微生物系列实验报告.docx
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微生物系列实验报告
微生物工程综合性大实验
实验内容
实验一谷氨酸发酵系列实验
实验二青霉素发酵系列实验
实验三啤酒发酵系列实验
实验四酸奶发酵系列实验
实验一谷氨酸的发酵系列实验
（一）谷氨酸菌种的制备
一、实验目的
了解发酵工业菌种制备工艺和质量的控制，为发酵实验准备菌种。
二、实验原理
菌种制备的主要是尽可能培养出高活性能满足大规模发酵需要的纯种，主要纺纱方式为：
分离纯化和扩大培养。
一般2个月分离纯化一次，分两步进行。
①平板稀释法分离出单细胞菌落；②挑取若干单细胞菌落接种于试管斜面培养基，然后把这些菌株分别用三角瓶进行药瓶发酵实验，比较各菌株产酸的高低，选择产酸高的菌株供生产用。
三、实验材料、仪器与试剂
材料谷氨酸棒杆菌
仪器试管；三角瓶；烧杯；量筒；玻棒；PH试纸（PH5.5～9.0）；天平；立式高压蒸汽灭菌锅；培养箱；显微镜等
试剂无水乙醇；牛肉膏；葡萄糖；蛋白胨；可溶性淀粉；胰蛋白胨；酵母提取物；NaCl;5mol/LNaOH;1mol/LHCl;KNO3;K2HPO4﹒H2O;MgSO4·7H2O;
MnSO4·H2O。
四、实验步骤
（一）培养基的制备
1）平板培养基
葡萄糖0.1%；蛋白胨1%；牛肉膏1%；NaCI0.5%；琼脂2%（pH=7.0）
配置50ml培养基，灭菌后倒2个平板。
2）一级种子培养基
蛋白胨1%；酵母浸出粉0.5%；NaCI1%；（pH=7.0）
用三角瓶配置100ml，高压灭菌20min。
3）二级种子培养基
葡萄糖2.5%；尿素0.34%；3水磷酸氢二钾0.16%；7水硫酸镁0.043%；7水硫酸哑铁0.0002%；1水硫酸锰0.0002%（pH=7.0）
用三角瓶配置100ml，高压灭菌20min。
（二）菌种的制备
1）用平板稀释法在平板培养基进行画线，分离出单细胞菌落；
2）用接种环挑取若干个单细胞菌落接到一级种子培养基，置于控温摇床200r/min，振荡培养12h，温度为32℃。
3）取10ml一级种子培养基接到二级种子培养基中，置于控温摇床200r/min，振荡培养12h，温度为33-34℃。
附：
二级种子质量要求
1）pH在7.2左右；
2）残糖量在1.5%以下，其他同一级种子；
3）OD值净增加>0.6。
（二）谷氨酸发酵及控制
一、实验目的
了解发酵罐的操作，完成谷氨酸发酵的全过程操作。
二、实验原理
培养基、温度、pH值、通风、搅拌、泡沫等因素会对发酵过程产生重要影响，因此对重要的参数进行控制是顺利进行发酵的前提和保证。
根据发酵菌种对温度、pH值的要求不同，因此在发酵过程中要采取不同的温度和pH，以使发酵过程能够顺利进行，从而达到预期的目标。
适当的溶氧对微生物菌株的发酵过程具有重要的影响，保证一定的溶氧就必须对通风量及搅拌转速进行适当的调节。
三、实验材料、仪器与试剂
材料：
谷氨酸发酵二级种子培养液；发酵培养基；谷氨酸发酵液不同发酵时间所取样品；谷氨酸发酵液。
仪器：
蒸汽发生器；发酵罐及控制系统；空气压缩机；补料瓶；补料针；硅胶管；滴定管；滴定管架；电炉；烧杯；1000mL容量瓶、150mL锥形瓶；高速离心机；分光光度计；恒温水浴锅；三角瓶；小试管；烧杯；玻棒等。
试剂：
无水乙醇；葡萄糖；硫酸镁；磷酸氢二钾；氢氧化钾；糖蜜；硫酸亚铁；硫酸锰；尿素、消泡剂；去离子水；硫酸铜；亚甲基蓝；酒石硫钾钠；氢氧化钠；亚铁氢化钾；盐酸；L-谷氨酸分析纯；茚三酮；丙酮；酒精等。
四、实验步骤
（一）谷氨酸的中糖发酵及控制
1清洗发酵罐，配制好5L发酵培养基，灭过菌的400ml40%尿素及400ml消泡剂；
2对发酵罐进行空消；
3加入5L的发酵培养基，对发酵罐进行实消；
4在接种槽中加好酒精并点燃，把二级种子培养基从接种口倒进发酵罐中进行发酵；
5对谷氨酸发酵过程中各项指标进行测定及控制。
◆温度的控制
◆溶氧量的控制
◆通气量的控制
◆OD值的测定直接用分光光度计，在波长600nm下测得OD值；
◆pH值的测定用pH试纸进行测定，pH要控制在7.1-8.2这个范围内；
◆谷氨酸含量的测定
◆还原糖含量的测定
（二）谷氨酸发酵过程还原糖含量的测定
a试剂配制（斐林试剂）
甲液：
五水硫酸铜3.5g，亚甲基蓝0.005g，用水溶解并稀释至100ml；
乙液：
酒石酸钾钠11.7g，氢氧化钠12.64g，亚铁氢化钾0.94g，用水溶解并稀释至100ml；
0.1%标准葡萄糖溶液：
取葡萄糖1g，用少量水溶解，转至1000ml容量瓶中，加入5ml盐酸，用水稀释定容至1000ml，摇匀；
b斐林试剂的标定
甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加水10ml，从滴定管中预先加入约20ml0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀。
于电炉上加热至沸腾，在沸腾的状态下以每秒一滴的速度加入0.1%标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点。
记录前后总共消耗的标准葡萄糖溶液的总体积。
同法平行操作3次，取接近两次体积的平均值为V0。
c滴定
甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加入0.1mlV1发酵液，摇匀后于电炉上加热至沸腾，在沸腾状态下以每秒一滴的速度加入0.1%标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点。
记录消耗的标准葡萄糖溶液的总体积V2.
d计算公式
还原糖（以葡萄糖计g/100ml）=（V0-V2）×C×1/V1×100【V0=29.1mL；C=0.1%；V1=0.1mL】
（三）谷氨酸含量的测定
a谷氨酸标准曲线的绘制
◆标准样品的制备L-谷氨酸纯品梯度稀释溶液：
分别称取0.05-0.5g分析纯L-谷氨酸,并分别溶解到100ml蒸馏水中，调节pH5.5-6。
◆茚三酮试剂的制备称取0.5g茚三酮溶于100ml丙酮。
◆pH调节试剂的制备2mol/LNaOH溶液：
称取80gNaOH溶于100mL蒸馏水中；1mol/LHCL溶液：
量取36mL蒸馏水中。
◆标准溶液OD569值的测定取20支试管，分别加入3ml配制好的（0.05-0.50）g/100ml的L-谷氨酸纯品溶液各两管，每支试管分别沿试管壁加入茚三酮试剂0.5ml，摇匀，迅速置于80℃水浴，3min后，冰浴3min，将分光光度计波长调至569nm处，以蒸馏水为空白对照，用1cm玻璃比色皿比色，测出OD569值。
以OD569值为纵坐标，绘制标准曲线。
b发酵液谷氨酸含量测定
谷氨酸发酵液11400r/min，离心5min，取上清，蒸馏水稀释100倍，调节pH值5.5-6，取3ml预处理好的发酵液加入15mm×150mm试管，调整pH值5.5左右，沿试管壁加入0.5ml茚三酮试剂，混匀，迅速置于80℃水浴，3min后，冰浴3min，将分光光度计波长调至569nm处，以100稀释的空白发酵培养基为空白对照，用1cm玻璃比色皿比色，测出OD569值。
从标准曲线上查出相应L-谷氨酸浓度。
结果与分析
1、谷氨酸菌种的制备结果
一级菌液OD600=0.239pH=6.5
二级菌液OD600=0.106pH=7.0
2、谷氨酸含量的测定结果
1）标准曲线数据：
时间（h）
0
1—3
4
5—7
8
9—11
12
13—15
16
温度
32
32
32
32
35.9
pH
6.42
6.56
7.38
8.57
8.94
DO值
102.0
82.2
2.7
2.6
2.3
通风量
2.5
2.4
2.4
3.0
2．3
OD600
0.208
0.641
1.381
7.45
8.65
还原糖含量滴定用量（ml）
10.8
还原糖含量（g/100ml）
9.21
谷氨酸含量（OD569）
0.4
谷氨酸含量（g/100ml）
0.0892
时间（h）
17—19
20
21—23
24
25—27
28
29—31
32
33—35
温度
35.9
35.9
36.0
36.0
pH
9.02
9.05
9.03
9.12
DO值
12.1
17.5
29.1
49.9
通风量
6.8
5.2
50
4.8
OD600
10.13
10.35
10.63
10.33
还原糖含量滴定用量（ml）
13.30
14.66
15.49
还原糖含量（g/100ml）
6.71
5.35
4.42
谷氨酸含量（OD569）
1.1
1.9
2.2
2.9
谷氨酸含量（g/100ml）
0.2056
0.3386
0.3884
0.5047
时间（h）
36
37—19
40
41—43
44
45—47
48
49
50
温度
35.8
35.9
35.9
35.9
pH
8.73
9.17
9.12
8.15
DO值
63.0
67.9
75.1
65.1
通风量
0.6
0.6
0.6
0.6
OD600
9.74
11.84
9.33
9.66
还原糖含量滴定用量（ml）
16.50
16.62
17.96
19.09
还原糖含量（g/100ml）
3.51
3.39
2.05
0.92
谷氨酸含量（OD569）
4.0
5.4
3.4
1.9
谷氨酸含量（g/100ml）
0.6876
0.9202
0.5879
0.3336
2）标准曲线绘制如下：
3、谷氨酸发酵过程
1）谷氨酸发酵上罐
谷氨酸棒杆菌
4、实验分析:
4.1实验通过平板划线分离菌种的方法获得单个菌落，图中可以看出，单菌落的形态、大小、颜色比较一致，可以用作一级、二级种子的培养。
4.2谷氨酸发酵是建立在容易变动的代谢平衡上，受多方面的环境条件支配。
环境适应，谷氨酸产生菌能将50%以上的糖转化为谷氨酸，副产品较少。
如果环境条件不适宜，谷氨酸几乎不产生，可能会合成乳酸、琥珀酸等代谢产物。
因此，需要对发酵过程进行严格控制。
4.3温度对于发酵是非常重要的，从酶反应动力学来看，温度升高，反应速度加快，代谢产物速度提前。
由谷氨酸发酵中温度及还原糖随时间变化曲线图可以看出，发酵过程中，温度严格控制在30～36℃之间，在32～36h内，温度大都接近36℃，符合谷氨酸发酵中温度的要求。
从而，可以排除温度在发酵过程中对谷氨酸代谢产物合成的影响。
4.4发酵过程中，营养成分的利用和代谢产物的积累，使发酵液的PH不断变化，若阴离子氮源被利用后产生NH3，则pH上升。
有机酸的积累，使pH下降，培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。
而PH的变化又会间接影响到膜渗透性，进而影响到营养物质的吸收和代谢产物的分泌。
所以，在谷氨酸发酵过程中，需控制好PH。
谷氨酸发酵中PH及通风量随时间的变化曲线表明，PH通过尿素流加法，严格控制在6～8之间，在发酵过程中，由于没有PH电极，不能及时得知发酵液的PH值，所以难以控制在6～8之间。
4.5供氧对菌体的生长和谷氨酸的积累都有很大的影响，若在生长期，供氧不足，会抑制菌体的生长，从而导致副产物乳酸的积累。
有图标看出，在前8小时左右，DO值不断下降，这是由于发酵前期，谷氨酸棒杆菌增殖耗氧的缘故。
第18小时左右DO值开始回升，谷氨酸棒杆菌增殖减缓。
4.6还原糖是谷氨酸发酵过程中的主要检测控制参数，当还原糖的含量降至1%以下，表明谷氨酸的发酵已经完成。
图表看出还原糖含量不断降低，但是谷氨酸含量有个先增长后降低的趋势，可能是发酵后期，谷氨酸分解的缘故。
4.7谷氨酸的等电回收，并未得到谷氨酸的结晶体，可能是人工操作失误，无法结晶。
总结：
此实验比较失败……
实验二啤酒发酵工程系列实验
（一）协定法糖化试验
一、实验目的
了解协定法糖化试验的原理，并掌握这种糖化法的操作。
二、实验原理
利用麦芽所含的各种酶类将麦芽中的淀粉分解成可发酵性糖类，蛋白质分解为氨基酸，碘遇淀粉显蓝色，从而判断可发酵性糖类的浓度。
三、实验材料、仪器与试剂
材料麦芽、麦芽汁
仪器水浴锅、烧杯、瓷板、玻棒、温度计、纱布、胶头滴管、恒温水浴锅
试剂碘化钾
四、实验步骤
A实验室糖化器的准备由水浴锅和1000ml的烧杯组成糖化仪器，杯内用玻璃棒搅拌。
实验时杯内液面应始终低于水浴液面。
B碘溶液配制2.5g碘化钾溶于水中，稀释到100ml；
C协定法糖化麦芽汁的制备
1）用植物粉碎机将麦芽粉碎，称取75g；
2）在已知质量的糖化杯中放入75g麦芽粉，加300ml46-47℃的水，于不断搅拌下在45℃水浴中保温1h；
3）使酶液以每分钟升温1℃的速度，升温加热水浴锅，在25min内升至70℃，此时于杯内加入150ml70℃的水；
4）70℃保温2h；
5）每隔10min用玻璃棒取麦芽汁一滴，置于白滴板上，再加1滴碘液，混匀，观察颜色变化，直至碘液不变色为止；
6）在10-15min内急速冷却到室温；
7）用纱布将麦芽汁进行过滤，将滤液转移到蓝口瓶中；
8）用八层纱布将瓶口封好；
9）高压灭菌30min。
（二）啤酒酵母的扩大化培养
一、实验目的
学习酵母菌种的扩大培养方法，为实验室啤酒的发酵准备菌种。
二、实验原理
在啤酒发酵中，接种量一般应为麦芽汁量的10%（使发酵液中的酵母量达1×107个酵母/毫升），因此，要进行大规模的发酵，首先必须进行酵母菌种的扩大培养，扩大培养的目的一方面是获得足量的酵母，另一方面是使酵母由最适生长温度（28℃）逐步适应为发酵温度（10℃）。
三、实验材料、仪器与试剂
材料啤酒酵母发酵菌种培养液
仪器恒温培养箱；生化培养箱；显微镜等。
试剂麦芽汁平板；麦芽汁培养液
四、实验步骤
利用糖化后的麦芽汁50ml+1g的琼脂粉配制成固体培养基，灭菌后倒两个平板。
另外将50ml的麦芽汁倒到100ml的锥形瓶中，高压灭菌
1）接种：
将不同品牌的啤酒酵母用划线法接到麦芽汁培养基中；
2）培养：
在28℃中培养48h后挑取若干个菌落接到50ml麦芽汁中；
3）28℃中培养12h后，每隔一小时摇5min，并将温度调低1℃，知道温度降到12℃为止。
（三）啤酒主发酵及各项指标的测定
一、实验目的
学习啤酒发酵的过程，掌握酵母发酵规律；学习用血球计数板计数酵母数量的方法；学习酵母菌种的质量鉴定方法；学习用糖锤度计测定糖度的方法；掌握PH的测定方法，监测啤酒发酵的进程；了解用目视比色法的、测定啤酒色度的方法，监测发酵液的质量。
二、实验原理
啤酒主发酵时静置培养的典型代表。
是将酵母接种至盛有麦芽汁的容器中，早一定温度下培养的过程。
由于酵母菌是一种兼性厌氧微生物，先利用麦芽汁中的溶解氧进行好氧生长，然后利用EMP途径进行厌氧发酵生成酒精。
定期摇动容器既能增加溶氧，也能改善液体各成分的流动，最终加快菌体的生长过程。
分析其他指标，应从取样口取样测定。
三、实验材料、仪器与试剂
材料啤酒酵母；啤酒酵母发酵菌液。
仪器玻璃缸；生化培养箱；显微镜；恒温水浴锅；恒温箱；高压蒸汽灭菌锅；带刻度的锥形离心管；PH计；糖锤度计；100mL比色管；白瓷板；吸管；玻璃杯等
试剂麦芽汁培养基；灭菌水；0.1mol/L碘标准溶液；美篮；葡萄糖；蛋白胨；醋酸钾；琼脂等。
四、实验步骤
1）将糖化好的的麦芽汁装在蓝口瓶中，加葡萄糖调节糖度到10Bx，定容至600ml，用八层纱布封好口之后，灭菌30min；
2）在接种前先将麦芽汁培养基摇匀；
3）将扩大培养中的50ml酵母培养液转接到麦芽汁培养基中，摇匀；
4）将接好种的麦芽汁培养基放到10℃的生化培养箱中培养，每6小时摇瓶充氧5min，每24h取样测量啤酒发酵的各项指标，指标包括：
糖度、细胞浓度、出芽率、细胞死亡率、还原糖、色度、pH。
5）糖度达到4Bx后停止发酵；
（一）啤酒酵母的计数
1）取清洁的血球计数板一块，平放于桌面，在计数室上方加盖盖玻片；
2）取酵母菌液（发酵液）10um加190um水稀释20倍（根据实际需要稀释所稀释倍数），用移液枪吸取稀释后的菌液滴至盖玻片边缘，让菌液渗入计数室内，计数室内不能有气泡；
3）静置5min，让酵母细胞稳定附着于计数室内；
4）将计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室的方格网，并移至视野中间；
5）转用高倍镜，找到计数室位置开始计数；
6）计算公式：
酵母细胞数/ml=大格中的细胞总数×10000×稀释倍数
7）用完血球计数板后马上清洗干净。
（二）啤酒酵母的质量检查
1）试剂配制0.025%美蓝水溶液100ml，0.025g美蓝溶于100ml水中。
2）死亡率检查取一滴稀释后的菌液加一滴的0.025%美蓝水溶液混匀，在将其滴至血球计数板盖玻片边缘，使其渗入，取5个视野计算被染色的细胞与总细胞数，计算死亡率。
3）出芽率检查可以跟检查死亡率一起进行，在检查死亡率的视野中数出出芽的细胞个数，计算出芽率。
（三）还原糖的测定
1）试剂配制（斐林试剂）：
甲液：
五水硫酸铜3.5g，亚甲基蓝0.005g，用水溶解并稀释至100ml；
乙液：
酒石酸钾钠11.7g，氢氧化钠12.64g，亚铁氢化钾0.94g，用水溶解并稀释至100ml；
0.1%标准葡萄糖溶液：
取葡萄糖1g，用少量水溶解，转至1000ml容量瓶中，加入5ml盐酸，用水稀释定容至1000ml，摇匀；
2）斐林试剂的标定
甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加水10ml，从滴定管中预先加入约20ml0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀。
于电炉上加热至沸腾，在沸腾的状态下以每秒一滴的速度加入0.1%标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点。
记录前后总共消耗的标准葡萄糖溶液的总体积。
同法平行操作3次，取接近两次体积的平均值为V0。
3）滴定
甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加入0.1mlV1发酵液，摇匀后于电炉上加热至沸腾，在沸腾状态下以每秒一滴的速度加入0.1%标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点。
记录消耗的标准葡萄糖溶液的总体积V2.
4）计算公式还原糖（以葡萄糖计g/100ml）=（V0-V2）×C×1/V1×100
（四）糖度的测定用糖度仪测出发酵液的糖度，再根据公式换算出plato值。
（五）pH值的测定直接用pH试纸进行测定
（六）色度的测定取2支比色管，一支中加入5ml蒸馏水，另一支加入5ml离心后的啤酒发酵液，用白色纸张为背景，用1ml移液管吸取1.00ml碘液，逐滴滴入装水的比色管中，并不断振荡比色管使其混匀，直至从轴线方向观察其颜色与样品比色管相同为止，记下所消耗的碘液体积（ml，精确至小数点后两位）
样品的色度=10MV，M为碘标准溶液物质的量浓度。
（四）结果与分析
1、啤酒质量品评
表1淡色啤酒的给分扣分标准
类别
项目
满分要求
缺点
扣分标准
样品
外观
10分
透明度5分
迎光检查
清亮透明，
无悬浮物
或沉淀物
清亮透明
0
-2
光泽略差
1
轻微失光
2
有悬浮物或沉淀
3~4
严重失光
5
色泽5分
呈淡黄绿色
或淡黄色
色泽符合要求
0
-1
色泽较差
1~3
色泽很差
4~5
评语
由成品看来，不够透明，沉淀也比较多，颜色有点暗沉。
泡沫性能
15分
起泡2分
气足，倒入杯中有明显泡沫升起
气足，起泡好
0
-1
起泡较差
1
不起泡沫
2
形态4分
泡沫洁白
洁白
0
-1
不太洁白
1
不洁白
2
泡沫细腻
细腻
0
-1
泡沫较粗
1
泡沫粗大
2
持久6分
泡沫持久，
缓慢下落
持久4min以上
0
-3
3~4min
1
2~3min
3
1~2min
5
1min以下
6
挂杯3分
杯壁上附有泡沫
挂杯好
0
-1
略不挂杯
1
不挂杯
2~3
喷酒缺陷
开启瓶盖时，
无喷涌现象
没有喷酒
0
0
略有喷酒
1~2
有喷酒
3~5
严重喷酒
6~8
评语
本组做的啤酒泡沫有点少但泡沫质量基本还是符合要求的。
啤酒香气
20分
酒花香气
4分
有明显的
酒花香气
明显酒花香气
0
-1
酒花香不明显
1~2
没有酒花香气
3~4
香气纯正
12分
酒花香纯正
无生酒花香
酒花香气纯正
0
-1
略有生酒花味
1~2
有生酒花味
3~4
香气纯正
无异香
纯正无异香
0
-1
稍有异香味
1~4
有明显异香
5~8
无老化味
4分
新鲜，
无老化味
新鲜无老化味
0
0
略有老化味
1~2
有明显老化味
3~4
评语
啤酒香气虽然有，但是不浓烈，也不够清醇。
酒体口味
55分
纯正
5分
应有纯正
口味
口味纯正，无杂味
0
0
有轻微的杂味
1~2
有较明显的杂味
3~5
杀口力
5分
有二氧化碳
刺激感
杀口力强
0
-2
杀口力差
1~4
没有杀口力
5
苦味
5分
苦味爽口
适宜，无
异常苦味
苦味适口，消失快
0
-4
苦味消失慢
1
有明显的后苦味
2~3
苦味粗糙
4~5
淡爽或醇厚
5分
口味淡爽
或醇厚，
具有风味
特征
淡爽，不单调
0
-2
醇厚丰满
0
酒体较淡薄
1~2
酒体太淡，似水样
3~5
酒体腻厚
1~5
柔和协调
10分
酒体柔和、
爽口、谐调，
无明显异味
柔和、爽口、谐调
0
-2
柔和、谐调较差
1~2
有不成熟生青味
1~2
口味粗糙
1~2
有甜味、不爽口
1~2
稍有其它异杂味
1~2
口味缺陷
25分
不应有明显
口味缺陷
（缺陷扣分
原则：
各种
口味缺陷分
轻微、有、
严重三等酌
情扣分）
没有口味缺陷
0
-2
有酸味
1~5
酵母味或酵母臭
1~5
焦糊味或焦糖味
1~5
双乙酰味
1~5
污染臭味
1~5
高级醇味
1~3
异脂味
1~3
麦皮味
1~3
硫化物味
1~3
日光臭味
1~3
醛味
1~3
涩味
1~3
评语
口味上真正的纯生，但是始终有一点杂味，口感不是很纯
总体评价：
总的来说，此次啤酒实验成品还是一般。
总计减分
25
总计得分
75
2、实验分析
啤酒发酵数据统计
一级麦芽
二级麦芽
第一天（12.3）
第二天（12.4）
第三天（12.5）
第四天（12.6）
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