植物生理指标最新实验原理与方法.docx

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植物生理指标最新实验原理与方法

1、氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）

2、POD（过氧化物酶）活性的测定——愈创木酚法

3、CAT（过氧化氢酶）测定

4、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定

5、谷胧甘肽还原酶（GR）的活力测定:

6、O2-产生速率的测定

7、过氧化氢（H2O2）含量的测定——碘化钾分光光度法

8、丙二醛（MDA）含量的测定

9、还原型抗坏血酸（ASA）和脱氢抗坏血酸（DHA）的测定

10、谷胱甘肽还原酶测定

11、MDAR（单脱氢抗坏血酸还原酶）活性的测定

12、可溶性总糖的测定

13、考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量

14、叶绿素含量的测定

15、石蜡制片的制作

16、激素Indole-3-AceticAcid（IAA）、AbscisicAcid（ABA）、GA3和ZA的测定

17、cDNA扩增片段长度多态性技术（cDNA-AFLP）

18、3′/5′RACE扩增基因全长

19、根系活力的测定（TTC法）

一氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）

【实验原理】

SOD是含金属辅基的酶。

高等植物含有两种类型的SOD：

Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应：

由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。

并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。

核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。

当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲

月替生成速度减慢。

通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。

反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器

1.分光光度计

2.台式离心机

（二）材料

1.磷酸氢二钠

2.磷酸二氢钠

3.甲硫氨酸

4.EDTA-Na2

5.核黄素

6.氮蓝四唑（NBT）

7.陶瓷小研钵

8.4-5ml离心管

9.10ml玻璃试管

（三）试剂

1.0.05mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH7.8）：

A母液：

0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:

取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；

B母液：

0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：

取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：

分别取A母液（Na2HPO4）228.75ml，B母液（NaH2PO4）21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

2.14.5mM甲硫氨酸溶液：

称取1.0818gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至500ml。

3.3mMEDTA-Na2溶液：

称取0.1117gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

4.60μM核黄素溶液：

称取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

5.2.25mM氮蓝四唑（NBT）溶液：

称取0.092gNBT用PBS定容至50ml，避光保存。

【实验步骤】

1.酶液提取

称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为SOD粗提液。

2.酶活性测定

（1）反应混合液配制（以60个样为准）：

分别取配好的Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液6ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀；

（2）分别取3ml反应混合液和40μl（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加3ml反应混合液和40μlPBS（不加酶液）作为最大光还原管，另1支加3ml反应混合液和40μlPBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。

（3）将试管置于光照培养箱中在4000lux光照25℃下反应20min；

（4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度（OD560）

3.计算结果

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活单位（U），按下式计算活性

n=[（ODmax-OD560）/ODmax]/2

SOD总活性＝[（Ack-AE）×V]/（1/2Ack×W×Vt）

SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量

SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gFW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时的酶液用量（ml）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。

【注意事项】

1.酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；

2.植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。

3.NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。

4.加反应液时最好在暗光下进行；

5.核黄素产生O2.，NBT还原为篮甲潛都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。

光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40μmolm-2s-1，同时使照光时间一样，选择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做）（温度高时照光时间缩短，温度低时延长）；

6.测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50％为佳。

（一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量，即以能抑制反应50％的酶量为一个SOD酶活性单位。

）

（反应液中加酶液与PBS调零差异不大，反应液调零与其它两个则有一定差异。

李合生方法：

2支CK管均以缓冲液代替酶液。

）

【参考文献】

BeauchampC,FridovichI.Superoxidedismutase.Improvedassaysandanassayapplicabletoacrylamidegel.AnalBiochem,1971,44:

276-287.

ZhouW,ZhaoD,LinX.Effectsofwaterloggingonnitrogenaccumulationandalleviationofwaterloggingdamagebyapplicationofnitrogenfertilizerandmixtalolinwinterrape（BrassicanapesL.）.J.PlantGrowthRegul,1997,16,47-53.

二愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定----愈创木酚法

【实验原理】

在过氧化物酶催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。

此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器

1.分光光度计

2.台式离心机

（二）材料

1.磷酸氢二钠

2.磷酸二氢钠

3.2-甲氧基酚

4.30％H2O2

5.陶瓷小研钵

6.2ml离心管

（三）试剂

1.0.2mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）：

A母液：

0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:

取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；

B母液：

0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：

取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.2mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）的配制：

分别取A母液（Na2HPO4）12.3ml和B母液（NaH2PO4）87.7ml混匀即为100mlPBS（0.2M，pH6.0）；

【实验步骤】

1.酶液提取

称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为酶粗提液。

2.酶活性测定

（1）反应混合液的配制：

取50mlPBS（pH6.0，0.2M）缓冲液于烧杯中，加入28μl愈创木酚（2-甲氧基酚）于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解愈创木酚溶解，待溶液冷却后加入19μl30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。

（2）酶活性测定：

取3ml反应液并加入40μl酶液后测定OD470值在40秒的变化。

以PBS代替酶液为对照调零，

3.计算结果

以每minOD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。

，按下式计算活性

POD活性=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）（u/gFW）

ΔA470：

为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g）；t为反应时间（min）；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。

【注意事项】

1.反应液配制时由于愈创木酚难溶，应加热一段时间。

加入H2O2前注意溶液冷却，防止H2O2的挥发。

2.由于该反应迅速，加入酶液要立即进行吸光值的测定。

参考文献

J.L.Muñoz-Muñoz,F.García-Molina,P.A.García-Ruiz,E.Arribas,J.Tudela,F.García-Cánovas,J.N.Rodríguez-López,Enzymaticandchemicaloxidationoftrihydroxylatedphenols,FoodChemistry, Volume113,Issue2, 15March2009,Pages435-444

F.Quintanilla-Guerrero,M.A.Duarte-Vázquez,B.E.García-Almendarez,R.Tinoco,R.Vazquez-Duhalt,C.Regalado,Polyethyleneglycolimprovesphenolremovalbyimmobilizedturnipperoxidase,BioresourceTechnology,Volume99,Issue18,December2008,Pages8605-8611

三CAT（过氧化氢酶）的测定

【实验原理】

过氧化氢酶（Catalase,CAT）,是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶，它能催化H2O2分解为水和氧气,清除组织中的过氧化氢。

H2O2在240nm处有一个吸收高峰,其吸光度与H2O2的含量成正比,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。

单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器

1.分光光度计

2.台式离心机

（二）材料

植物叶片等植物材料

（三）试剂

10.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：

取A母液（Na2HPO4）228.75ml和B母液（NaH2PO4）146.25ml混合后用蒸馏水定容至500ml。

20.3％H2O2:

吸取0.5ml30％的H2O2，用PBS（pH7.0）定容至50ml。

【实验步骤】

1.酶液提取

称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为CAT粗提液。

2酶活性测定

（1）反应混合液的配制：

取100mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.1546ml30%的H2O2摇匀即可。

（2）取2.9ml反应液加入0.1ml酶液，以PBS为对照调零，测定OD240值在40s内的变化。

3结果计算：

酶活性计算：

以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。

CAT=[ΔA240×Vt]/（W×Vs×0.01×t）（u/gFW）

ΔA240：

为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g）；t为反应时间（min）；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。

【注意事项】

H2O2易分解，应现用现配。

【参考文献】

AebiH（1984）Catalaseinvitro.In:

PackerL（ed）Methodsinenzymology.Orlando,FL:

AcademicPress,pp121–126

四抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定

【实验原理】

AsA-POD是叶绿体内专一的清除H2O2的酶，催化抗坏血酸（AsA）与H2O2反应，使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸（MDAsA）。

随着AsA被氧化，溶液的OD290值下降，根据单位时间内OD290的减少值，计算AsA-POD活性。

AsA氧化量按消光系数2.8/（mmol/L）·cm（ε＝2.8mM-1.cm-1）计算，酶活性用µmolAsA·g/FW·h表示。

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器

1.分光光度计

2.台式离心机

（二）材料

1.磷酸氢二钠

2.磷酸二氢钠

3.EDTA-Na2

4.抗坏血酸

5.30%H2O2

6.陶瓷小研钵

7.2ml离心管

（三）试剂

（按50个样计算）：

1.0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）的配制：

母液的配制方法同前取A母液Na2HPO461.0ml，加入B母液NaH2PO439.0ml，用去离子水定容到400ml。

2.0.1mMEDTA-Na2：

取0.0093gEDTA-Na2用PBS（pH7.0）缓冲液定容到250ml（372.24g/M×0.1mM×500ml=0.01861g）；

3.5mMAsA：

取0.044g抗坏血酸用PBS（pH7.0）缓冲液缓冲液定容到50ml（现用现配）；

4.20mMH2O2：

取0.2ml30%H2O2用去离子水稀释到100ml。

【实验步骤】

1.酶液提取方法同SOD.

2.酶活性的测定（以2ml体系测定）

（1）（以2ml体系测定）取0.10ml酶液（可视情况调整），加入1.70ml含0.1mMEDTA-Na2的PBS（0.05mol/L，pH7.0），再加入0.10ml5mM的AsA，最后加入0.10ml20mMH2O2，立即在20℃下测定OD290值在40s内的变化，计算单位时间内AsA减少量和酶活性（室温下测定，以不加H2O2为空白对照调零）。

（2）若以3ml体系测定，则取0.10ml酶液（可视情况调整），加入2.60ml含0.1mMEDTA-Na2的PBS（0.05mol/L，pH7.0），再加入0.15ml5mM的AsA，最后加入0.15ml20mMH2O2，立即在20℃下测定OD290值在40s内的变化

3.酶活性计算

以1min内A290变0.01定义为一个酶活性单位u，酶活性以u/g（FW）表示

APX活性（u/g）=△A290.VT/0.01VS.t.W

△A290表示在290nm处吸光值的变化

VT提取液总体积；VS酶液的体积；W叶片的鲜重；t反应时间

【注意事项】

加入H2O2后应混匀反应液然后快速进行比色测定。

【参考文献】

NakanoY,AsadaK.1981.Hydrogenperoxidescavengedbyascorbate-specificperoxidaseinspinachchloroplasts.PlantCellPhysiol.22,867-880

五GR（谷胱甘肽还原酶）的测定

【实验原理】

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器

1.分光光度计

2.台式离心机

（二）材料

1.叶片或根系

2.GSSG

3.NADPH

4.Hepes

（三）试剂

1.Hepes缓冲液（PH7.8）：

称取Hepes1.9155g,用蒸馏水定容至200ml

2.10mMGSSG：

称取18.3mgGSSG溶于3ml蒸馏水中

3.2.4mMNADPH：

称取4mgNADPH溶于2ml蒸馏水中

【实验步骤】

1.酶液提取

称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为GR粗提液。

2.GR测定

取样品上清液0.1ml（3次重复），放入试管中，加入Hepes1700ul，NADPH100ul及其GSSG100ul在OD340下测定。

【注意事项】

1.酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；

2.植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。

【参考文献】

HongZhu,ZhuoxiaoCao,LiZhang,MichaelA.Trush,YunboLi（2007）Glutathioneandglutathione-linkedenzymesinnormalhumanaorticsmoothmusclecells:

chemicalinducibilityandprotectionagainstreactiveoxygenandnitrogenspecies-inducedinjury.MolCellBiochem301:

47–59.

WheelerCR,SalzmanJA,ElsayedNM,OmayeST,KorteDW（1990）Automatedassaysforsuperoxidedismutase,catalase,glutathioneperoxidase,andglutathionereductaseactivity.AnalBiochem184:

193–199.

六O2-产生速率的测定

【实验原理】

O2-与羟胺反应产生NO2－，NO2－在对氨基苯磺酸和α-萘胺作用下，生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm处有最大光吸收，根据OD530可计算出样品中的O2-的含量。

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器

1.分光光度计

2.台式离心机

（二）材料

1.叶片或根系

2.磷酸氢二钠

3.磷酸二氢钠

4.盐酸羟胺

5.对氨基苯磺酸

6.α-萘胺

7.冰醋酸

（三）试剂

1.0.05mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH7.8）：

A母液：

0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:

取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；

B母液：

0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：

取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：

分别取A母液（Na2HPO4）228.75ml，B母液（NaH2PO4）21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

2.10mM盐酸羟胺：

称取0.05g盐酸羟胺用蒸馏水定容至100ml。

3.17mM对氨基苯磺酸：

称取0.2944g对氨基苯磺酸用冰醋酸溶液（冰醋酸：

水=1：

3）定容至100ml

4.7mMa-萘胺：

称取0.1002g萘胺用冰醋酸溶液（冰醋酸：

水=3：

1）定容至100ml。

【实验步骤】

1.酶液提取

称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶-粗提液。

2.O2-产生速率测定

（1）取0.5ml提取液中加入0.5mlPBS（0.05M，pH7.8），1ml10mM盐酸羟胺溶液后摇匀，同时做一对照管以PBS代替样品提取液；

（2）在25℃下保温1小时，若测定叶片保温后需加入2ml乙醚萃取Chl；

（3）依次先加入1ml17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml7mMα-萘胺，混合后涡旋；

（4）在25℃下保温20min后在3000g离心3min；

（5）以对照管调零,取粉红色水相液测定OD530。

3.计算结果

根据测得的OD530，查NO2-标准曲线得到[NO2-]，依照羟胺与O2-的反应式：

NH2OH＋2O2-＋H+NO2-＋H2O2＋H2O计算[O2-]，即[NO2-]×2=[O2-]。

再根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，求得O2-产生速率（nmolmin-1mg-1蛋白，也可用nmolmin-1g-1鲜重）。

【注意事项】

1.样品中若含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品与羟胺温浴后，加入等体积的乙醚萃取叶绿素，再加入对氨基苯磺酸和α-萘胺作NO2-的显色反应；

2.应用羟胺反应来检测生物材料的含量，必须严格控制反应系统的pH（＜8.0，并尽可能降低反应液中的溶解氧和Fe的含量。

因为羟胺自动氧化随反应系统的pH值升高而加强，同时随反应液的溶解氧和Fe含量的增加而加强。

【参考文献】

DesenKe,GuchouSun,ZhengxunWang（2007）EffectsofsuperoxideradicalsonACCsynthaseactivityinchilling-stressedetiolatedmungbeanseedlings.PlantGrowthRegul51:

83–91.

WangAG,LuoGH（1990）Quantitativerelationbetweenthereactionofhydroxylamineandsuperoxideanionradicalsinplants.PlantPhysiolCommun6:

55–57.

七碘化钾分光光度法测定过氧化氢（H2O2）的含量

【实验原理】

过氧化氢（H2O2）既是一种较强氧化剂，又是一种较弱还原剂。

它存在范围广，化学性质活泼，对生命体代谢、物质结构性能和环境保护等都有影响。

过氧化氢可以与碘化钾发生反应：

H2O2＋2KI→I2＋2KOH

I2通常以I3-的形式存在于水溶液中。

利用I3-在352nm有吸收峰这一原理，用分光光度法测定过氧化氢，方法快速简便，干扰少，仪器普及。

【仪