qpcr步骤.docx
《qpcr步骤.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《qpcr步骤.docx(20页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
![qpcr步骤.docx](https://file1.bdocx.com/fileroot1/2022-12/19/7b23ca10-515b-4dda-a3c9-0097839be07a/7b23ca10-515b-4dda-a3c9-0097839be07a1.gif)
qpcr步骤
qpcr步骤
范围和适用性
本实验适用于使用StepOnePlus™实时PCR仪对DNAPE、DNAPEIndex、SE文库以及ExonCapture组、转录组、表达谱、SmallRNA组、表观遗传组等制备的文库进行上机前的精确定量。
摘要
荧光定量PCR实验是以Agilent2100Bioanalyzer对文库的检测结果为参照,使用StepOnePlus™实时PCR仪对文库进行定量,得出待测文库浓度,为之后的Cluster制备提供浓度依据。
该实验的主要内容包括:
(1)梯度稀释标准品;
(2)按实验要求稀释样品;(3)配制反应预混液;(4)加样;(5)设置反应程序;(6)运行实验;(7)分析实验结果,计算待测样品浓度。
整个流程需要3-4小时。
缩写词和SOP中专业术语的解释
缩写词或术语
解释
基线(Baseline)
扩增曲线中的水平部分
阈值(Threshold)
高于基线但处于扩增曲线的指数增长区范围之内的荧光水平。
Ct值
扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。
实验材料及方法
1实验试剂和耗材
1.1试剂
1.2耗材
表1-2实验所需耗材
耗材
型号
生产厂家
96孔国产光学反应板
国产
光学封口膜(泛特津)
国产
0.2mlSterile,PCRmicrotubes
PCR-02D-C
Axygen
0.6ml离心管
MCT-060-C
Axygen
吸嘴0.5-10ul超微量、袋装
T-300
Axygen
吸嘴200ul黄色吸嘴、袋装
T-200-Y
Axygen
吸嘴1000ul蓝色、袋装
T-1000-Y
Axygen
1.5ml离心管
MCT-150-C
Axygen
2实验仪器设备
表2-1实验所需仪器设备
设备
型号
生产厂家
StepOnePlus™Real-TimePCRSystem
4376592
ABI
迷你离心机
LX-200
海门其林贝尔
Vortex
QL-901
海门其林贝尔
微孔板离心机
MPS-1000
Labnet
3实验操作流程
3.1填写Q-PCR实验登记表
样品的交接按照《质控组样品交接管理规程》执行。
实验前,先在“表单准备区”将要检测的样品在《Q-PCR实验登记表》中填写好,并根据“文库交接检测”文件夹中《____组文库检测结果》中的待测样品的顺序按顺序填到《Q-PCR实验登记表》上,并在右上角注明批次后打印出来。
然后将需要检测的样品的样品名和文库号按照《Q-PCR实验登记表》上的顺序粘贴到“文库核对&存放位置”文件夹中的《文库检测前核对表》Excel表中,等待核对样品信息。
3.2稀释标准品
开始实验前,到-20℃冰箱和冰柜中将实验所需的标准品和样品取出,并按Q-PCR实验登记表上的顺序排好,并到表单准备区,用扫描枪将样品的文库号扫描到“文库核对&存放位置”文件夹中的《文库检测前核对表》Excel表中进行核对,核对结果为“错错错错”,则样品不正确需重新找取样品信息相同的样品;核对结果为“对”,则样品正确。
核对完样品信息后,将样品和标准品拿到“稀释区”进行稀释。
名称
移液量
超纯水(μl)
终浓度(pM)
Std1
原管(1nM)
不稀释
1000
Std2
2μl(Std1)
18
100
Std3
2μl(Std2)
18
10
Std4
2μl(Std3)
18
1
Std5
2μl(Std4)
18
0.1
1)取5个0.2mlPCR离心管,分别标记为Std1、Std2、Std3、Std4和Std5。
标准品多于一种时应标明标准品的名称。
2)分别吸取18μl超纯水至Std2、Std3、Std4和Std5离心管。
3)使用新Tip移取2μlStd1至装有18μl超纯水的Std2离心管,用Vortex振荡10至15秒,用力用手甩离心管,将壁上的液体甩下。
4)使用新Tip移取2μlStd2至装有18μl超纯水的Std3离心管,用Vortex振荡10至15秒,用力用手甩离心管,将壁上的液体甩下。
5)使用新Tip移取2μlStd3至装有18μl超纯水的Std4离心管,用Vortex振荡10至15秒,用力用手甩离心管,将壁上的液体甩下。
6)使用新Tip移取2μlStd4至装有18μl超纯水的Std5离心管,用Vortex振荡10至15秒,用力用手甩离心管,将壁上的液体甩下。
7)将已稀释的标准品置于4℃或冰上。
【注意】
●原管(1nM)的标准品要用时从-20℃冰箱中的标准品盒子中取出;不用时应及时放回-20℃冰箱中,以防降解。
●实验前带上口罩和新手套,并用70%酒精将实验台擦拭一遍。
●移液要准确,振荡要充分,振荡前需检查管盖是否盖严。
●使用超纯水稀释标准品。
3.3稀释样品
1)如果待测文库是需要混合的Index文库,则先按照《Q-PCRpooling规则》混合好,贴好标签等待检测。
2)取和待测样品数量相同的0.6mlPCR离心管,分别标记为待测样品名称或者是样品管盖上的记号。
3)如果待测样品体积小于15ul(如表达谱、SmallRNA组的样品),则分别吸取99μl超纯水至每个离心管中;如果待测样品体积大于15ul,则分别吸取198μl超纯水至每个离心管中。
4)将待测文库的样品原管充分振荡,短暂离心后,按照Q-PCR实验登记表上的顺序排好,然后分别移取样品溶液至相对应的装有超纯水的离心管中,如果样品体积小于15ul的,则吸取1ul的样品到装有99ul超纯水的离心管中;如果样品体积大于15ul,则吸取2ul样品到装有198ul超纯水的离心管中。
振荡10至15秒,短暂离心。
5)将已稀释的样品置于4℃或冰上;将样品原管放回-20℃冰柜中的编号盒存放,将样品放到编号盒中腾空的位置,并将样品的文库号用扫描枪录入“文库核对&存放位置”文件夹中的《上机文库存放位置表》Excel表中的对应位置存档。
【注意】
●移液要准确,振荡要充分,振荡前需检查管盖是否盖严,吸取样品后确保管盖盖严。
●使用的超纯水稀释样品。
3.4配制反应预混液
1)到隔壁实验室的“Mix配制区”配制反应预混液。
取1.5ml或2ml离心管,在管盖上标记上Mix,套上锡箔纸。
2)按以下反应体系准备反应预混液(以8个PE样品、1条标准曲线和10个SE样品、2条标准曲线为例):
表3-4-1PEMix的配置
组分
1次反应所需用量(μl)
37次反应所需用量(μl)
PEMix
7.05
260.85
dNTP(2.5mM)
0.8
29.6
Probe
0.25
9.25
ROX
0.2
7.4
PEPCRPrimer1.1
0.3
11.1
IndexPCRPrimerRR
0.3
11.1
EXTaqHS
0.1
3.7
Template
——
——
Total
9
333
*标准品5个浓度各2个反应孔,NTC(无模板对照)1个反应孔,每个样品3个反应孔,2孔用于移液损失,共37孔。
表3-4-2SEMix的配置
组分
1次反应所需用量(μl)
53次反应所需用量(μl)
SEMix
7
371
dNTP(2.5mM)
0.8
42.4
EvaGreen
0.5
26.5
ROX
0.2
10.6
SEPCRPrimer1.1
0.2
10.6
SEPCRPrimer2.1
0.2
10.6
EXTaqHS
0.1
5.3
Template
——
——
Total
9
477
*2条标准曲线,标准品5个浓度各2个反应孔,NTC(无模板对照)1个反应孔,每个样品3个反应孔,2孔用于移液损失,共53孔。
其中,PEMix和SEMix的组分和每孔反应所需的用量如下表:
表3-4-3PEMix表3-4-4SEMix
组分
所需用量(μl)
组分
所需用量(μl)
10×Buffer
1
10×Buffer
1
MgSO4
0.1
MgSO4
0.1
Tween20100×
0.1
Tween20100×
0.1
DMSO
0.5
DMSO
0.5
H2O
3.35
H2O
3.3
Betaine
2
Betaine
2
Total
7.05
Total
7
3)上下颠倒离心管混匀或振荡10至15秒,短暂离心。
4)将反应预混液置于4℃或冰上。
【注意】
●配制反应预混液必须到“Mix配制区”进行,避免扩增子污染。
●移取PEMix或SEMix前,摇晃离心管以彻底混匀。
●使用超纯水配制反应预混液。
●Mix配制区的所有物料,仪器,工具都严禁带到其他区域。
3.5加样
1)Mix配制好之后,将Mix放在传递窗中,回到稀释样品的实验室,将Mix从传递窗中取出,并在“点样区”进行加样。
2)取出96孔国产光学反应板置于基座上。
3)将预先配好地反应预混液加到各反应管孔中,每孔加入9μl反应预混液。
然后按照由A到H、由1到12的顺序向反应孔中加入1μl已稀释的标准品、样品和阴性对照,向标准品反应孔中加入1μl梯度稀释的标准品,每个梯度重复两次;向样品反应孔中加入1μl已稀释的样品,每个样品重复三次;向无模板对照(NTC)反应孔中加入1μl已灭菌超纯水。
4)使用ABI公司配备的封膜工具和光学封口膜(泛特津)封闭反应板。
5)封好膜之后,到荧光定量PCR仪放置的实验室,使用Labnet的MPS-1000微孔板离心机离心反应板,离心时间为4min。
离心前注意配平。
板子放置时,底部朝外。
6)将反应板装载到StepOnePlus扩增仪以准备运行。
3.6设置反应程序
3.6.1双击桌面StepOnesoftwarev2.0软件快捷键。
3.6.2如果有设置好的程序模板,则点击菜单栏的“Open”在“桌面/Q-PCRResults/Q-PCRTemplates”里找到和《Q-PCR实验登记表》上名字相同的程序模板,在ExperimentName栏中用“检测人姓名拼音+检测日期+程序名称”命名,然后根据标准品和点样的顺序设置好板位,输入标准品名称和样品名称,并将设置好的程序保存在“桌面/Q-PCRResults/Q-PCRResults”中以检测日期命名的文件夹中。
3.6.3如果没有程序模板的,则在SetUp列中,单击AdvancedSetup,如图3-1。
图3-1
3.6.3.1在左侧导航窗格中,单击ExperimentProperties:
1)单击ExperimentName,然后输入实验名称,如图3-2所示。
2)单击StepOnePlusTMInstrument(96well)。
3)选择实验方法,单击Quantitation-StandardCurve。
4)根据实验选择试剂类型,单击选择TaqManReagents或SYBRGreenReagents。
5)为升降温速度选择Standard(~2hourstocompletearun),若使用Fast试剂系列则选择Fast(~40minutestocompletearun)。
图3-2
3.6.3.2在左侧导航窗格中,单击PlateSetup:
1)首先设置defineTargetsandSamples,如图3-3所示,在左侧DefineTargets中单击TargetName单元格,然后输入靶名称。
2)从Reporter下拉菜单中,选择FAM或SYBR。
3)从Quencher下拉菜单中,如果Reporter选择SYBR,Quencher则选择None,如果Reporter选择FAM,则Quencher选择NFQ-MGB。
4)保留Color字段中的默认设置。
5)单击SampleName单元格,根据样品个数增加样品数量(可单击AddNewSample)并输入样品名称。
6)保留Color字段中的默认设置。
图3-3
7)单击右侧AssignTargetsandSamples,设置反应板布局,如图3-4。
8)在ViewPlateLayout选择反应孔,在Assigntarget(s)totheselectedwells单击Assign复选框,在Task中选择相应的类型(U表示未知样品,S表示标准品,N表示无模板对照),如果选择S可在Quantity输入相应的标准品浓度。
9)在ViewPlateLayout选择样品反应孔,在AssignSample(s)totheselectedwells单击Assign相应样品的复选框。
图3-4
图3-5
3.6.3.3在左侧导航窗格中,单击RunMethod:
1)单击GraphicalView选项卡(默认)。
2)单击ReactionVolumePerWell,然后输入相应的每个孔的反应体积。
3)单击反应温度或反应时间按需要进行修改,单击延伸阶段反应时间下面的荧光信号采集图标,以确定荧光信号采集的阶段(当图标为灰色时表示未被选中)。
3.6.3.4将设置好的程序保存在“桌面/Q-PCRResults/Q-PCRResults”中以检测日期命名的文件夹中。
3.7运行实验
【健康和安全警告】
操作期间,样本加热块温度可能超过100°C。
在样本加热块降温至室温之前,请勿触碰扩增仪。
1)在RunStatus点击绿色按钮STARTRUN,运行实验。
图3-6
2)实验结束后,取出反应板,用一次性PE手套密封后丢在旁边的垃圾桶内(防止荧光染料污染实验室)。
3.8分析数据
实验结束后,在左侧导航窗格中,单击Analysis:
图3-7
1)单击AmplificationPlot查看扩增曲线,如图3-7所示。
2)单击StandardCurve查看标准曲线的R2值、扩增效率Eff%,如图3-8所示。
图3-8
3)单击右上方ViewWellTable查看Ct值和浓度,如图3-9。
将数据导出到Excel表中,导出方法为:
点击File,选择File菜单中的Export,在弹出的对话框中的ExportProperties中勾选Results,然后根据需要设置ExportFileName和ExportFileLocation。
设置完毕,点击StartExport。
数据导出结束后,在弹出的对话框中选择CloseExportTool。
查看数据,由于标准品的浓度范围为0.1pM-1nM,为保证数据的可信度,应剔除超出标准曲线范围的样品梯度浓度。
样品都已进行稀释,需要按照稀释度换算成原浓度再求平均值。
图3-9
4数据管理和记录管理
本实验要求:
1)在Q-PCR实验登记表上填写相应样品的Q-PCR浓度。
2)在“表单准备区”的计算机桌面上的“文库交接检测”文件夹中的《____文库检测结果》Excel文件中的相应位置填写:
标准品、样品的浓度、检测日期、操作人、鉴定人以及结果(是否合格)。
样品合格与否的评判标准:
①根据上机浓度计算出样品的最低浓度,若样品浓度低于最低浓度则不合格;②将定量出来的Q-PCR浓度与2100的摩尔浓度相比,如果比值和以往相同类型的样品的比值相近则合格,相差较大则不合格,需重新定量,并将需重测文库所在行的底色改为灰色;③如果是Pooling文库,则将Q-PCR浓度与理论浓度相比,如果比值在偏差30%以内则合格,相反则不合格,需重新定量,并将需重测文库所在行的底色改为灰色。
④如重测结果合格,则填写好重测的样品浓度、检测日期、操作人、鉴定人以及结果(是否合格),并将文库信息底色改为“无填充颜色”;如果重测结果仍然和第一次检测结果一致,则在“结果(是否合格)”一栏标注“已重测,可上机”,并将文库信息底色改为“无填充颜色”。
质量评价/质量控制
本实验要求:
1)标准品的和样品的R2值均应在0.995以上,扩增效率Eff%应在80以上.
2)如果是表达谱和SmallRNA文库,要求同一样品的三个孔的CtSD应小于0.5。
3)如果使用的是EvaGreen作为染料,要求meltingcurve没有杂峰。
要求2)和3)可在QCsummary中查看。
参考文献
[1]ABI.AppliedBiosystemsStepOne™Real-TimePCRSystemGettingGuideforStandardCurveExperiments[Z].2007-01.
[2]Meyer,M.,Briggs,AW.,Maricic,T,.etal.Frommicrogramstopicograms:
quantitativePCRreducesthematerialdemandsofhigh-throughputsequencing[J].NucleicAcidsRes,2008,36:
e5.
[3]Heid,C.A.,Stevens,J.,Livak,K.J.,etal.RealtimequantitativePCR[J].GenomeRes,1996,6:
986-994.
附录
1.PEMix和SEMix的组分及其含量
附表1-1PEMix附表1-2SEMix
组分
所需用量(μl)
组分
所需用量(μl)
10×Buffer
1
10×Buffer
1
MgSO4
0.1
MgSO4
0.1
Tween20100×
0.1
Tween20100×
0.1
DMSO
0.5
DMSO
0.5
H2O
3.35
H2O
3.3
Betaine
2
Betaine
2
Total
7.05
Total
7
2.反应体系与反应条件
1)PE、PEIndex文库
附表2-1-1
组分
1次反应所需用量(μl)
PEMix
7.05
dNTP(2.5mM)
0.8
Probe
0.25
ROX
0.2
PEPCRPrimer1.1
0.3
IndexPCRPrimerRR
0.3
EXTaqHS
0.1
Template
1
Total
10
附表2-1-2
50℃
2min
95℃
10sec
95℃
30sec
35cycles
60℃
30sec
72℃
45sec
2)DNA和表观遗传组SE文库
附表2-3-1
组分
1次反应所需用量(μl)
SEMix
7
dNTP(2.5mM)
0.8
EvaGreen
0.5
ROX
0.2
SEPCRPrimer1.1
0.2
SEPCRPrimer2.1
0.2
EXTaqHS
0.1
Template
1
Total
10
附表2-3-2
95℃
10sec
95℃
15sec
35cycles
65℃
30sec
72℃
30sec
Meltcurvestage
3)SmallRNA和表达谱SE文库
附表2-4-1
组分
1次反应所需用量(μl)
SEMix
7
dNTP(2.5mM)
0.8
EvaGreen
0.5
ROX
0.2
SRNAPCRPrimer1.1
0.2
SRNAPCRPrimer2.1
0.2
EXTaqHS
0.1
Template
1
Total
10
附表2-4-2
95℃
10sec
95℃
15sec
35cycles
60℃
30sec
72℃
15sec
Meltcurvestage
附录A修订记录
序号
修订日期
内容摘要
修订人
批准人
1
2010年10月27日
3.4配制反应预混液:
表3-4-1PEMix的配置
表3-4-2SEMix的配置
表3-4-3PEMix
表3-4-4SEMix
附录
1、PEMix和SEMix的组分及其含量:
附表1-1PEMix
附表1-2SEMix
2.反应体系与反应条件
1)PE、PEIndex文库附表2-1-1
3)SmallRNA和表达谱SE文库附表2-4-1
将反应体系调整至10μl
陈敏峰