实验一光学显微镜的使用与微生物观察.docx

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实验一光学显微镜的使用与微生物观察

实验一光学显微镜的使用与微生物观察

第一节普通光学显微镜的使用

一、实验目的

1、了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理.

2、学习并掌握普通光学显微镜,重点是油镜的使用技术和维护知识.

3、在油镜下观察微生物的几种基本形态.

二、基本原理

〔一〕普通光学显微镜的构造

普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成〔图1-1〕.

1、机械系统

机械系统包括镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、调节器等.

〔1〕镜座：

它是显微镜的基座,可使显微镜平稳地放置在平台上.

〔2〕镜臂：

用以支持镜筒,也是移动显微镜时手握的部位.

〔3〕镜筒：

它是连接接目镜〔简称目镜〕和接物镜〔简称物镜〕的金属圆筒.镜筒上端插入目镜,下端与物镜转换器相接.镜筒长度一般固定,通常是160mm.有些显微镜的镜筒长度可以调节.

〔4〕物镜转换器：

它是一个用于安装物镜的圆盘,位于镜筒下端,其上装有3～5个不同放大倍数的物镜.为了使用方便,物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装.转动物镜转换器可以选用合适的物镜.转换物镜时,必须用手旋转圆盘,切勿用手推动物镜,以免松脱物镜而招致损坏.

〔5〕载物台：

载物台又称镜台,是放置标本的地方,呈方形或圆形.载物台上装有压片夹,可以固定被检标本；有标本移动器,转动螺旋可以使标本前后和左右移动.有些标本移动器上刻有标尺,可指示标本的位置,便于重复观察.

〔6〕调节器：

调节器又称调焦装置,由粗调螺旋和细调螺旋组成,用于调节物镜与标本间的距离,使物像更清晰.粗调螺旋转动一圈可使镜筒升降约10mm,细调螺旋转动一圈可使镜筒升降约0.1mm.

图1-1 普通光学显微镜的构造

1.镜座  2.镜臂   3.镜筒    4.转换器   5.载物台  6.压片夹7.标本移动器   8.粗调螺旋   9.细调螺旋  10.目镜11.物镜 12.虹彩光阑〔光圈〕 13.聚光器   14.反光镜

2、光学系统

光学系统包括目镜、物镜、聚光器、反光镜等.

〔1〕目镜：

它的功能是把物镜放大的物像再次放大.目镜一般由两块透镜组成.上面一块称接目透镜,下面一块称场镜.在两块透镜之间或在场镜下方有一光阑.由于光阑的大小决定着视野的大小,故它又称为视野光阑.标本成像于光阑限定的范围之内,在光阑上粘一小段细发可用作指针,指示视野中标本的位置.在进行显微测量时,目镜测微尺被安装在视野光阑上.目镜上刻有5×、10×、15×、20×等放大倍数.可按需选用.

〔2〕物镜：

它的功能是把标本放大,产生物像.物镜可分为低倍镜〔4或10×〕、中倍镜〔20×〕、高倍镜〔40～60×〕和油镜〔100×〕.一般油镜上刻有"OI"〔oilimmersion〕或HI〔homogeneousimmersion〕字样,有时刻有一圈红线或黑线,以示区别.物镜上通常标有放大倍数、数值孔径〔numericalaperture,简写为NA〕、工作距离〔物镜下端至盖玻片间的距离,mm〕与盖玻片厚度等参数〔图1-2〕.以油镜为例,100/1.25分别表示放大倍数为100倍,NA为1.25；160/0.17分别表示镜筒长度160mm,盖玻片厚度等于或小于0.17mm.

图1-2 XSP-I6型显微镜物镜的主要参数

〔3〕聚光器：

聚光器又称聚光镜,它的功能是把平行的光线聚焦于标本上,增强照明度.聚光器安装在镜台下,可上下移动.使用低倍物镜〔简称低倍镜〕时应降低聚光器,使用油镜时则应升高聚光器.聚光器上附有虹彩光阑〔俗称光圈〕,通过调整光阑孔径的大小,可以调节进入物镜光线的强弱〔物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系见图1-3〕.在观察透明标本时,光圈宜调得相对小一些,这样虽会降低分辨力,但可增强反差,便于看清标本.

图1-3 物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系

〔4〕反光镜：

它是普通光学显微镜的取光设备,其功能是采集光线,并将光线射向聚光器.反光镜安装在聚光器下方的镜座上,可以在水平与垂直两个方向上任意旋转.反光镜的一面是凹面镜,另一面是平面镜.一般情况下选用平面镜,光量不足时可换用凹面镜.

〔二〕普通光学显微镜的性能

1、数值孔径

数值孔径〔NA〕又称开口率,是指介质折射率与镜口角1/2正弦的乘积,可用式1-1表示.

〔1-1〕

式中,n为物镜与标本之间介质的折射率,为镜口角〔通过标本的光线延伸到物镜边缘所形成的夹角〔图1-4〕.

物镜的性能与物镜的数值孔径密切相关,数值孔径越大,物镜的性能越好.因为镜口角总是小于180˚,所以sin的最大值不可能超过1.又因为空气的折射率为1,所以以空气为介质的数值孔径不可能大于1,一般为0.05～0.95.根据式1-1,要提高数值孔径,一个有效途径就是提高物镜与标本之间介质的折射率〔图1-5〕.使用香柏油〔折射率为1.515〕浸没物镜〔即油镜〕理论上可将数值孔径提高至1.5左右；实际数值孔径值也可达1.2～1.4.

图1-4 物镜的镜口角　　图1-5介质折射率对光线通路的影响

2、分辨率

分辨率是指分辨物像细微结构的能力.分辨率常用可分辨出的物像两点间的最小距离〔D〕来表征〔式1-2〕.D值愈小,分辨率愈高.

〔1-2〕

式中,λ为光波波长.

比较式1-1和式1-2可知,D可表示为：

〔1-3〕

根据式1-3,在物镜数值孔径不变的条件下,D值的大小与光波波长成正比.要提高物镜的分辨率,可通过两条途径：

①采用短波光源.普通光学显微镜所用的照明光源为可见光,其波长范围为400～700nm.缩短照明光源的波长可以降低D值,提高物镜分辨率.②加大物镜数值孔径.提高镜口角或提高介质折射率n,都能提高物镜分辨率.若用可见光作为光源〔平均波长为550nm〕,并用数值孔径为1.25的油镜来观察标本,能分辨出的两点距离约为0.22μm.

3、放大率

普通光学显微镜利用物镜和目镜两组透镜来放大成像,故又被称为复式显微镜.采用普通光学显微镜观察标本时,标本先被物镜第一次放大,再被目镜第二次放大〔图1-6〕.所谓放大率是指放大物像与原物体的大小之比.因此,显微镜的放大率〔V〕是物镜放大倍数〔V1〕和目镜放大倍数〔V2〕的乘积,即：

V=V1×V2〔1-4〕

如果物镜放大40倍,目镜放大10倍,则显微镜的放大率是400倍.常见物镜〔油镜〕的最高放大倍数为100倍,目镜的最高放大倍数为15倍,因此一般显微镜的最高放大率是1500倍.

图1-6普通光学显微镜的成像原理

4、焦深

一般将焦点所处的像面称为焦平面.在显微镜下观察标本时,焦平面上的物像比较清晰,但除了能看见焦平面上的物像外,还能看见焦平面上面和下面的物像,这两个面之间的距离称为焦深.物镜的焦深与数值孔径和放大率成反比,数值孔径和放大率越大,焦深越小.因此,在使用油镜时需要细心调节,否则物像极易从视野中滑过而不能找到.

三、实验器材

1、仪器显微镜；

2、材料？

标本片,香柏油,二甲苯,擦镜纸.

四、实验程序

〔一〕显微镜〔油镜〕操作

1、领取并检查显微镜：

按学号向实验指导老师领取显微镜,所有实验课均对号使用.从显微镜箱中取出显微镜时,用右手紧握镜臂,左手托住镜座,直立平移〔图1-7〕,轻轻放置在实验台上〔图1-8〕,检查各部件是否齐全,镜头是否清洁,有问题与时报告老师.

图1-7显微镜的搬动图1-8显微镜的放置

光源：

良好的照明是保证显微镜使用效果的重要条件.将低倍镜旋转到工作位置,用粗调螺旋提升镜筒,使镜头距离载物台10mm左右,降低聚光镜的位置,完全打开虹彩光阑,一边看目镜,一边调节反光镜镜面的角度〔在正常情况下,一般用平面反光镜；若自然光线较弱,则可用凹面反光镜〕.然后,调节聚光器的位置〔酌予升降〕,直至视野内得到均匀适宜的亮度.

3、低倍镜观察：

使用低倍镜观察,视野较广,焦深较大,便于搜寻目标,因此宜从低倍镜开始观察.将载玻片标本〔涂面朝上〕置于载物台中央〔图1-9〕,用压片夹固定〔图1-10〕,并将标本部位移到正中,转动粗调螺旋〔图1-11〕,使镜头与标本的距离降到10mm左右.然后,一边看目镜内的视野,一边调节粗调螺旋缓慢升高镜头,至视野内出现物像时,改用细调螺旋〔图1-12〕,继续调节焦距和照明,以获得清晰的物像,并将所需部位移到视野中央,再换中、高倍镜观察〔图1-13〕.

图1-9将载玻片标本置于载物台中央图1-10用压片夹固定载玻片标本

图1-11转动粗调螺旋图1-12转动细调螺旋图1-13转换物镜

4、中、高倍镜观察：

依次用中、高倍镜观察低倍镜下锁定的部位,并随着物镜放大倍数的增加,逐步提升聚光器增强光线亮度.找出所需目标,将其移至视野中央.

5、油镜观察：

将聚光器提升至最高点,转动转换器,移开高倍镜,使高倍镜和油镜成"八"字形,在标本中央滴一小滴香柏油,把油镜镜头浸入香柏油中,微微转动细调螺旋,直至看清物像.如果油镜上升至离开油面还未看清物像,则需重新调节.可从侧面注视,小心地转动粗调节器将油镜重新浸在香柏油中,但不能让油镜压在标本上,更不能用力过猛,击碎玻片,损坏镜头.

6、调换标本：

观察新标本片时,必须重新从第3步开始操作.

7、用后复原：

观察完毕,转动粗调螺旋提升镜筒,取下载玻片,先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油,然后用擦镜纸蘸取少许二甲苯〔香柏油可溶于二甲苯〕擦去镜头上的残留油迹,再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯,最后用细软的绸布擦去机械部件上的灰尘和冷凝水.降低镜筒,将物镜转成"八"字形置于载物台上.降低聚光器,避免聚光器与物镜相碰.使反光镜垂直于镜座,以防受损.将显微镜放回显微镜箱中锁好,并放入指定的显微镜柜内.

第二节微生物形态观察

一、仪器和材料

1、显微镜、擦镜纸、香柏油或液体石蜡、二甲苯.

2、示范片：

大肠杆菌〔杆状〕、小球菌〔球状〕、硫酸盐还原菌〔弧形〕、枯草芽孢杆菌、放线菌、颤藻、鱼腥藻或念珠藻等.

二、试验内容和操作方法

1、严格按照光学显微镜操作方法,依低倍、高倍和油镜的次序观察杆状、球状、弧状和丝状的细菌示范片,用铅笔分别绘出各种细菌的形态图.

2、同法逐个观察放线菌的示范片,分别绘出其形态图.

3、同法逐个观察颤藻、鱼腥藻或念珠藻的示范片,分别绘出其形态图.

问题与思考

1、使用显微镜的油镜时,为什么必须使用镜头油？

2、镜检标本时,为什么先用低倍镜观察,而不直接用高倍镜或油镜观察？

实验二培养基的配制

一、实验目的

1.学习制备培养基的基本技术.

2.制备牛肉膏蛋白琼脂培养基.

二、实验基本原理

培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质,用人工方法配制而成的各种营养基质.培养基为微生物的生长提供营养物质和生存空间.它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件；〔1〕适当组分和比例的营养物质；〔2〕适宜的pH值；〔3〕合适的渗透压；〔4〕保持无菌状态.所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料.培养基的配制是微生物学工作者的主要技术操作之一.

培养基的种类：

根据培养基的组成成分,可将培养基分为三类：

合成培养基：

由各种纯化学物质按一定比例配制而成.

半合成培养基：

由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成.

天然培养基：

利用天然来源的有机物配制而成的.

从培养基的物理状态来分：

液体培养基：

不加凝固剂的液态状培养基.

固体培养基：

在液体培养基中加入2％左右的凝固剂的固体状培养基或固体状农副产品培养基.

半固体培养基：

在液体培养基中加入0.2％-0.5％凝固剂而成的半固体状培养基.

微生物最常用的凝固剂为琼脂〔其次为明胶〕,又叫洋菜、冻粉.它不是一种营养物质,只能被极少数种类的细菌分解利用.琼脂是从海藻中〔主要是石花菜〕提取而制成的.是一种多糖类化合物,主要成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐,琼脂是一种可逆性胶体,在常规浓度下加热到96C以上即成溶胶状态,融化的