最新分子实验学习总结郁娟娟.docx
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最新分子实验学习总结郁娟娟
分子实验学习总结——郁娟娟
DNAstar：
序列拼接
MEGA：
分析碱基组成
CLUSTAL：
序列比对
PAUP：
跑树
DABE：
饱和性分析
总思路：
序列拼接-比对-
四、下载序列的方法
打开.Fasta格式的序列-Fileexport-sequancealignment-保存
在NCBI上找到相应的序列方法：
SearchNucleotidefor文章的genibank序列号-reports-复制序列到txt文件中，删除没用的东西，只留下序列和学名。
保存成txt文件后，打开Editseq-将,txt序列复制到其中-save保存为seq格式
五、将拼接序列翻译成蛋白质方法
打开拼接的序列-全选中-Goodies-translateDNA
2、如何计算碱基含量比值、
答：
MEGA-NucleotideComposition
六、DAMBE序列饱和性分析
序列的饱和性分析在DAMBE程序中，以转换、颠换数为纵轴，以TN93模型（TamuraandNei,1993）校正的距离为横轴做散点图。
如果这些点随序列间分歧增大呈线性分布就说明序列间替换没有达到饱和，序列可以用于后续的系统发育分析。
DAMBE还长用在单倍型的归纳、基因频率和碱基组成分析、遗传距离计算、序列排序、
5.2.2碱基替换饱和效应的检验
当核苷酸序列分歧较小时，序列之间被观察到的核苷酸差异数接近实际替换数。
如果序列分歧较大，DNA序列的变异可能会受到饱和效应的影响，这时观察到的碱基差异可能包含了部分进化杂音。
一般说来，碱基转换发生的频率高于颠换，但是随物种分歧程度的增加，转换/颠换的比率接近或小于1，说明转换可能已经趋于饱和并可能成为进化杂音，所以转换和颠换发生的频率与序列间分歧度的关系就可以反映出碱基替换是否受饱和效应的影响。
在着手构建分子系统树前，为了排除这种进化杂音获取正确的进化信息，必须对目的片段的碱基替换是否受到饱和效应的影响进行检验。
用DAMBE（Xia，2000）分别对四个mtDNA片段的碱基替换模式进行检测，以此估计所研究mtDNA片段的碱基替换是否受到饱和效应的影响。
打开DAMBE-FILE-Openstandardsequencefile-类型unknown-打开proteincodingnuc.seq-invMtdna-trains-table–go-graphics-trainsitionandtranversionversisadvance–tn93-g0-graphstyle-curveonly-保存.bmp
问题
1、如何计算密码子的不同位上碱基变化，转换颠换比值
2、如何进行序列的饱和性分析
序列的饱和性分析在DAMBE程序中，以转换、颠换数为纵轴，以TN93模型（Tamura&Nei,1993）校正的距离为横轴做散点图。
如果这些点随序列间分歧增大呈线性分布就说明序列间替换没有达到饱和，序列可以用于后续的系统发育分析。
3、如何看用Editseq检验拼接后的序列是否能正确翻译为蛋白质
4、如何计算遗传距离（DAMBE）
一、DNAstar：
序列拼接
在序列的拼接时，修改红色和小写字母的碱基
具体步骤：
1、ABI文件包括图形和序列、SEQ文件只有序列没有图。
2、DNAstar—seqman—File—NEW，把序列都放近去，有两个正向，俩个反向的序列—Timeends—LOW—SEANALL-ASSEMBLE–出现contig打开-双击contig_@_核对-contig-saveconsenus-singlefile-保存位置-sequce-add-选择保存到的位置-点序列名字-add-双击-拼接完关闭。
3、原始序列和拼接的序列各保存在一个文件夹内。
4、EDIT-GOODIES-TRALS翻译成蛋白质。
‘
5、从ncbi上下载相关的序列和测得的序列保存在一个文件夹内，把前面的内容都删除，保留种名。
加〉符号-保存
二、序列的比对
6、先切齐序列：
用Seqman-sequence-add-skip-把所有的序列加进去进行删除，使序列整齐。
-contig双击,将序列切齐，再复制到一个新建的文本文档。
7、切齐后保存方式：
contig-exportsequences-multiplefiles=setlocation-file-保存切齐
8、当在切齐的序列中发现反向序列要改正：
用editseq打开序列-selectall–goodies-resersecomplement-全选粘贴到文本文档中，目的是比对。
三、构建NJ树方法（MEGA）
1、将TXT格式保存为nexus和clustal格式（生成aln\dnd\nxs）
CLUSTAR-进行比对-FILE-LOADSEQUENCE-打开新建的文本文档txt-加入进去后-aligment-docompleteAlignment-File-Savesequenceas–format-custal-ok-File-Savesequenceas–format-NEXUS最后保存为nexus和clustal格式，NEXUS是PAUP格式-关闭clustal.
2、点击MEGA-File-opendata-.aln文件-打开-ok-点击向下的绿色图标-ok-ok-删除最后没用的东西-保存-切齐序列,meg-
3、点击MEGA-File-opendata-切齐序列,meg-ok-yes-inverttebrateMitochondrial-ok-
4、phylogency-constructphylogency-NJ树-none改成bootstrap-k2p-compute-保存（image-EMF）
5、使用Mega2.0分析序列间的p-distance,即两两序列间的核酸差异比例，分析序列变异情况
方法1：
Distance-computepairwise-distanceonly改为stderr-compute
方法2：
pattern-computecompositiondistance
三、构建MP树方法
1、MrBays，目的是转化为.nex文件步骤为：
用bioedit将.txt文件比对转换成.nex文件格式
方法：
打开BioEdit，将.txt文件打开-Accessoryapplication-clustalmultiplealignment-File-export-sequenceAligment-选paup/nex命令.nex-保存-把.nexbegin前面的都删除。
File-open-切齐序列.txt-accessoryappliacation-clustalmultiplealigment-file-expore-sequencealigment-选paup/nenu命名.nex-保存
2、在.nex中加命令模板
;
end;
beginpaup;
logfile=coimp;
setmaxtrees=1000;
setcriterion=parsimony;
hsearchaddseq=randomnreps=1000;
showtrees;
describetrees1/plot=phylogrambrlens=yes;
savetreesfile=coi（mp）.treroot=yesbrlens=yes;
contreeall/file=coi.tre;
pscoreall/CI=yesRI=yesRC=yes;
bootstrapnreps=1000keepall=yessearch=heuristic/addseq=randomnreps=100;
savetreesfile=coi（mpb）.treroot=yes;
END;
2、打开paup-打开1.nex-open–开始跑树
3、用treeview打开.tree树。
MrBays建树
1、用bioedit将.txt文件比对转换成.nex文件格式
方法：
打开BioEdit，将.txt文件打开-Accessoryapplication-clustalmultiplealignment-File-export-sequenceAligment-选paup/nex命令.nex-保存-把.nexbegin前面的都删除。
File-open-切齐序列.txt-accessoryappliacation-clustalmultiplealigment-file-expore-sequencealigment-选paup/nenu命名.nex-保存
2、用paup运行.nex文件
3、接着继续用paup打开modeltest3.7文件夹中的modelpaupblock命令-运行结束后，在modeltest的modelfolder中生成一文件名为”model.scores”文件。
4、运行modeltest批处理文件，生成一文件名为”mt.txt”文件，则为最适合的模型文件
5、将最适模型文件中的参数（hLRTs）拷贝到.nex文件后，加入贝叶斯运行命令，并改正.ne格式等。
删除前后没用的，改正外群名字等。
只能用一个外群。
beginmrbayes;
logstartfilename=coibayes.log;
outgroupCinara;
Prsetstatefreqpr=dirichlet（0.3321,0.1058,0.1271,0.435）;
Lsetnst=6rates=gamma;
mcmcngen=1000000printfreq=100nchains=4savebrlens=yesstartingtree=random;
end;
6、将加好命令的.nex文件拷贝到MrBayes文件夹所在路径内，运行人头的MrBayes,输入execute.文件名.net,回车。
7、输入sumpburnin=1000回车
8、输入sumtburnin=1000回车
9、运算完毕后点击close弹出一对话框，输入命令语句“savetreefile＝文件名.tre；”回车。
菜单栏Tree中的Showinternaledgelabels即可显示各结点的bootstrap值。
9、生成的.con，用treeview打开
注意：
贝叶斯树只能用一个外群。
建设一个新文件夹，将.scores、mt.txt、txt、nex文件都放到一个文件夹内。
ML建树
方法同MrBays相似。
预测模型利用贝叶斯得到的模型。
把ML命令模板拷贝到.nex，把logfile改成自己的名（=coiML），外群也改（Daktulosphaira_vitifoliaeCinara_edulisC_arizonica）;-把最适模型lsetbase---likhood下面savetreefile=coisavetreesfile=coin（mb）
LsetBase=（0.33650.09760.1280）Nst=6Rmat=（26794342.00008028280.500010365153.00001.4084255543472.0000）Rates=equalPinvar=0.7355;–生成的.nex.con文件-treeview打开。
注意：
外群要写成Cinara_edulis形式，可以有多个外群。
打开方式和mp树一致。
戴传银笔记
PAUPNJtree
beginpaup;
outgroupoutgroupname;
setcriterion=distance;
bootstrapsearch=njnreps=1000keepall;
savetreesfile=nj.tre;
end;
PAUPMPTREE
beginpaup;
outgroupoutgroupname;
setcriterion=parsimony;
hsearchaddseq=simple（random）bootstrapnreps=1000;
describetrees1/plot=phylogrambrlens=yes;
savetreesfrom=1to=1000;
end;
PAUPMLTREE
beginpaup;
outgroupoutgroupname;
setcriterion=likelihood;
gettreesfile=xxx.tre;（xxxmodeltest文件保存的树的名称）
hsearchaddseq=asisbootstrapnreps=1000;
savetreesfile=ml.tre;
end;
MEGA3.1分析其核酸组成
1、打开MEGA，点击“File”中的“OpenData”打开“COI.aln”文件，点击绿色箭头－“ConverttoMegaformat”快捷键，出一把COI.aln转换成Mega格式的对话框，点击OK，即转换成COI的Megafile，保存。
2、用Mega打开该文件。
选DataType。
Protein－codingnucleotidesequencedata？
Yes。
SelectgeneticCode。
程序自行计算。
3、点击TA图标，出现SequenceDataExplorer
C：
Conservedsites291/660,分母613是总位点数
V：
Variablesites352/660
P:
Parsimony-informativesites26/660
N:
Nonparsimony-informativesites352-26＝326。
4、Mega-File-opendate-运算-sequenceDataExplorer-writedatatofile-title-写名字.nex
注意：
序列一定要正确，不能是反向的！
！
！
！
！
5、打开paup-打开1.nex-open–开始跑树
6、Bootstrap值检验及树的保存
输入命令“bootstrapnreps＝1000keepall＝yessearch＝heuristic/addseq＝randomnreps＝100；”点击回车键，
程序开始运算。
运算完毕后点击close弹出一对话框，输入命令语句“savetreefile＝文件名.tre；”回车。
菜单栏Tree中的Showinternaledgelabels即可显示各结点的bootstrap值。
7、用treeview打开.tree树。
阿征笔记
beginpaup;
setautoclose=yesnotifybeep=yes;
logfile=log.txt;
outgroupA00;
setroot=outgroupoutroot=monophyl;
setcriterion=parsimony;
hsearchaddseq=randomnreps=500nchuck=5chuckscore=1;
savetreesformat=nexusbrlens=yesappend=yesfile=mp.treroot=yes;
contreeall/file=mp（contree）.trestrict=nomajrule=yespercent=50le50=yes;
bootstrapnreps=1000conlevel=50keepall=nosearch=heuristic/addseq=randomnreps=100;
savetreesfile=mp（bootstrap）.treroot=yesbrlens=yessavebootp=bothfrom=1to=1000;
end;
征征20:
31:
57
我每次都是先写到contree那一步，然后在里面敲命令，后两条分别
征征20:
32:
13
beginpaup;
setautoclose=yesnotifybeep=yes;
logfile=log.txt;
outgroupA00;
setroot=outgroupoutroot=monophyl;
setcriterion=parsimony;
hsearchaddseq=randomnreps=500nchuck=5chuckscore=1;
savetreesformat=nexusbrlens=yesappend=yesfile=mp.treroot=yes;
contreeall/file=mp（contree）.trestrict=nomajrule=yespercent=50le50=yes;
end;
征征20:
32:
25
然后bootstrapnreps=1000conlevel=50keepall=nosearch=heuristic/addseq=randomnreps=100;
征征20:
32:
36
跑完后savetreesfile=mp（bootstrap）.treroot=yesbrlens=yessavebootp=bothfrom=1to=1000;
征征20:
32:
54
保存一个有bootstrap的树
征征20:
33:
35
再给你个阿荣给我的
征征20:
33:
42
setautoclose=yescriterion=parsimonynotifybeep=yes;
logfile=...;
Hsearchaddseq=randomnreps=100start=stepwisesavereps=yesrandomize=addseqrstatus=yeshold=1swap=tbrmultrees=yes;
savetreesformat=nexusbrlens=yesappend=yesfile=...;
contreeall/strict=nomajrule=yespercent=50le50=yes;
bootstrapnreps=1000conlevel=50keepall=yessearch=heuristic/addseq=randomnreps=10;
征征20:
34:
16
对了，我的outroot=monophyl;你们分子不是monophyl
PAUP软件使用简要说明
1.数据输入格式
将需要分析的一组DNA数据经Clustal软件比对分析后，将其比对结果的*.aln文件用Mega软件打开并转换为Mega格式（File-〉ConvertToMegaFormat），转换结果会以*.meg文件存在与*.aln同一目录下，再用DNAsp软件将*.meg文件转换为PAUP格式（File-〉Save/ExportDateAs，以NEXUSFileFormat保存）即可。
2.MP法分析
先启动PAUP软件，选择相应数据文件，然后在命令行内依次键入
outgroup_外群名回车
Bootstrap_nreps=1000_keepall回车
Describetree回车
Savetrees_from=1to=1000回车
3.NJ法分析
先启动PAUP软件，选择相应数据文件，然后在命令行内依次键入
outgroup_外群名回车
Set_criterion=distance回车
Bootstrap_search=nj_nreps=1000_keepall回车
contree回车
Savetrees_from=1_to=1000回车
4.ML法分析
先启动PAUP软件，选择相应数据文件，然后在命令行内依次键入
outgroup_外群名回车
Set_criterion=likelihood回车
Bootstrap_nreps=100_keepall回车
contree回车
Savetrees_from=1_to=100回车
注：
外群名指的是分析数据中外群的代号；
下划线“_”表示键入一个空格；
结果以*.tre格式存在分析数据的同一文件夹内，用Treeview软件打开。
郁娟娟总结
一Seqman用来Assemble,改错后保存成Seq.Seqman将所有的序列打开，将反方向的用Editseq转换过来。
二Editseq打开所有的Seq序列——exportasone----fas格式
三Mega打开fas格式文件——Alignment---alignmentbyclustle
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