还原糖和总糖的测定35二硝基水杨酸比色法.docx
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还原糖和总糖的测定35二硝基水杨酸比色法
还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法
一、目的
掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1.实验材料
小麦面粉；精密pH试纸。
2.主要仪器
（1）具塞玻璃刻度试管：
20mL×11
（2）大离心管：
50mL×2
（3）烧杯：
100mL×1
（4）三角瓶：
100mL×1
（5）容量瓶：
100mL×3
（6）刻度吸管：
1mL×1；2mL×2；10mL×1
（7）恒温水浴锅
（8）沸水浴
（9）离心机
（10）扭力天平
（11）分光光度计
3.试剂
（1）1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂
将6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。
（3）碘-碘化钾溶液：
称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。
（4）酚酞指示剂：
称取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。
（5）6MHCl和6MNaOH各100mL。
四、操作步骤
1.制作葡萄糖标准曲线
取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1葡萄糖标准曲线制作
2.样品中还原糖和总糖的测定
（1）还原糖的提取
准确称取3.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。
将浸出液（含沉淀）转移到50mL离心管中，于4000r/min下离心5min,沉淀可用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。
（2）总糖的水解和提取
准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL6MHCl，置沸水浴中加热水解30min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查）。
待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。
将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。
（3）显色和比色
取4支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。
加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。
五、结果与计算：
计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。
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糖的测定方法
核心提示：
对于糖的测定方法有很多，大致可分为三类1.物理法，（1.旋光法, 2.折光法, 3.比重法,）2.物理化学法,（1.点位法
对于糖的测定方法有很多，大致可分为三类
1.物理法，（1.旋光法, 2.折光法, 3.比重法,）
2.物理化学法,（1.点位法,2极普法,3.光度法,4.色谱法）
3.化学方法,（1.斐林氏法.2.高锰酸钾法.3.碘量法.4.铁氰化钾法.5.蒽铜比色法.6.咔唑比色法）
共计三大种，在测定其他碳水化合物时，往往是使其水解为糖再进行测定。
一. 总糖的测定
食品中的总糖主要指具有还原性的葡萄糖，果糖，戊糖，乳糖和在测定条件下能水解为
还原性的单糖的蔗糖（水解后为1分子葡萄糖和1分子果糖），麦芽糖（水解后为2分子葡萄糖）以及可能部分水解的淀粉（水解后为2分子葡萄糖）。
还原糖类之所以具有还原性是由于分子中含有游离的醛基（-CHO）或酮基（=C=O）。
测定总糖的经典化学方法都是以其能被各种试剂氧化为基础的。
这些方法中，以各种根据斐林氏溶液的氧化作用的改进法的应用范围最广。
在这里我们主要给大家介绍铁氰化钾法，蒽铜比色法，斐林氏容量法。
斐林氏容量法由于反应复杂，影响因素较多，所以不如铁氰化钾法准确，但其操作简单迅速，试剂稳定，故被广泛采用。
蒽铜比色法要求比色时糖液浓度在一定范围内，但要求检测液澄清，此外，在大多数情况下，测定要求不包括淀粉和糊精，这就要在测定前将淀粉，糊精去掉，这样就使操作复杂化，限制了其广泛应用。
（一） 铁氰化钾法
1.原理：
样品中原有的和水解后产生的转化糖都具有还原性质，在碱性溶液中能将铁氰化钾还原，根据铁氰化钾的
浓度和检验滴定量可计算出含糖量。
其反应为下：
C6H12O6+6K3[Fe（CN）6]+6KOH→（CHOH）4·（COOH）2+6K4［Fe（CN）6］+4H2O
滴定终了时，稍过量的转化糖即将指示剂次甲基兰还原为无色的隐色体。
2，试剂
1）1％的次甲基兰指示剂
2）盐酸（水解作用）
3）10％和30％的NaOH溶液
4）1％铁氰化钾（贮存特色瓶，临用前标定）
标定步骤
称蔗糖1.0000g→定容500ml→取此液50ml→于100ml容量瓶→加hcl5ml→摇匀→65-70℃水裕15分钟→取出冷却→用30％NaOH中和→加水于刻度→倒入滴定管中→取10ml1％铁氰化钾于锥形瓶中→加10％NaOH2.5ml加12.5ml的水加玻璃珠颗粒→加热至沸→保持一分钟→加次甲基兰1滴→立即以糖液滴足至蓝色退去为止，记录用量。
正式滴定比较滴定时少0.5ml糖液，煮沸1分钟，加指示剂一滴，再用糖液滴定至兰色褪去，计算铁氰化钾溶液的浓度。
A=（W·V）/（1000×0.95）
A：
相当于10ml铁氰化钾溶液的转化糖的量（克）
V：
滴定时消耗的糖液的体积
W：
称取纯蔗糖的量
1000：
稀释比
0.95：
换算等数
3．操作方法
稀释10g→用100ml水作溶液→于250ml容量瓶→加20％醋酸铅10ml→至沉淀完为止→加10ml10％NA2HPO4→至不在产生沉淀为止→加水至刻度→过滤－取滤液50ml→于100ml容量瓶中→按铁氰化钾标定法进行转化，中和及滴定
计算糖含量
总糖（以转化糖计%）=（A×1000）/（W·V）×100
A：
相当于10ml铁氰化钾溶液的转化糖的重量，
W：
样品的重量
V：
滴定时样液消耗的体积
4．实验应注意
（a）达终点时，过量的转化糖将指示剂次甲基兰还原为无色的隐色体，隐色体容量受空气中氧所氧化，很快又变
成指示剂的颜色。
（b）整个过程应在低温电炉上进行，滴定要速度，否则终点不明显
（c）糖与硫酸反应脱水生成羟甲基呋喃甲醛，生产物再与蒽铜缩合成兰色化合物，其颜色深浅与溶液中糖的浓度
成正比，单、双糖等糖类都直接于试剂发生作用，因此不需要水解。
（二）蒽铜的比色法
1.原理：
糖与硫酸反应脱水生成羟甲基呋喃甲醛，生产物再与蒽铜缩合成兰色化合物，其颜色深浅与溶液中糖的浓
度成正比，可比色定量。
2.试剂
（1） 硫酸锌溶液：
溶解500g化学纯硫酸锌于500ml水中
（2） 亚铁氰化钾溶液：
溶解10.6g化学纯亚铁氰化钾于100ml水中
（3） 0.2％蒽铜试剂：
溶解蒽铜0.2g于100ml95％硫酸中，置棕色瓶中冷暗处保存
（4） 0.1％葡萄糖液：
准确称干燥葡萄糖0.1000g定容100ml
3.操作方法
（1） 标准曲线绘制
（2） 100ml容量瓶编号
沸水浴加热6分钟，取出冷却→用1cm比色杯→610nm测定吸光度→作出以吸光度为横坐标，糖液浓度为纵坐标的准
曲线
（3）样品测定
称10g样品→于100ml热水加入500ml容量瓶中－加硫酸锌5ml→沸水浴5分钟→取出再摇动下加亚铁氰化钾5ml，→冷却→定容500ml→过滤→吸滤液25ml→于250ml容量瓶→定容250ml→取稀释液1ml，于比色管中→加10ml蒽铜试剂→摇匀→水浴加热6分钟→冷却→比色
试验注意
1，样液必须清澈透明，加热后不应有蛋白质沉淀
2，样品颜色较深时，可用活性炭脱色后再进行测定
3，此法与所用的硫酸浓度和加热时间有关
4，所取糖液浓度在1-2.5mg/100ml之间
二. 还原糖的测定方法
还原糖包括葡萄糖、果糖、麦芽糖，在葡萄糖分子中含有淤青的醛茎，在果糖分子中含有淤青的酮茎，在乳糖中和
麦芽糖中含有淤青的半缩羧茎，因此都有还原性。
在测定还原糖时一般测定总糖时所有将糖类水解为转化糖再测定
的方法都可用来测定还原糖。
（一）斐林氏容量法
1.此法的原理、试剂、方法与总糖的测定方法相同。
只是样品溶液不必以过转化，而是直接取滤液进行滴定，滤液进行滴定，滤液中的还原糖含量以在0.2-0.5%为好，又能通过增减样品量或改变稀释倍数来调节。
10毫升费林氏A、B液混合时理论上相当还原糖量如下：
葡萄糖（无水）果糖或转化糖尿病 0.0500克
乳糖尿病 0.0678克
麦芽糖 0.0807克
2试剂
（1） 斐林氏A液，称69.8gcp硫酸铜于100ml水中，过滤备用
（2） 斐林氏B液，称34.6g.cp浓流锌钠和100gcpNaOH于1000ml水中，过滤备用
3方法
称取样品10-20g：
制备与转化同铁氰化钾法。
将样液倒入滴管中，吸取A,B液准备预滴定
预滴定：
吸A、B液各5ml→从滴管中加15ml样液→加热至沸→继续滴加样液→至兰色变潜→加3滴次甲基兰→在1分钟内滴定到终点
达到终点时，稍微过量的转化糖，将兰色的次甲基兰染色体还原为无色的隐色体，而显出氧化亚铜的红色，去碱性条件下加热糖的产物是复杂的。
去碱性中断裂是由于碱度不同，加热时间不同，生产不等的碎片，这种碎片给后面滴定带来误差，而且，这种碎片与糖没有化合量的关系，所以，Lanecrol-EynonMethod作出数据检索表
正式滴定：
吸A,B液各5ml→于三角瓶→加比预定量少0.5-1.0ml样液→2分钟内要求沸腾1分钟→加3滴指示剂→用样液滴定兰色消失
总沸腾时间为3分钟，即滴定在3分钟完成。
计算：
还原糖＝（F·V2）/（W·V1）×100
F：
转还糖回数，即与10ml斐林氏试液相当的转化糖毫克数，
V1：
样品试液总体积
V2：
样品试液滴定量
W：
样品重量
在测量乳糖制品时，若蔗糖与乳糖的含量比超过3：
1时，则应与滴定量中加上相关表中（课本中表9-8）校正值后在进行计算
我们举例如下：
如果标准果糖溶液度为每100ml溶液含糖262.5mg。
对于10ml斐林试液从9-5可以查得果糖液滴定应为20ml。
如果不是20ml，可先算出A,B液校正等数。
然后进行计算
再如标准糖溶液浓度为每100ml溶液含糖199.3ml，对于10mlA,B液从9-4中查到，糖液滴定量应为25.00ml，若有出入可校正。
如果要求不高，可省略校正步骤但要求1％得测定误差，则省略校正。
另外有时候并未根据检索表计算样含糖量，但对A,B液进行标定，以使确定相当得还原糖量。
这种误差为0.5％。
下面我们讲标定量A,B液
准确准确称取烘干冷却得A.R蔗糖1.5g→用水溶解称取250ml容量瓶中→定容→吸50ml于100ml定量瓶中→加HCL5ml→再65-70摄氏度水裕15分钟→冷却→用30％NaOH中和→定容
准确吸A,B液各5ml于三角瓶中→加水约50ml玻璃珠三粒→加热至沸→保持1分钟→加指示剂1滴→再煮1分钟→立即用糖液滴定至兰色褪去，红色出现即为终点
正式滴定，先加入比预滴定时少0.5ml左右得糖液煮沸1分钟→加指示剂1滴→再煮沸1分钟→继续滴至终点
计算：
A＝W*V/500×0.95
A：
相当于10ml斐林氏A、B液的转化糖的量
W：
称取蔗糖的质量
V：
滴定蔗糖的量
500：
稀释比
0.95：
换算等数
最后计算：
总糖（还原糖）以转化糖计%=（A*1000/W*V）*100
A：
同上
W：
制取样品的量
V：
滴定是时样品消耗量
1000：
是稀释倍数（100/50*500）
1.预测定的目的：
对样品溶液中还原糖浓度有一定要要求（0.1%左右），测定时样品溶液的消耗体积应该与标定葡萄糖标液的消耗体积相近，通过测定了解样品浓度是否合适，浓度过大或过小应该加以调整，使测定时消耗样品溶液量在10毫升左右；二是通过测定可知道此溶液的大概消耗量，以便在正式的滴定时，预先加入比实际用量少1毫升左右的样液，只留下1ml左右的样液在续滴定时加入，以便保证在1分钟内完成续滴定工作，提交预测定的准确度。
2.此实验影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度、热源强度，煮沸时间和滴定速度一般煮沸时间短消耗糖多，反之，消耗糖液少，滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。
另外溶液碱度愈高，二价铜的还原愈快，因此必须严格控制反应的体积，使反应体系碱度一致。
热源一般采用800W电炉，反应液在2秒内沸腾。
（二）KMNO4（高锰酸钾法）
1．原理，还原糖在碱性溶液中使铜盐还原成氧化亚铜，在酸性条件下，氧化亚铜能使硫酸铁还原为硫酸亚铁，再用KMNO4溶液滴定硫酸亚铁，即可标出还原糖的量。
2.操作方法
（1）样品处理
a.乳糖：
包括乳制品以及含蛋白质的冷食类
称样2-5g（液体样25~50ml）→于250ml容量瓶→加水50ml→加A液10ml+1NNaOH4ml→定容→静置30秒→过滤→弃去初液→可测还原糖及蔗糖用。
b.低酒度饮料：
麦精露、各类汽酒等饮料。
先暴气除CO2→取100ml→于蒸发皿中→用1NNaOH中和→沸水浴蒸至原体积四分之→转入250ml容量瓶→加50ml水→摇匀→（加A液10ml→加1NNaOH4ml）→加水至刻度→静置30秒→过滤。
c.含多量淀粉的食品：
婴儿食品、糕干粉、宝宝乐、代乳粉、饼干、面包、糕点等
称样10-20g→250ml容量瓶→加水200ml→45度水浴加热1小时→不停摇动→冷后加水至刻度→静置→吸出清夜200ml于另一容量瓶（250ml）→加A液10ml+1NNaOH4ml→静置30秒→过滤。
d.汽水、果露、国产七种可乐及可口可乐
处理CO2→吸样液100ml→于250ml容量瓶→加水至刻度→可测还原糖及蔗糖。
（2）测定方法
取50ml处理的样液→于400ml烧杯→加A、B液各25ml→加热在4min左右沸腾→再煮2min→趁热抽滤→用60℃水洗烧杯和沉淀→直到洗液不成碱性→将抽滤的纸（或者石棉）及Cu2O→转入原来烧杯→用25ml硫酸铁溶液冲洗抽滤瓶→使冲洗液全部洗入原烧杯中→加水25ml→使Cu2O溶解→用0.1NKMnO4标液滴定至微红色，同时用50ml水按上述方法做空白实验。
（3）计算
3.注意事项：
（1）煮沸后的溶液显红色不显兰色，则表示糖量高，可减少取样体积。
（2）在洗涤Cu2O的整个过程中应使沉淀上层保持一层水层，以隔绝空气，避免Cu2O被空气中的氧所氧化。
（3）此法适用于各类食品中还原糖的测定，有色样液不受限制，准确度高，重现性好。
准确性和重现性都优于直接滴定法，但操作复杂、费时，需使用特制的高锰酸钾法糖类检索表。
（二）直接滴定法（斐林氏溶液法）
1. 原理
样品经过处理除去蛋白质等杂质后，加入盐酸，在加热条件下使蔗糖水解为还原性单糖，用直接滴定法测定水解后
样品中的还原糖总量。
2.试剂
3.方法
（1） 取过量样品进行提取，放入250ml容量瓶，加5ml醋酸锌和5ML亚铁氰化锌，定容，静止30分后过滤，滤液备用。
（2） 测定
样品预滴定：
取A、B液各5ml于三角瓶中加水10ml，玻璃珠数粒，加热在2分内沸腾，趁热滴定，滴定到兰色褪去，记录用量。
正式滴定：
取A、B液各5mL于三角瓶→加玻璃珠三粒→从滴定管直接加比预滴定时少0.5-1.0ML样液，在2分沸腾，趁热滴定兰
色褪去，记录，取三次平均值计算结果。
三．蔗糖的测定
1．原理：
样品除蛋白质后，其中的蔗糖经盐酸水解转化为还原糖，用还原糖的测定方法，确定样品中蔗糖的含
量。
实际上测定还原糖包括两部分：
一是样品中原有的还原糖、二是蔗糖经酸水解后的还原糖。
2．方法
吸还原糖样品处理稀释液50mL→于100ML容量瓶→加→于68-70度水浴上15分→冷却→加甲基红2滴→中和→定容→
取此溶液按还原糖的测定方法测定。
2．计算
蔗糖%=F（100/V2-100/V1）/（W╳50/250╳1000）╳100╳0.95
式中：
F：
10ml斐林氏试液相当于转化糖的质量mg。
V1：
测定时消耗未经水解的样品稀释体积ml
V2：
测定时消耗经过水解的样品稀释体积ml
w：
原测定还原糖时样品的重量（G）
1000：
将毫升换算成克
0.95：
分子的蔗糖经水解后成为2分子的还原糖（一分子的葡萄糖和一分子的果糖）蔗糖的分子量为342,后来成为2×180.则342/360=0.95.所以转化糖换算到蔗糖应乘以0.95.
四.纸上层析法.
在食品中,糖的组分较为复杂,在淀粉糖浆中含有麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖、麦芽四糖等多种组分.对于这些食品中的各种组分,不可能用化学分析方法进行测定,而用物理分析方法进行测定.
纸层析应用于糖类的分离分析,它利用混合物中各组分物理化学性质的差别,使各组分以不同速度移动而达到分离.
比移值Rf==组分展开的距离/溶剂展开的距离
糖的RF值的规律为:
单糖>双糖>三糖
戊糖>己糖
酮糖>醛糖
实验室常用的展开剂:
正丁醇:
HAc:
H2O==4:
1:
5
常用的显色剂:
0.1NAgNO3:
NH4OH（SN）=1:
1（灵敏度高，但斑点易扩散）
AgNO3/丙酮:
NaOH/乙醇=1:
1（克服上面缺点）
（显色剂书上给出许多,同学们可以自己看）
样品的处理可采用常规法如:
糖的提取和蛋白质的除去可看前面讲的。
根据Rf值可求出各种糖的Rf与标准样品的Rf值进行比较,可确定出糖的种类,也可进行定量,用斑点光密度定量法直接在滤纸上测定.用斑点面积校正进行定量。
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