中沸水煮10min，立即冰上冷激（变性）。

2.5.3加入标记混合物DIG-HighPrime（瓶号①）4μL，混匀，简短离心将反应液收集于管底。

2.5.4封口膜封口后，37℃水浴15小时。

2.5.5向EP管中加入2μL0.2MEDTA（PH8.0），终止反应。

2.6探针标记效率的检测

2.6.1剪刀剪取尼龙膜，长12cm，宽3cm，切角标记区分点样面，甲醇中浸泡4～5s，取出，washingbuffer中漂洗4～5s，室温晾干。

2.6.2稀释标记物

表1DNA标记物与标准品的倍比稀释

DNA标记物（浓度为55ng/μL）

DIG-labelledDNA（标准品初浓度为5ng/μL）

取1μL待稀释物+4.5μLDNA稀释液

10ng/μL

取1μL标准品+4μL纯水

1ng/μL

取1μL（10ng/μL）+9μLDNA稀释液

1ng/μL

取样1μL（1ng/μL）+9μLDNA稀释液

100pg/μL

100pg/μL

取样1μL（100pg/μL）+9μLDNA稀释液

10pg/μL

10pg/μL

取样1μL（10pg/μL）+2.3μLDNA稀释液

3pg/μL

3pg/μL

取样1μL（10pg/μL）+9μLDNA稀释液

1pg/μL

1pg/μL

取样1μL（3pg/μL）+9μLDNA稀释液

0.3pg/μL

0.3pg/μL

取样1μL（1pg/μL）+9μLDNA稀释液

0.1pg/μL

0.1pg/μL

取样1μL（0.3pg/μL）+9μLDNA稀释液

0.03pg/μL

0.03pg/μL

取样1μL（0.1pg/μL）+9μLDNA稀释液

0.01pg/μL

0.01pg/μL

2.6.3点样：

尼龙膜上排间隔1cm依次点样（DNA标记物）：

1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、3pg/μL、1pg/μL、0.3pg/μL、0.1pg/μL、0.03pg/μL、0.01pg/μL、空白对照（TE缓冲液），上样量2μL；尼龙膜下排间隔1cm依次点样（DIG-labelledDNA标准品），浓度与上排标记物相对应，上样量2μL，室温晾干后，80℃烤箱烘烤20分钟。

2.6.4紫外交联仪固定DNA探针，正反面各2.5分钟。

2.6.5尼龙膜浸入20mLMaleicacidbuffer平皿中，室温摇动漂洗5分钟。

2.6.6尼龙膜在10mLblockingbuffer中室温封闭30分钟。

2.6.7镊子夹取尼龙膜置入杂交袋中，在点样面加入5mL抗体溶液，37℃，孵育30分钟。

2.6.8取出尼龙膜，washingbuffer中漂洗2次，15min/次

2.6.9detectionbuffer浸泡平衡5min

2.6.10镊子夹取尼龙膜置入杂交袋中，在点样面加入CSPD500μL，37℃，避光孵育10min

2.6.11暗室曝光，洗片。

2.7杂交

2.7.1剪刀剪取长8cm、宽3cm尼龙膜，甲醇中处理5s，washingbuffer中漂洗5s，室温晾干后，80℃烤箱烘烤30分钟。

2.7.2蛋白酶K处理样品（原因：

基因工程产品中微量残余DNA的检测受蛋

白质的干扰较大,由于其含量远高于残余DNA,检测结果可能导致假阳性（6）），处理方法如下表所示：

表2蛋白酶K处理样品

处理样品

加样量（μL）

1%蛋白酶K（μL）

蛋白酶缓冲液（μL）

0.3%BSA（μL）

ddH2O

（μL）

总体积

（μL）

供试品（IL-4浓度为100μg/mL）

100

2

20

0

78

200

标记物D1（外源DNA浓度为10ng/μL）

100

2

20

3.3

74.7

200

标记物D2（外源DNA浓度为1ng/μL）

100

2

20

3.3

74.7

200

标记物D3（外源DNA浓度0.1ng/μL）

100

2

20

3.3

74.7

200

阴性对照

（DNA稀释液）

100

2

20

3.3

74.7

200

空白对照

（TE缓冲液）

100

2

20

3.3

74.7

200

2.7.3将以上1～6号离心管封口膜封口，37℃水浴箱中孵育4h，取出100℃煮10min，冰上冷却后，简短离心。

2.7.4点样：

在烤干后的尼龙膜上按D1、D2、D3、阴性对照、供试品、空白对照的顺序间隔1cm上样2μL，室温晾干，80℃烤箱烘烤30分钟。

2.7.5紫外交联：

尼龙膜正反面各2.5分钟，紫外强度为250Mw/cm2。

2.7.6预杂交：

镊子夹取尼龙膜置于杂交袋中，点样面加入5mL预杂交液（DIGEasyHybgranules瓶号⑦），65℃预杂交2小时。

2.7.7杂交：

弃去杂交袋中的预杂交液，加入探针混合液（离心管中加入8μL探针和32μLTE缓冲液，封口膜封口，100℃煮5min，冰上冷却，简短离心，加样枪吸取40μL混合液于8mL预杂交液中，混匀），

65℃杂交过夜。

2.8免疫检测

2.8.1杂交后洗膜：

2×SSC0.1%SDS溶液室温洗膜2次，5min/次，1×SSC0.1%SDS65℃洗膜2次，15min/次。

2.8.2washingbuffer室温洗膜5分钟。

2.8.3blockingbuffer室温封闭60分钟。

2.8.4镊子夹取尼龙膜置入杂交袋中，在点样面加入抗体溶液5mL，37℃，孵育60分钟。

2.8.5washingbuffer室温洗膜3次，10min/次。

2.8.620mLdetectionbuffer浸泡平衡5分钟。

2.8.7镊子夹取尼龙膜置入杂交袋中,在DNA面加入200mLCSPD显影液，37℃，避光孵育10分钟。

2.8.8暗室曝光，洗片。

结果

结果1：

图1：

1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA溶液的纯度

1%琼脂糖凝胶电泳检测经细菌基因组DNA提取试剂盒提取的DNA溶液的纯度，电泳45分钟之后，电泳图只有一条带，无拖尾现象，说明经提取的大肠埃希氏菌基因组DNA纯度合格。

结果2：

表3DNA溶液浓度测定结果

参数数值

A2600.2420

A2800.1308

A260/A2801.8500

浓度（μg/mL）6.1669

经细菌基因组DNA提取试剂盒提取的DNA溶液的浓度测定，用TE缓冲液调零，DNA应该在OD260处有显著吸收峰，A260应该在0.2～1.0之间，A260/A280处在1.8～2.0之间，根据以上标准，可知此次测定有效，原DNA溶液的浓度为185.007μg/mL

结果3：

图2：

1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效率

基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA，为了获得理想的结果，模板DNA应该线性化，且大小应该在100bp以上。

如果模板DNA大于5kb，那么在标记之前应该采用限制性酶切序列为4个核苷酸的限制性酶（如HaeⅢ）对模板进行酶解。

由图可知，酶切后的片段大小满足要求，酶切效率合格。

结果4：

图3：

DIG探针标记效率检测

上排为九个浓度梯度的DNA标记物和TE缓冲液，DNA标记物的浓度分别为1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、3pg/μL、1pg/μL、0.3pg/μL、0.1pg/μL、0.03pg/μL、0.01pg/μL，下排为相应浓度的标准品〔DIG标记的对照DNA20μL，5μg/mL质粒pBR328DNA（BamHI线性化）澄清溶液，用于确定标记效率〕，由上图可知，下排标准品曝出的光点随着浓度降低而变小，检测的灵敏度高达0.01pg/μL，上排结果显示，我们的标记物灵敏度也高达0.01pg/μL，可以作为外源残留DNA含量的检测的依据。

结果5：

图4：

杂交后免疫检测

阳性对照D1、D2、D3三个点随DNA标记物浓度降低光点变弱，阴性对照、空白对照均无光点曝出，说明此次检测有效，供试品（注射用人重组白介素—4原液）中外源DNA的含量低于0.1ng/μL，符合《中华人民共和国药典》的规定，此批次产品中外源DNA含量未超标，合格。

讨论

1、如果实验结果出现低灵敏度，存在原因可能为：

①无效的探针标记，一定要通过与标记的对照DNA进行比较，检查地高辛所标记探针