RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制.docx
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RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制
RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制
【摘要】目的:
应用RNA干扰技术研究针对流感病毒NP或/和PA基因的siRNA抑制NP或/和PA基因的表达及抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.方法:
分别构建针对NP,PA及同时干扰NP和PA的三种siRNA表达质粒pEGFP/NP,pGenesil/PA和pEGFP/NP+PA,转染MDCK后,H5N1亚型流感病毒感染细胞,荧光显微镜判断转染效率,蛋白质印迹和半定量RTPCR检测NP及PA蛋白表达及基因转录水平的变化,并在不同时间点检测细胞培养上清中的血凝值,观察siRNA抑制流感病毒增殖的能力.结果:
荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达%.蛋白质印迹结果表明,重组质粒pEGFP/NP和pEGFP/NP+PA均能抑制NP蛋白在MDCK细胞内的表达,两者的抑制率分别为%和%.半定量RTPCR检测到pEGFP/NP质粒在MDCK细胞内对NP基因的转录抑制率为%;pGenesil/PA质粒对PA基因的转录抑制率为%;pEGFP/NP+PA质粒对NP和PA基因的转录同时抑制率,分别为%和%.而对照质粒pEGFP/HK对NP或/和PA基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用.HA结果表明,三种质粒均能抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖,以pEGFP6/NP+PA的作用最为显着,它们抑制流感病毒增殖的能力分别为%,%和%.结论:
NP或/和PA基因的siRNA质粒可明显抑制NP或/和PA基因的转录和表达,并有效地抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.
【关键词】RNA干扰;正粘病毒科;MDCK细胞株;NP基因;PA基因
0引言
近来,禽流感在世界各地频繁爆发,不仅给养禽业造成了巨大的经济损失[1],也严重威胁到人类的健康[2].高致病性的H5N1亚型是较为严重的一类[3].而现有的、针对HA和NA的流感疫苗在流感病毒新亚型出现时却无能为力[4].我们利用RNA干扰技术(RNAinterference,RNAi)[5],选择在A型流感病毒复制过程中起重要作用的RNA聚合酶PA或/和核蛋白(nucleoprotein,NP)编码基因中的高度保守序列作为siRNA靶序列,将其分别或同时克隆入表达载体,在马丁达比狗肾细胞中,观察诱导PA或NP基因沉寂情况,以期具有更高的抑制效能,为预防与治疗流感寻找一种有效的措施.
1材料和方法
材料pEGFP和pGenesil1载体由武汉晶赛生物技术有限公司提供.限制性核酸内切酶购自NEB公司.连接酶、DNAMarker由Takara公司提供.转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen.兔抗人NP抗体购于晶美生物工程有限公司,βactinmAb及HRP聚合的羊抗兔IgG购自Sigma公司.
方法选用流感病毒A/Pheasant/Shantou/44/2004(H5N1亚型,分离).将病毒接种于10d鸡胚尿囊腔中,置于37℃的孵箱中,于病毒接种后的48h收获尿囊液,冻融、离心后分装贮存于-70℃备用.测定其空斑形成单位及感染复数.据文献[6],结合siRNA序列设计原则,确定PA2087和NP1496各19个单核苷酸作RNA干扰靶序列.正义链:
5'gatccggatcttatttcttcggagttcaagacgctccgaagaaataagatccttttttgaattca3',反义链:
3'gcctagaataaagaagcctcaagttctgcgaggcttctttattctaggaaaaaacttaagttcga5';PA2087,正义链:
5'gatccgcaattgaggagtgcctgattcaagacgtcaggcactcctcaattgcttttttgagctca3',反义链:
3'gcgttaactcctcacggactaagttctgcagtccgtgaggagttaacgaaaaaactcgagttcga5',上述两序列的5'端和3'端分别引入BamHI和HindIII的酶切序列,也在HindIII位点内侧分别引入EcoRI和SacI的酶切位点,以便将两个RNA干扰序列以串连的方式克隆入同一个载体中的两个U6启动子后,即U6promoterNPU6promoterPA,这样可同时产生两个RNA干扰序列.等量的正反义寡核苷酸混合、退火后分别插入经BamHI和HindIII线性化的载体pEGFP和pGenesil1中,得到重组载体pEGFP/NP和pGenesil/PA.两载体经SacI和SalI双酶切后,分别回收载体与片段并连接,构建成新的重组子pEGFP/NP+PA.实验中为了排除siRNA本身的影响,设计了一个与流感病毒基因组序列无关的HK序列作为对照,寡核苷酸片段均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.MDCK细胞株常规培养于含有100mL/LFCS,2mol/L谷胺酰胺、105U/L青霉素和100mg/L链霉素的MEM培养基中,每2~3d进行细胞传代.转染采用LipofectamineTM2000,根据说明书进行操作.分为pEGFP/NP,pGenesil/PA,pEGFP/NP+PA,pEGFP/HK和未转染对照组进行实验.转染后6h更换正常培养基,12h后在荧光显微镜与流式细胞仪下观察EGFP的表达,计算转染效率.细胞转染12h后,经H5N1感染72h,g/L的胰酶消化,收集细胞,提取RNA.在RTPCR反应体系中逆转录引物采用Uni12和PolyT进行,PCR扩增的三对引物,第1对是内源性对照βactin(336~635bp),第2对与第3对是被沉寂的目的基因引物,即H5N1/NP(901~1500bp)和H5N1/PA(708~2207bp).GeneTools软件判定靶基因的沉寂程度.收集转染并经感染的细胞,提取总蛋白,紫外分光光度计法进行蛋白质定量.50μg蛋白质进行120mL/LSDSPAGE,之后转至NC膜上.NP抗体的浓度为1∶400,二抗为1∶3000,辣根过氧化物酶/LumiGLO化学发光法进行Western检测.GeneTools软件判定靶蛋白表达的沉寂程度.转染12h后,去除培养基,以MOI为的剂量感染H5N1病毒,于35℃,50mL/LCO2孵箱中吸附1h后,加入5mL的感染性培养基于37℃,50mL/LCO2孵箱中培养,于不同的时间测定细胞培养上清的血凝值.病毒抑制率采用公式[1(HAtest/HAcontrol)]×100进行计算[11].
2结果
siRNA表达载体及其多克隆位点如图1A和图1B所示.重组载体pEGFP/NP+PA如图1C所示,两个小发夹RNA的产生见图2.pEGFP/NP采用EcoRI进行酶切鉴定,酶切后产生一个大约400bp的片段.pGenesil/PA采用SacI进行单酶切鉴定,如图3A.pEGFP/NP+PA重组体采用BamHI酶切鉴定,酶切后可得到约400bp的片段,与预期结果相同(图3B).荧光显微镜检测表明,除对照组呈阴性外,pEGFP/HK,pEGFP/NP,/PA或pEGFP/NP+PA实验组在转染12h后均可见荧光蛋白表达,48~72h达高峰.流式细胞仪分析,EGFP阳性细胞达%.
A:
pEGFP;B:
pGenesil;C:
pEGFP/NP+PA.
图1siRNA表达质粒图谱
转染细胞中NP和PAmRNA的检测各实验组βactin基因片段条带的亮度强弱相似,表明模板量一致.未转染组与pEGFP/HK组细胞在病毒感染后,NP或PA基因扩增带亮度较强,而pEGFP/NP,/PA或pEGFP/NP+PA组的NP或/和PA基因扩增带亮度明显减弱,表明3种重组质粒在mRNA水平上抑制病毒NP或/和PA基因的转录,pEGFP/HK对靶基因的mRNA没有抑制作用,提示siRNA抑制靶基因转录有特异性.以对照组NP或PA扩增条带为标准(亮度定为100),GeneTools软件分析结果显示,pEGFP/HK组的NP或PA是对照组的%和100%;pEGFP/NP组NP,PA基因扩增条带分别是对照组的%和%;/PA组NP,PA基因的扩增条带分别是对照组的%和%;pEGFP/NP+PA组的NP或PA扩增条带强度分别是对照组的%和%(图5).
转染细胞中NP蛋白的检测对照组与pEGFP/HK组的NP蛋白杂交带明显强于pEGFP/NP组或pEGFP/NP+PA组,其中pEGFP/NP+PA组的NP杂交带更弱.GeneTools软件分析结果所示,以对照组的NP蛋白带为标准,pEGFP/HK,pEGFP/NP或pEGFP/NP+PA组的条带强度分别是对照组的%,%和%,表明干扰序列可以特异地抑制流感病毒蛋白的表达.
A:
表达质粒转录后,形成的发夹样结构;B:
shRNA经dicer酶剪切后,特异性地结合到流感病毒基因组NA或PA节段上.
图2流感病毒NP或PA的shRNA
或PA特异性siRNA抑制流感病毒在MDCK细胞的增殖各实验组于转染12h后分别利用MOI为的H5N1流感病毒攻击,于感染后不同时间测得的HA值(表1).可以看出,对照组和pEGFP/HK组的病毒滴度随着病毒作用的时间延长而增高,在48~72h达到高峰,HA值均达到512,表明非特异的siRNA不会影响病毒的增殖.pEGFP/NP或/PA组在病毒滴度的高峰时间,即48~72h的HA值仅为64和128,以后随时间的延长并没有升高,表明pEGFP/NP或/PA在一定程度上能够抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖,且pEGFP/NP的抑病毒能力好于/PA.在pEGFP/NP+PA组培养上清中,随病毒感染时间的延长未见到HA值明显升高,感染72h后HA值仅为4.pEGFP/NP,/PA和pEGFP/NP+PA三者抑制病毒增值率分别为87%,75%和%.
A:
pEGFP/NP和/PA的酶切结果.M:
标准分子量DL2000;1:
pEGFP/NP;2:
pEGFP/NP经EcoRI酶切后可以获得一个约400bp的片段;3:
/PA;4:
/PA经SacI的酶切结果.B:
pEGFP/NP+PA的酶切鉴定.M:
标准分子量DL2000;1,3:
不同克隆的pEGFP/NP+PA;2,4:
pEGFP/NP+PA经BamHI酶切后,可以获得400bp的片段.
图3siRNA表达质粒的限制性内切酶鉴定
A:
pEGFP/NP转染MDCK细胞×100;B:
pEGFP/NP+PA转染MDCK细胞×400;C:
阴性对照×100.
图4荧光显微镜检测质粒转染效率
βactin作为内参照,1:
pEGFP/NP+PA;2:
/PA;3:
pEGFP/NP;4:
pEGFP/HK;5:
感染的MDCK细胞;6:
MDCK细胞;M:
标准分子量DL2000.
图5半定量RTPCR法分析NP和PAmRNA的沉寂结果
1:
H5N1感染的MDCK;2:
pEGFP/NP组;3:
pEGFP/NP+PA组;4:
pEGFP/HK组.
图6WesternBlot分析NP和PA蛋白表达抑制情况
表1特异性siRNA对流感病毒增殖情况的影响
HK:
siRNA阴性对照序列;NP:
流感病毒核蛋白;PA:
流感病毒RNA聚合酶酸性蛋白亚单位.
3讨论
流感病毒是节段性、单股负链RNA病毒,基因组RNA在复制过程中高达10-4的错配率及机体免疫和药物治疗的选择压力,使病毒不断地变异与进化[7],是造成流感流行与爆发的重要因素.流感病毒RNA的转录、复制依赖于NP和3种RNA依赖的RNA聚合酶(RdRps),即PB1,PB2和PA共同组成的核糖核蛋白酶复合体.NP与其他聚合酶蛋白共同调节病毒RNA转录与合成间的转换NP也可以防止RNA合成中断,有利于RNA链的延伸[8].PA是RNA依赖的RNA聚合酶亚单位之一,是RNA复制的基础.如果PA的含量降低,RNA片段的转录与复制可能会被阻断,流感病毒的增殖则会受到抑制[9].由此看来,NP或PA基因是阻断流感病毒增殖的理想靶基因片段.RNAi是目前最有效的基因沉寂技术.新近的研究表明,siRNA可通过沉寂同源的病毒基因或沉寂与病毒复制有关的宿主基因,使病毒在感染的不同时期受到抑制,且很少出现副作用,是一个潜在的、强有力的抗病毒武器,在抗HIV的实验研究中已经显示出较好的作用,表明RNA沉寂用于抗病毒治疗有良好的前景.
为了更有效地抑制流感病毒的转录与复制,我们构建了干扰流感病毒NP或/和PA的siRNA表达质粒,避免了同一细胞转染多个质粒难度大、效率低的困难.结果表明,三种重组质粒pEGFP/NP,/PA和pEGFP/NP+PA都能不同程度地抑制目的基因NP或/和PA的RNA转录水平及蛋白表达,而pEGFP/HK对NP或PA基因无抑制作用,提示pEGFP/NP,/PA和pEGFP/NP+PA抑制目的基因的特异性.更为重要的是,HA结果表明,在分别转染pEGFP/NP,/PA或pEGFP/NP+PA的MDCK细胞中,流感病毒的增殖受到了不同程度的抑制,以pEGFP/NP+PA的效果更佳.本研究为进一步体内实验奠定了基础.
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