第三章原核生物分子克隆载体.docx
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第三章原核生物分子克隆载体
第三章分子克隆载体
§3.1质粒载体
质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子（covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA）。
除了酵母的杀伤质粒（Killerplasmid）是RNA质粒外，所有的质粒都是DNA。
但是质粒DNA的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。
质粒DNA分子大小：
小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质；大的可达105KD，两者相差上百倍。
质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系：
一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。
一、质粒的一般特征
1.质粒DNA编码的表型
质粒DNA的分子量较小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为3%，但却编码着重要的遗传性状：
a.抗性特征：
抗菌素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性，以及其它抗性。
b.代谢特征：
抗菌素及细菌素合成；简单的碳水化合物（例如乳糖、蔗糖等）的新陈代谢；复杂碳水化合物（甲苯、苯胺）及卤代化合物的新陈代谢；蛋白质新陈代谢；……
c.修饰寄主生活方式的因子：
大肠杆菌肠毒素的合成；金黄色葡萄球菌剥脱性毒素的合成；
2.质粒DNA的转移
①接合型质粒和非接合型质粒
*接合型质粒（conjugativeplasmid）：
又叫自我转移质粒，具有自我复制基因。
控制细菌配对和质粒接合转移的基因；
*非接合型质粒（non-conjugativeplasmid）：
亦叫不能自我转移的质粒，具有自我复制基因，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此不能够从一个细胞转移到另一个细胞。
②质粒DNA的转移过程
质粒自主转移
质粒的辅助转移
质粒的重组转移
3.质粒DNA的复制类型
根据寄主细胞中所含拷贝数的多少，讲质粒分为：
①低拷贝数质粒——“严紧型”控制的质粒（stringentplasmid）：
每个寄主细胞中仅含有1-3份拷贝；
②高拷贝数质粒——“松弛型”复制控制的质粒（relaxedplasmid）：
每个寄主细胞中可高达10-60份拷贝。
一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对的，它的复制不仅受自身的制约而且还受到寄主的控制
4.质粒的不亲和性
①定义：
是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定共存的现象。
注意：
只有当有确切的证据表明第二种质粒B已经进入含有A质粒的寄主细胞，而且它的DNA不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种细胞却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说A和B是不亲和的质粒。
②不亲和群的概念：
彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群（incompatibilitygroup）。
彼此能够共存的质粒则属于不同的不亲和群。
同一不亲和群的南粒在亲缘关系上则比较接近，以大肠杆菌的质粒为例：
ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不亲和
pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不亲和
p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不亲和
③质粒不亲和性的分子基础
质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的：
*ⅰ.负反馈调节环（negetivefeed-backloop）：
大多数质粒产生可控制质粒复制的阻遏蛋白质，其数量与细胞中质粒拷贝数成正比。
当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。
当质粒处于低拷贝数和低浓度的阻遏蛋白时，其复制活动更会继续时行。
ⅱ.同一个细胞含两种相容质粒，由于亲缘关系远，故它们所产生的阻遏蛋白质就不会互相影响另一个质粒的复制。
于是这两种质粒在同一细胞中都保持着自己的正常拷贝数。
*ⅲ.同一细胞含两种不相容的质粒，亲缘关系密切，它们所产生的阻遏蛋白质不仅影响自身质粒DNA复制，还会彼此影响对方质粒DNA的复制。
这就出现了两种阻遏蛋白质联合调控质粒复制速率。
*ⅳ两种不相容质粒往往拷贝数不相当，其中高拷贝数的对复制抑制剂的敏感性较低拷贝数的要差一些。
因此在复制抑制剂（阻遏蛋白质）浓度低的情况下，高拷贝质粒仍可复制，从而最终使低拷贝质粒被淘汰掉（稀释掉）。
二、质粒DNA的复制与拷贝数的控制
1．ColE1质粒DNA复制调节的机理
许多的质粒载体都是由ColE1质粒派生的。
ColE1质粒的复制是从一个特定的复制起点（ori）开始，并沿着环型DNA单向进行。
RNAI和RNAII这两种分子都是由ColE1DNA转录产生的，是控制ColE1质粒复制的两种关键因素。
由于这两种RNA分子是根据同一区段DNA的正反链合成的，因此两者的序列是彼此互补的。
RNAI是由ColE1质粒的inc基因编码的一种小分子量的RNA分子，它通过干扰RNAII分子的加工而抑制质粒DNA分子的复制。
RNAII也是由ColE质粒DNA编码的另一种小分子量的RNA分子，并在复制起点形成RNA-DNA杂交分子。
RNase是一种核酸内切酶，它切割RNAII分子释放出3-OH作为DNA聚合酶I催化的DNA复制的引物。
所以控制ColE1质粒复制的关键点就是在复制起点形成RNAⅡ-DNA双链分子，而它的关键步骤却是由RNAⅠ控制。
ColE1的复制同样也受一种RNA调节剂Rom的控制，它可以使RNAI和RNAIIII之间的碱基配对作用保持稳定，从而阻止RNAⅡ与模板DNA杂交
2．质粒复制控制的分子模型
目前公认的阐明质粒复制控制机理的分子模型有两个:
自体阻遏蛋白质模型:
核心是阻遏蛋白质的合成受负反馈调节机理调节。
关键论点是：
阻遏蛋白质的合成受负反馈机理调节，而且其浓度是恒定的。
抑制蛋白质稀释模型:
阻遏蛋白质是组成型合成,其浓度同质粒的拷贝数成正比。
关键论点是：
阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。
①抑制蛋白质稀释模型
质粒DNA的复制是受一种由质粒编码的抑制蛋白Cop调控的。
Cop蛋白质的浓度同质粒的拷贝数成正比。
它通过两种途径质粒的复制：
一种是通过同质粒DNA的复制起点（ori）结合，直接抑制质粒复制.另一种是通过阻断起始蛋白质Rep的合成，间接地抑制质粒DNA的合成。
一般认为,单体状态的Cop蛋白质是没有活性的，当处于多体状态时，才具有活性，而这两种蛋白之间的平衡,取决于细胞中抑制蛋白质自身的浓度。
由于细胞在生长过程中体积不断增大，蛋白浓度下降,形成单体形式，失去抑制作用，质粒拷贝数增加。
但由于拷贝数增加抑制蛋白编码基因数目也随之增加到一定程度又导致质粒复制受抑制。
②自体阻遏蛋白质模型
质粒的复制是由起始蛋白Rep引发的,该蛋白是复制启动作用的限速因子.它的浓度决定着每个细胞每个世代的质粒的最终复制总数.Rep蛋白编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因atr是属于同一个操纵子,共转录成同一个mRNA分子.自体阻遏蛋白同启动子-操纵子区（P/O）的结合作用,调节质粒的转录,以维持细胞中Atr和Rep蛋白处于恒定的水平.,而由Atr蛋白调节产生的Rep蛋白,则是通过同复制起点（ori）的结合来引发质粒复制.
另一种解释是Rep蛋白具有双重功能,既具有自体阻遏蛋白的功能,也可同（P/O）的结合抑制转录,又具有起始蛋白功能,引发质粒复制.
三、质粒DNA的分离与纯化
1．氯化铯密度梯度离心法
原理：
由于质粒DNA与染色体DNA在化学结构上并没有什么差别，因此，要使质粒DNA与其寄主染色体DNA区分开来，就必须从两者DNA的高级结构上寻找突破口。
实验表明，在细胞裂解和DNA的分离过程中，大分子量的细胞染色体DNA容易断裂成相应的线性片段，而质粒DNA由于分子量小，结构紧密，因此仍能保持完整的状态。
氯化铯-EtBr密度梯度离心法，就是根据这种寄主染色体DNA与质粒DNA在高级结构上的差别（或说是异质性）而分离纯化的技术。
在氯化铯密度梯度离心中，氯化铯是作为介质其密度为1.7g/cm3，经过一段超速离心平衡之后，便形成了1-1.9052g/cm3的连续的浮力密度梯度。
已知大肠杆菌寄主染色体DNA、质粒DNA、大肠杆菌寄主染色体DNA和RNA等4种大分子物质，具有不同的浮力密度，因此经过超离心平衡之后，便会分布在CsCl连续密度梯度介质的等密度位置上，从而达到了彼此分离的目的。
缺陷：
尽管氯化铯-EtBr密度梯度离心法可以得到高纯度高质量的质粒DNA，但是操作复杂，且需要昂贵的氯化铯和超离心设备，并且溴化乙锭又是极强的致癌物质。
所以目前最流行的分离纯化质粒DNA地方法是碱变性法。
2.碱变性法
原理：
是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当通过致冷或恢复中性pH值，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能准确复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
四、质粒载体的构建及其类型
质粒载体必须具备的条件
a.具有复制起点：
这是质粒增殖所必不可少的条件，亦可帮助维持正常的质粒拷贝数
b.具有抗菌素抗性基因：
提供转化子的选择记号，理想的质粒载体应具两个抗菌素抗性基因。
在外源DNA插入之后，仍应保留一个强选择记号。
c.具有若干种限制酶单一识别位点：
这一特点可满足克隆需求，而且要求在插入了外源DNA片段之后，应不影响质粒DNA的复制功能。
d.具有较小的分子量和较高的拷贝数：
易于操作，而且在插入了外源DNA（一般不超过15Kb）仍可有效地转化受体细胞。
天然质粒用作克隆载体的局限性：
（图）
1.质粒载体选择记号
在基因克隆中采用的质粒载体，大多数都是使用抗菌素抗性记号，一方面是由于许多质粒本身就带有抗菌素抗性基因的抗药性R因子，另一方面因为抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。
下面是克隆中常用的几种抗菌素：
a.氨苄青霉素抗性基因（ampr）
b.氯霉素抗性基因（cmlr）
c.卡那霉素抗生基因（Kanr）
d.链霉素抗性基因（strr）
e.四环素抗性基因（tetr）
2.不同类型的质粒载体（图）
五、重要的大肠杆菌质粒载体
1．pSC101质粒载体
是一种典型的严紧型控制的低拷贝的大肠杆菌质粒载体，是第一个成功地用于在E.coli中克隆真核DNA的大肠杆菌质粒载体：
拷贝数：
1-2个/cell
分子大小：
9.09Kb
抗性表型：
terr
2.pBR322质粒载体（图）
①pBR322质粒载体的构建
pBR322质粒按照标准的质粒载体命名法则命名的.”P”表示它是一种质粒;而”BR”分别取自该质粒的两位主要构建者F.BolivarR.L.Rodriguez姓氏的头一个字母.”322”实验编号,和其他质粒载体pBR325、pBR327相区别。
它是由三个不同来源的部分组成的：
第一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基因（ampr）
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）
第三部分来源于ColE1派生的质粒pMB1的DNA复制起点（ori）
②pBR322质粒载体的优点
具有较小的分子量，不仅易于自身纯化，而且克隆外源片段可高达6kb；
具有两种抗性基因可供作转化子的选择记号用于筛选；
有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累1000~3000个拷贝。
为重组体DNA的制备提供了极大的方便。
③pBR322质粒载体的缺点：
a.pBR322质粒载体虽然失去了迁移蛋白质基因mob，但却保留着这种蛋白质的作用位点bom。
因此在F、ColK和pBR322三种质粒共存的情况下，由ColK质粒产生的迁移蛋白质就会作用于pBR322的bom位点，通过F质粒提供的转移装置而发生迁移作用。
现在已构建了若干种缺失了bom位点的派生质粒。
b.pBR322质粒上的EcoRI位点不会发生插入失活，而EcoRI酶又是基因工程中最常用的一种核酸内切限制酶。
3.pUC质粒载体
pUC是因为它是由美国加利福尼亚大学的科学家J.Messing和J.Vieria于1987年首先构建。
由四个部分组成：
1.来自pBR322质粒的DNA复制起点（ori）
2.氨苄青霉素抗性基因（ampr），但是核酸序列已经发生变化，不含有原先的核酸内切酶的单识别位点
3.大肠杆菌β－半乳糖苷酶（lacZ）的启动子及其编码α－肽链的DNA序列，此结构特称lacZ`基因
4.位于lacZ`基因中的靠近5`－端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它不破坏该基因的功能。
①pUC质粒载体的结构（图）
②pUC质粒载体的优点
a.具有更小的分子量和更高拷贝数。
例如：
pUC8和pUC18分子大小分别为2750bp和2686bp，在未经氯霉素扩增的条件下拷贝数可达500-700个/cell。
b.适于用组织化学方法检测重组体：
pUC质粒载体中的lacZ基因编码的-肽链可能与-互补作用，因此可以用X-gal-IPTG组织化学显色反应方法进一步对重组体转化子克隆进行鉴定。
c.具有多克隆位点MCS区段：
pUC质粒载体中MCS区段与MBmp80噬菌体上的MCS相同，可在这两类载体之间来回穿梭。
4.pGEM-3Z质粒载体
pGEM-3Z是一种和pUC系列十分相似的小分子载体，其总长度2743bp，有一个氨苄青霉素抗性基因（ampr），和一个lacZ`基因，并在其中插入多克隆位点MCS区段。
它与pUC系列的主要区别：
具有两个来自噬菌体的启动子T7和SP6，他们位于一个lacZ`基因多克隆位点MCS区的两侧，故在反应体系中加入纯化的T7和SP6聚合酶，那么外源的基因变化转录出响应的mRNA。
图
六、质粒载体的稳定性问题
克隆有外源基因的质粒载体当其转化到寄主细胞之后会发生一系列的生理变化，影响到自身的稳定性。
a.导致寄主细胞发生变化，例如生长速度下降，形态学特征发生变化等。
b.无质粒的大肠杆菌细胞突变体、质粒拷贝数减少的大肠杆菌细胞突变体、克隆基因无法表达的大肠杆菌突变体产生。
正是由于此类突变体细胞具较快的生长速度，经过持续增殖之后，其数量便会迅速地超过、甚至取代具正常质粒拷贝数的寄主细胞，成为培养物中的优势群体。
质粒不稳定性的类型
结构不稳定性（Structuralinstability）：
由转位作用和重组作用引起的质粒DNA的重排与缺失等突变，是造成质粒不稳定性的一个重要原因。
分离不稳定性（segregationalinstability）：
由质粒不平均的缺陷性分配（defectivepartitioning）所造成的质粒丢失现象，叫做质粒分离的不稳定性。
§3.2噬菌体克隆载体
噬菌体英文名为Bacteriophage，简称phage，来源于希腊文“phages”，系指吞食之意，乃是一类细菌病毒的总称。
来源于希腊文“phagos”，系指吞噬之意，它可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但一旦脱离了寄主细胞，就既不能生长也不能复制。
它在寄主细胞内利用寄主的核糖体、合成蛋白质的因子、各种氨基酸及产能体系，进行生长和增殖。
一.噬菌体的一般生物学特性
对于寄主细胞的依赖性。
保护自己的核酸分子免受环境化学物质的破坏。
将核酸分子注入被感染的细菌细胞。
被感染的细菌细胞变成制造噬菌体的体系，从而产生大量的子代噬菌体颗粒。
使感染的颗粒释放出子代噬菌体。
1.噬菌体的结构及核酸类型
不同种类的噬菌体颗粒，在结构上有很大的差别。
一般来说，可归纳为三种不同的基本类型，无尾部结构的二十面体，具尾部结构的二十面体和线状体。
核酸类型：
最常见的是双链线性DNA、双链环形DNA、单链环形DNA、单链线形DNA、单链RNA。
不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是比较大的。
2.噬菌体的感染性
一个噬菌体颗粒感染一个细菌细胞之后，便可迅速形成数百个子代噬菌体颗粒，而每一个子代颗粒又各能够感染一个新的细菌细胞，在产生数百个子代颗粒，如此只要重复四次感染周期，一个噬菌体颗粒便能够使数十亿个的细菌细胞致死。
3.噬菌体的溶菌生命周期
噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期
只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
①吸附吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上
②注入噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞
③转变被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所
④合成大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质
⑤组装包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒
⑥释放合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
（图）
4.噬菌体的溶源生命周期
溶源生长周期：
是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。
具有这种溶源周期的噬菌体叫温和噬菌体。
温和噬菌体：
既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期。
溶源周期的主要特征：
λ噬菌体和P1噬菌体
λ噬菌体的特征：
①噬菌体的DNA分子注入细菌细胞
②经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭
③噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体
④细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。
图：
溶源周期
二、λ噬菌体载体
λ噬菌体是一种双链DNA噬菌体，基因组约为50kb。
迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，成为λ噬菌体的必要基因；另一部分，当它们被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能，把这部分基因称为λ噬菌体的非必要基因。
这是λ噬菌体赖以发展作为基因克隆载体的一种重要特征。
1.λ噬菌体的结构
*①粘性末端
噬菌体的基因组是由双链DNA组成，其线性分子的两端各有一条由12个核苷酸组成的彼此互补的5单链突出序列，即通常所说的粘性末端。
*②cos位点
注入感染寄主细胞内的DNA线性分子，会迅速环化形成双链DNA分子。
这种由粘性结合形成的特定的双链区段称为cos位点
cos=cohesive-endsite，即粘性末端位点
*③分子长度
噬菌体DNA分子长度为48502bp。
*④结构
为叙述的方便，噬菌体基因组被人为地划分为三个区域：
左侧区——自基因A到基因J，包括参与噬菌体头部蛋白和尾部蛋白合成所需的全部基因；
中间区——介于基因J与基因N之间，又称为非必要区。
该区的编码基因与噬菌斑形成无关，但包括重组相关基因（redA和redB）；整合基因（int），及删除基因（xis）；
右侧区——位于N基因的右侧，包括全部的调控基因，如复制基因（O）和溶菌基因（S及R）。
图：
生物结构
2.λ噬菌体DNA的复制
图
3．噬菌体载体的构建
（1）精简酶切位点
图
（2）加装选择标记
图
（3）噬菌体载体的主要类型
图
①插入型载体：
只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。
这样的派生载体叫插入型载体。
外源DNA克隆到到插入型的载体，会使噬菌体的某种功能丧失效力。
根据插入失活效应的特异性，可分为免疫功能失活和大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活。
免疫功能失活：
图
大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活：
图
②取代型载体：
在两个限制位点之间的DNA片段可以被插入的外源DNA片段所取代，这样的派生载体叫取代型载体。
在其载体中央部分有一个可以被外源插入DNA分子所取代的DNA片段，这是由于在构建此载体时，安排在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉。
，从而提高了克隆外源DNA片段的能力。
（4）-DNA重组分子的体外包装
图
4.λ-DNA作为载体的优点
图
三、柯斯质粒载体
cosmid载体：
也称粘粒、柯斯载体。
这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。
因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。
但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。
1.柯斯质粒的克隆能力及其组成
柯斯质粒的克隆能力可达45kb
柯斯质粒本身分子量较小，典型的是5kb-7kb的环形DNA分子，它由如下4部分组成：
一个质粒的复制起点；
一个或数个选择记号；
大量的限制酶单一识别位点；
一个cos位点（此系包装的必要条件）；
2.柯斯质粒pHC79的构建
图
phage中的cos序列及其控制包装作用的序列；
pBR322中的完整的复制子：
ori、Tetr基因、Ampr基因
3.柯斯质粒载体的特点
（1）具有λ噬菌体的特性：
a.体外包装后可以高效地转导敏感的E.coli细胞；导入细胞后的DNA线性分子可重新环化起来；
（2）具有质粒载体的特性；具有质粒复制子，可在寄主细胞内像质粒DNA一样进行复制；可在氯霉素作用下扩增，有效提高克隆基因的产量；具有抗菌素抗性基因，便于重组体分子的选择。
（3）具有较高容量的克隆能力；
（4）具有与同源性序列的质粒进行重组的能力
四、单链DNA噬菌体载体
M13、f1、fd。
都含有长度6.4kb、彼此具有很高同源性的单链环状的DNA分子。
（以M13噬菌体为例）
优越性：
（1）单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式的DNA简称RFDNA；
（2）不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌；
（3）单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多寡制约的，不存在包装限制问题；
（4）容易测定外源DNA片断的插入取向；
（5）可产生大量纯化的含外源片断的单链DNA分子。
1.M13phage的生物学特性
M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。
这类载体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段。
M13噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长
M13DNA上至少有11个基因
图：
复制过程
2.M13克隆载体
M13和相关寄主菌株如JM101。
由于它们单独均不能产生有功能活性的-半乳糖苷酶，只有当M13phage载体和JM101一类菌株一道才能产生完全的有功能活性的-半乳糖苷酶，而且这种酶还可以用Xgal显色反应测定出来。
当外源基因片段插入到M13克隆载体的lac区段时，便破坏了该载体形成蓝色噬菌斑的能力而易于重组体的选择。
M13载体系列的优点
（1）克隆在M13RFDNA分子上的外源DNA片段，到了子代噬菌体便形成单链形式，故可制备单链DNA
（2）M13载体上有一条饰变的-半乳糖苷酶基因片段，可以与相应寄主产生互补作用，形成有活性的-半乳糖苷酶，故可用蓝白筛选机制筛选重组体分子。
（3）lacZ基因上具有一段多克隆序列，因此便于外源DNA片段的插入与克隆
（4）在M13mp克隆载体上的多克隆位点的顺序是已知的，因此经两种不同限制酶消化的DNA的插入方向，便可判断出来。
3.噬菌体展示技术
原理：
在噬菌体衣壳蛋白基因（GeneⅢ或GeneⅧ）中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。
1985年Smith首次通过基因工程的手段,将外源基因插入丝状噬菌体基因组中,从而使表达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一
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