RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制.docx
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RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制
RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制
【摘要】目的：
应用RNA干扰技术研究针对流感病毒NP或/和PA基因的siRNA抑制NP或/和PA基因的表达及抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.方法：
分别构建针对NP，PA及同时干扰NP和PA的三种siRNA表达质粒pEGFP/NP，pGenesil/PA和pEGFP/NP+PA，转染MDCK后，H5N1亚型流感病毒感染细胞，荧光显微镜判断转染效率，蛋白质印迹和半定量RTPCR检测NP及PA蛋白表达及基因转录水平的变化，并在不同时间点检测细胞培养上清中的血凝值，观察siRNA抑制流感病毒增殖的能力.结果：
荧光显微镜结果表明，重组质粒转染效率达%.蛋白质印迹结果表明，重组质粒pEGFP/NP和pEGFP/NP+PA均能抑制NP蛋白在MDCK细胞内的表达，两者的抑制率分别为%和%.半定量RTPCR检测到pEGFP/NP质粒在MDCK细胞内对NP基因的转录抑制率为%；pGenesil/PA质粒对PA基因的转录抑制率为%；pEGFP/NP+PA质粒对NP和PA基因的转录同时抑制率，分别为%和%.而对照质粒pEGFP/HK对NP或/和PA基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用.HA结果表明，三种质粒均能抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖，以pEGFP6/NP+PA的作用最为显着，它们抑制流感病毒增殖的能力分别为%，%和%.结论：
NP或/和PA基因的siRNA质粒可明显抑制NP或/和PA基因的转录和表达，并有效地抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.
【关键词】RNA干扰；正粘病毒科；MDCK细胞株；NP基因；PA基因
0引言
近来，禽流感在世界各地频繁爆发，不仅给养禽业造成了巨大的经济损失［1］，也严重威胁到人类的健康［2］.高致病性的H5N1亚型是较为严重的一类［3］.而现有的、针对HA和NA的流感疫苗在流感病毒新亚型出现时却无能为力［4］.我们利用RNA干扰技术（RNAinterference,RNAi）［5］，选择在A型流感病毒复制过程中起重要作用的RNA聚合酶PA或/和核蛋白（nucleoprotein，NP）编码基因中的高度保守序列作为siRNA靶序列，将其分别或同时克隆入表达载体，在马丁达比狗肾细胞中，观察诱导PA或NP基因沉寂情况，以期具有更高的抑制效能，为预防与治疗流感寻找一种有效的措施.
1材料和方法
材料pEGFP和pGenesil1载体由武汉晶赛生物技术有限公司提供.限制性核酸内切酶购自NEB公司.连接酶、DNAMarker由Takara公司提供.转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen.兔抗人NP抗体购于晶美生物工程有限公司，βactinmAb及HRP聚合的羊抗兔IgG购自Sigma公司.
方法选用流感病毒A/Pheasant/Shantou/44/2004（H5N1亚型，分离）.将病毒接种于10d鸡胚尿囊腔中，置于37℃的孵箱中，于病毒接种后的48h收获尿囊液，冻融、离心后分装贮存于-70℃备用.测定其空斑形成单位及感染复数.据文献［6］，结合siRNA序列设计原则，确定PA2087和NP1496各19个单核苷酸作RNA干扰靶序列.正义链：
5＇gatccggatcttatttcttcggagttcaagacgctccgaagaaataagatccttttttgaattca3＇，反义链：
3＇gcctagaataaagaagcctcaagttctgcgaggcttctttattctaggaaaaaacttaagttcga5＇;PA2087，正义链：
5＇gatccgcaattgaggagtgcctgattcaagacgtcaggcactcctcaattgcttttttgagctca3＇，反义链：
3＇gcgttaactcctcacggactaagttctgcagtccgtgaggagttaacgaaaaaactcgagttcga5＇，上述两序列的5＇端和3＇端分别引入BamHI和HindIII的酶切序列，也在HindIII位点内侧分别引入EcoRI和SacI的酶切位点，以便将两个RNA干扰序列以串连的方式克隆入同一个载体中的两个U6启动子后，即U6promoterNPU6promoterPA，这样可同时产生两个RNA干扰序列.等量的正反义寡核苷酸混合、退火后分别插入经BamHI和HindIII线性化的载体pEGFP和pGenesil1中，得到重组载体pEGFP/NP和pGenesil/PA.两载体经SacI和SalI双酶切后，分别回收载体与片段并连接，构建成新的重组子pEGFP/NP＋PA.实验中为了排除siRNA本身的影响，设计了一个与流感病毒基因组序列无关的HK序列作为对照，寡核苷酸片段均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.MDCK细胞株常规培养于含有100mL/LFCS,2mol/L谷胺酰胺、105U/L青霉素和100mg/L链霉素的MEM培养基中，每2～3d进行细胞传代.转染采用LipofectamineTM2000，根据说明书进行操作.分为pEGFP/NP,pGenesil/PA,pEGFP/NP+PA,pEGFP/HK和未转染对照组进行实验.转染后6h更换正常培养基，12h后在荧光显微镜与流式细胞仪下观察EGFP的表达，计算转染效率.细胞转染12h后，经H5N1感染72h，g/L的胰酶消化，收集细胞，提取RNA.在RTPCR反应体系中逆转录引物采用Uni12和PolyT进行，PCR扩增的三对引物,第1对是内源性对照βactin（336～635bp），第2对与第3对是被沉寂的目的基因引物，即H5N1/NP（901～1500bp）和H5N1/PA（708～2207bp）.GeneTools软件判定靶基因的沉寂程度.收集转染并经感染的细胞，提取总蛋白，紫外分光光度计法进行蛋白质定量.50μg蛋白质进行120mL/LSDSPAGE，之后转至NC膜上.NP抗体的浓度为1∶400，二抗为1∶3000，辣根过氧化物酶/LumiGLO化学发光法进行Western检测.GeneTools软件判定靶蛋白表达的沉寂程度.转染12h后，去除培养基，以MOI为的剂量感染H5N1病毒，于35℃,50mL/LCO2孵箱中吸附1h后，加入5mL的感染性培养基于37℃,50mL/LCO2孵箱中培养，于不同的时间测定细胞培养上清的血凝值.病毒抑制率采用公式［1（HAtest/HAcontrol）］×100进行计算［11］.
2结果
siRNA表达载体及其多克隆位点如图1A和图1B所示.重组载体pEGFP/NP＋PA如图1C所示，两个小发夹RNA的产生见图2.pEGFP/NP采用EcoRI进行酶切鉴定，酶切后产生一个大约400bp的片段.pGenesil/PA采用SacI进行单酶切鉴定，如图3A.pEGFP/NP＋PA重组体采用BamHI酶切鉴定，酶切后可得到约400bp的片段，与预期结果相同（图3B）.荧光显微镜检测表明，除对照组呈阴性外，pEGFP/HK,pEGFP/NP，/PA或pEGFP/NP+PA实验组在转染12h后均可见荧光蛋白表达，48～72h达高峰.流式细胞仪分析，EGFP阳性细胞达%.
A:
pEGFP;B:
pGenesil;C:
pEGFP/NP＋PA.
图1siRNA表达质粒图谱
转染细胞中NP和PAmRNA的检测各实验组βactin基因片段条带的亮度强弱相似，表明模板量一致.未转染组与pEGFP/HK组细胞在病毒感染后，NP或PA基因扩增带亮度较强，而pEGFP/NP,/PA或pEGFP/NP+PA组的NP或/和PA基因扩增带亮度明显减弱，表明3种重组质粒在mRNA水平上抑制病毒NP或/和PA基因的转录，pEGFP/HK对靶基因的mRNA没有抑制作用，提示siRNA抑制靶基因转录有特异性.以对照组NP或PA扩增条带为标准（亮度定为100），GeneTools软件分析结果显示，pEGFP/HK组的NP或PA是对照组的%和100%；pEGFP/NP组NP,PA基因扩增条带分别是对照组的%和%；/PA组NP,PA基因的扩增条带分别是对照组的%和%;pEGFP/NP+PA组的NP或PA扩增条带强度分别是对照组的%和%（图5）.
转染细胞中NP蛋白的检测对照组与pEGFP/HK组的NP蛋白杂交带明显强于pEGFP/NP组或pEGFP/NP+PA组，其中pEGFP/NP+PA组的NP杂交带更弱.GeneTools软件分析结果所示，以对照组的NP蛋白带为标准，pEGFP/HK,pEGFP/NP或pEGFP/NP+PA组的条带强度分别是对照组的%,%和%,表明干扰序列可以特异地抑制流感病毒蛋白的表达.
A：
表达质粒转录后，形成的发夹样结构；B：
shRNA经dicer酶剪切后，特异性地结合到流感病毒基因组NA或PA节段上.
图2流感病毒NP或PA的shRNA
或PA特异性siRNA抑制流感病毒在MDCK细胞的增殖各实验组于转染12h后分别利用MOI为的H5N1流感病毒攻击，于感染后不同时间测得的HA值（表1）.可以看出，对照组和pEGFP/HK组的病毒滴度随着病毒作用的时间延长而增高，在48～72h达到高峰，HA值均达到512，表明非特异的siRNA不会影响病毒的增殖.pEGFP/NP或/PA组在病毒滴度的高峰时间，即48～72h的HA值仅为64和128，以后随时间的延长并没有升高，表明pEGFP/NP或/PA在一定程度上能够抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖，且pEGFP/NP的抑病毒能力好于/PA.在pEGFP/NP+PA组培养上清中，随病毒感染时间的延长未见到HA值明显升高，感染72h后HA值仅为4.pEGFP/NP，/PA和pEGFP/NP+PA三者抑制病毒增值率分别为87%，75%和%.
A：
pEGFP/NP和/PA的酶切结果.M：
标准分子量DL2000;1:
pEGFP/NP;2:
pEGFP/NP经EcoRI酶切后可以获得一个约400bp的片段;3:
/PA;4:
/PA经SacI的酶切结果.B:
pEGFP/NP+PA的酶切鉴定.M：
标准分子量DL2000;1,3:
不同克隆的pEGFP/NP+PA;2,4:
pEGFP/NP+PA经BamHI酶切后，可以获得400bp的片段.
图3siRNA表达质粒的限制性内切酶鉴定
A:
pEGFP/NP转染MDCK细胞×100;B:
pEGFP/NP+PA转染MDCK细胞×400;C:
阴性对照×100.
图4荧光显微镜检测质粒转染效率
βactin作为内参照，1:
pEGFP/NP+PA;2:
/PA;3:
pEGFP/NP;4:
pEGFP/HK;5:
感染的MDCK细胞;6:
MDCK细胞;M:
标准分子量DL2000.
图5半定量RTPCR法分析NP和PAmRNA的沉寂结果
1:
H5N1感染的MDCK;2:
pEGFP/NP组;3:
pEGFP/NP+PA组;4:
pEGFP/HK组.
图6WesternBlot分析NP和PA蛋白表达抑制情况
表1特异性siRNA对流感病毒增殖情况的影响
HK:
siRNA阴性对照序列;NP:
流感病毒核蛋白;PA:
流感病毒RNA聚合酶酸性蛋白亚单位.
3讨论
流感病毒是节段性、单股负链RNA病毒，基因组RNA在复制过程中高达10-4的错配率及机体免疫和药物治疗的选择压力，使病毒不断地变异与进化［7］，是造成流感流行与爆发的重要因素.流感病毒RNA的转录、复制依赖于NP和3种RNA依赖的RNA聚合酶（RdRps），即PB1，PB2和PA共同组成的核糖核蛋白酶复合体.NP与其他聚合酶蛋白共同调节病毒RNA转录与合成间的转换NP也可以防止RNA合成中断，有利于RNA链的延伸［8］.PA是RNA依赖的RNA聚合酶亚单位之一，是RNA复制的基础.如果PA的含量降低，RNA片段的转录与复制可能会被阻断，流感病毒的增殖则会受到抑制［9］.由此看来，NP或PA基因是阻断流感病毒增殖的理想靶基因片段.RNAi是目前最有效的基因沉寂技术.新近的研究表明，siRNA可通过沉寂同源的病毒基因或沉寂与病毒复制有关的宿主基因，使病毒在感染的不同时期受到抑制，且很少出现副作用，是一个潜在的、强有力的抗病毒武器，在抗HIV的实验研究中已经显示出较好的作用，表明RNA沉寂用于抗病毒治疗有良好的前景.
为了更有效地抑制流感病毒的转录与复制，我们构建了干扰流感病毒NP或/和PA的siRNA表达质粒，避免了同一细胞转染多个质粒难度大、效率低的困难.结果表明，三种重组质粒pEGFP/NP,/PA和pEGFP/NP+PA都能不同程度地抑制目的基因NP或/和PA的RNA转录水平及蛋白表达，而pEGFP/HK对NP或PA基因无抑制作用，提示pEGFP/NP,/PA和pEGFP/NP+PA抑制目的基因的特异性.更为重要的是，HA结果表明，在分别转染pEGFP/NP,/PA或pEGFP/NP+PA的MDCK细胞中，流感病毒的增殖受到了不同程度的抑制，以pEGFP/NP+PA的效果更佳.本研究为进一步体内实验奠定了基础.
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