第六章 动植物细胞培养技术制药.docx

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第六章动植物细胞培养技术制药

第六章动植物细胞培养技术制药

教学目的：

掌握动物细胞培养基本技术；

掌握植物细胞培养基本技术；

了解动、植物培养生物反应器的类型；

了解动植物细胞培养在生物制药领域中的应用。

教学重点：

细胞培养方式、基本操作（培养基的组成、制备、细胞培养过程的检测）

计划学时：

4

第一节动物细胞培养技术及其应用

一概述（了解）

动物细胞体外培养具有明显的表达产物方面的优点，为传统的微生物发酵技术所无法替代。

其中以它们转录后修饰和产物胞外分泌表达最为人们所感兴趣。

大规模培养动物细胞生产生物制品大约始于本世纪50年代，Earle等开发出细胞培养基之后，主要是用于生产病毒疫苗。

最初的生产方法是采用成百上千只体积小的培养瓶，后来又改用滚瓶培养。

1967年，VanWezel开发了适合贴壁细胞生长的微载体，使得动物细胞的培养能够在搅拌釜式反应器中进行，大大提高了生产率。

1972年，Knazek开发了中空纤维反应器，使得细胞密度大为提高。

1975年，Koholor和Milstein创立了细胞融合技术，使得悬浮细胞的培养变得十分迫切，气升式反应器被应用于杂交瘤细胞的培养，以生产单克隆抗体。

1978年，Lim还开发了细胞微囊化技术，将非贴壁依赖性细胞包含在较小的颗粒状微囊中，使培养在搅拌釜式或气升式反应器中进行，并放大至1000L规模。

通过动物细胞培养大致可生产如下几类生物制品：

（1）病毒疫苗如口蹄疫（FMD）、狂犬（Babies）、小儿麻痹症（Polio）、乙型肝炎（HbsAB）疫苗等。

（2）非抗体免疫调节剂如干扰素（IFN）、白介素（IL）、集落刺激因子（CSF）、B细胞生长因子（BCGF）、T细胞替代因子（TRF）、迁移抑制因子（MIF）、巨噬细胞激活因子（MAF）。

（3）多肽生长因子如神经生长因子（NGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）。

血清扩展因子（SF）、表皮生长因子（EGF）、纤维粘结素（Fibronnectin）。

（4）酶如组织血纤维溶酶原激活剂（t-PA）、VII、Ⅷ因子等。

（5）激素如红细胞生成素（EPO）、促黄体生成素（LH）、促培养滤泡素（FSH）等。

（6）病毒杀虫剂如杆状病毒等。

（7）肿瘤特异性抗原如癌胚抗原（CEA）等

（8）单克隆抗体。

（9）细胞本身。

（10）皮肤重植。

动物细胞技术需要进一步研究和开发的工作：

（1）动物细胞基因工程技术和杂交技术。

（2）新型细胞培养反应器及其培养技术。

（3）无血清、低蛋白或无蛋白培养基。

（4）新型微载体研制技术及微囊化技术。

（5）产物分离纯化技术。

二动物细胞培养的特性

（1）细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生素；

（2）动物细胞较微生物大得多，无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；

（3）培养过程需氧量少，且不耐受强力通风与搅拌；

（4）在机体中，细胞相互粘连以集群形式存在，培养过程具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性及功能全能性；

（5）培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵

（6）大规模培养时，不可套用微生物反应的经验：

（7）原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。

三培养基的组成与制备（掌握）

使动物细胞有可能在体外培养的基本条件之一，是提供尽可能与体内生活条件相接近的培养环境。

这个培养环境包括10个因素：

（1）温度，

（2）渗透压，（3）氢离子浓度，（4）其他有机离子，（5）主要的代谢物，（6）补充的代谢物，（7）激素，（8）影响细胞代谢的其他因子，（9）细胞生长的基质（Matrix），（10）各因素间的相互作用。

1氨基酸类

必需氨基酸：

体内不能合成而又是体外培养细胞所必需的－半胱氨酸和酪氨酸；

非必需氨基酸：

某些特殊细胞所需要，不能自制的，或易在培养过程中丢失的。

氨基酸类的浓度与所需细胞浓度有关，氨基酸浓度与细胞生长密度间的平衡程度往往会影响细胞的存活和生长率。

谷氨酰胺是多数细胞所需求的，作为能源和碳源被培养细胞利用；但有些细胞系则利用谷氨酸。

2维生素类

大多来自血清。

减少培养液中血清含量，需要在培养液中增加维生素的种类和含量。

3盐类

主要包括Na+、K+、Mg2+，Ca2+，Cl-、SO42-、PO43-和HCO3-，是调节培养液渗透压的主要成分。

4葡萄糖

各种培养液中大多数都含有葡萄糖，作为提供能量的原料。

5缓冲系统

大多数平衡盐溶液采用磷酸盐缓冲系统。

现广泛采用HEPES（N'-2-Hydroxyl-ethylpiperazine-N'-ethanesulfonicacid）作为缓冲系统，一般采用25mmol/LHEPES，起稳定和抵抗快速pH变化的，HCO3-是大多数培养细胞所必需的成分，但HCO3-的存在易引起培养液pH的明显改变。

在培养液中加入HEPES时HCO3-的浓度范围可以大一些。

培养液中的氨基酸由于浓度很低，缓冲效能甚微。

如果提高培养液中的氨基酸浓度，则可提高缓冲作用。

6矿物类

细胞所需求的多种矿物类是由血清提供的，在低血清或无血清培养液中，则需补充铁、铜、锌、硒和其他稀有元素。

7有机补充物

如核苷类、三羧酸循环中间产物、丙酮酸盐及类脂化合物等，在低血清培养液中是必需的成分，有助于细胞克隆和特化细胞的培养。

8激素类

不同的激素对细胞存活与生长显示有不同的效果。

胰岛素可促进葡萄糖和氨基酸的吸收，生长激素存在于血清中，尤其在胚胎血清中。

当生长激素与促生长因子结合后，有促进有丝分裂的效应。

氢化可的松也存在于血清中，可促使细胞粘着和细胞增殖；但在某些情况下，如细胞密度比较高时，氢化可的松可能是细胞抑制剂，并能诱导细胞分化。

9生长因子类

血液凝固过程中从血小板释放出来的多肽类生长因子，可促进有丝分裂活性。

其他如成纤维细胞生长因子（FGF），表皮生长因子（EGF），内皮生长因子以及增殖刺激活性（MSA），均具有不同程度的特性，它们或者来源于组织，或者来源于血清。

（二）培养液的物理性质

1pH

大多数细胞系在pH7.4生长最好。

一般不能超过pH6.8～7.6范围。

个别的细胞系如表皮细胞可以在pH5.5维持存活。

酚红是常用的指示剂。

红色为pH7.4，橙色为PH7.0．黄色为pH6.5，略呈蓝红色为pH7.6，紫色则为pH7.8。

2渗透性

人类血浆的渗透压为770kPa，小鼠类则为820kPa。

培养液的渗透压一般介于（690～850）kPa之间，能为多数细胞所耐受。

3温度

温度除直接影响到细胞生长外，与培养液的pH值也有关。

如低温时可增加CO2的溶解性而影响pH。

最理想的做法是把配有血清的培养液，置于36.5℃中。

过夜，然后再用于培养。

4粘度

培养液中血清的存在，直接影响培养液的粘度。

粘度对细胞生长影响较小。

但是在细胞悬浮培养或用胰蛋白酶处理时，为了尽量减少细胞受损伤，可通过提高培养液的粘度来克服。

在培养液中加羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮可增加培养液的粘度。

5表面张力和泡沫

培养液的表面张力有利于培养物粘着于底物上面。

在悬浮培养中，由于空气中含有5％的CO2可产生气泡，通过培养液中的血清形成气泡。

加防泡沫硅后，可减少表面张力，使之不产生泡沫。

（三）培养液水质

配制培养液前首先要制备纯净的水。

（四）平衡盐溶液

主要功效：

（1）作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压；

（2）提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内；

（3）提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子，

平衡盐溶液组成和含量要求：

（1）要与培养物来源的动物血清相近似；

（2）呈溶液状态，利于物质的传递和扩散；

（3）是等渗的，否则会引起细胞的收缩（高渗透压）和膨胀（低渗透比）。

（五）无血清培养基

血清主要功能：

（1）提供对维持细胞指数生长的激素，基本培养液中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子量的营养物；

（2）提供结合蛋白质，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力；

（3）有些情况下，结合蛋白能与有毒金属和热原结合，起到解毒作用；

（4）是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子的来源；

（5）起酸碱度缓冲剂作用；

（6）提供蛋白酶抑制剂，使细胞传代时使用的胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。

血清存在对实验的影响：

（1）在进行激素和药物研究时，血清成分与激素或药物结合的结果，干扰了其对细胞的作用；

（2）在进行细胞营养研究时，由于血清组成的复杂和不稳定，妨碍对细胞营养要求的确切了解；

（3）干扰对培养细胞释放产物的分析；

（4）血清只能过滤消毒，过滤消毒只能除去细菌，但不能除去血清中可能含有的病毒和支源体。

（5）血清中可能有抑制病毒的因素，干扰病毒研究实验。

因此，人们早已期望用不含血清的培养液培养细胞，或用已知或纯化成分替代培养液中的血清成分。

血清是一复杂的混合物，其组成成分大部分已为人所知，还有一部分尚不知。

而且血清组成及其含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件而有不同。

因此，为了预测某些因子对细胞生长有否刺激作用，必须先减低血清的作用。

最简单的办法是减少培养液中血清的浓度，使细胞生长减缓。

然后加入预测因检测其对细胞生长的影响。

（六）培养液的配制

1基本配制法

最简便的方法是先制备浓缩的母液。

浓缩母液可以在低pH情况下制备（pH3.5～5.0），有利于各组分的溶解。

用前，分别从各种母液取得所需的体积，混合，通过0.2μm微孔滤膜过滤消毒，冷冻贮存。

应用时，取4lmL混合的浓缩母液，用959mL消毒的平衡盐溶液稀释。

现在各种常用的人工培养液大多已商品化，一般有3种商品形式：

1倍工作液，10倍浓缩液，粉末状。

2培养液的选择

由于受到水质、不同批号血清，以及各试剂的纯度等的影响，有时尽管培养液的配制方法没有改变，但实验结果不能重复。

配制培养液时，尽可能避免这些因素的影响。

当选择好一批血清时，可多贮存—些，供相当长时间的应用，以保证实验的顺利进行。

3抗生素的选择和应用

抗生素可以抑制培养液中可能存在的霉菌或细菌的生长，而又不影响细胞生长。

现在通用的是青霉素和链霉素的合并使用。

青霉素的用量为每毫升培养液加50～100U：

链霉素为每毫升培养液加50～100μg。

青霉素相当不稳定，应该在使用时加到培养液中；链霉素在培养液中能较长时期保存活力。

对不同细胞系所应用的抗生素浓度也略有不同。

过量的抗生素也会抑制细胞的生长。

其他抗生素商品，如Fungizone（二性霉素）、Mycostatin（制霉菌素）等。

四细胞培养过程的检测（掌握）

（一）细胞生长过程的检测

1细胞计数

采用台盼蓝活体染色法来检查细胞存活，用血球计数板做细胞计数。

P453图6－1

4大格中细胞总数／4×10000×稀释倍数＝细胞数/mL原液

2细胞常规检查

观察的主要内容是：

污染与否，细胞的生长状态和pH等情况。

（1）细胞生长初代组织块培养或细胞悬液接种以后，都有一个长短不同的潜伏期。

接种细胞后在细胞生长过程中可经过4个阶段：

①游离期：

刚接种后，细胞在培养液中呈悬浮状态，此时细胞质回缩，胞体变圆形。

②吸附期：

为细胞贴附于培养瓶壁过程。

大多数细胞在24h内可贴壁，细胞种类不同，贴附速度也不—样。

一般传代细胞系细胞贴壁快，单个细胞快，组织块或较大细胞团慢，贴壁时间平均5～20min。

细胞机能状态不良或濒死细胞不贴壁。

另外，培养基偏酸或偏碱、培养基污染、胶塞有毒、培养瓶洗刷不洁等都不利于细胞贴壁。

贴壁机理与支持物表面电荷性质有关，带阳电荷时利于贴壁。

③繁殖期：

即生长期。

细胞贴壁后先由圆形细胞变成延展细胞，进而过渡成极性细胞。

这时，只有细胞运动而无细胞分裂，是细胞潜伏阶段。

继而出现细胞分裂，进入生长期，细胞数目不断增多，同时有一定移动现象。

当细胞彼此一经接触之后，这种移动运动便停止，这种现象叫接触抑制（Contact5nbibit50n）。

接触抑制只抑制细胞运动，并不抑制细胞分裂。

所以，当细胞长满了生存平面，汇合在一起连接成片以后，仍然能继续分裂，直到细胞达到一定密度，才停止分裂。

这后一种抑制叫密度抑制（Densityinhibitinn），能抑制细胞分裂，接触抑制和密度抑制两者含意不同，不能混淆。

④退化期：

当细胞长满瓶壁以后，如不及时做传代，由于营养物消耗和代谢物积累，细胞进入退化期。

此时细胞轮廓增强，细胞内堆积有颗粒状物，为膨胀的线粒体，细胞变得租糙，严重时细胞从瓶壁脱落，只有及时做传代再培养，细胞才能继续再生长繁殖。

（2）细胞形态

生长状态良好的细胞，在—般显微镜下观察时透明度大，轮廓不清，只有用相差显微镜，才能看清细胞的细微形态；

细胞机能不良时，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴和其他颗粒状物，细胞之间空隙加大、细胞形态常变得不规则和失去原有特点，如上皮细胞会变成纤维细胞等。

（3）营养液

在正常情况下，培养液呈桃红色。

用一般恒温箱培养时，随细胞生长时间延长，CO2积累增多，在超出缓冲范围后，营养液酸化变黄，此时如不调节pH，对细胞会发生不利影响，严重时细胞脱落死亡。

培养在自控5％CO2的温箱中可免除此麻烦。

营养液碱化变红除因瓶口不严、CO2溢出外，也可能由于培养瓶和瓶塞刷洗不洁，残留碱性物质所致。

更换营养液的时间，可依营养物的消耗而定，细胞生长旺盛时2～3天换一次，生长缓慢时3～4天也可。

（4）微生物污染污染主要来源于培养用液、培养基、血清或操作时由空气播散所致。

最常发生的是霉菌和细菌污染。

霉菌污染易于发现，如培养液中长出了各种菌落，肉眼可见。

细菌感染时，有的引起培养液混浊，镜下可见大量细菌；有的培养液无明显改变，如怀疑污染，必要时可向肉汤或琼脂培养基里滴少量培养物，置37℃温箱培养数日，观察有无菌落形成，以验证是否污染。

（5）细胞活性可用对色素的吸附来判断细胞的死活。

用活细胞占计数细胞中的百分比表示其活力。

常用的是染色排除法，即使死细胞着色。

台盼蓝配制时可加热使其充分溶解，染色时间过长，活细胞也可受损着色。

苯胺黑染色法对细胞毒性小，但溶解性较差，最好过滤—下。

藻红B这种色素易同蛋白质结合，故需把血清洗净。

活细胞着色法，常用的是结晶紫，细胞悬液同0.1％结晶紫（溶于Hanks液）混合后，立即镜检，着色的为活细胞。

3细胞生物学检查和鉴定

需测定的细胞生物学特性所涉及的范围和指标可以很广，并无严格的标准，一般应包括有以下几个方面：

（1）解剖学方面

①起源：

起源于哪个胚层，什么器官的何种组织，来源于老年个体、中午个体，还是幼年或胚胎组织，系正常组织还是病理组织（肿瘤等）；有的组织本身是正常的，但供体是某种疾病的患者（如着色皮肤病患者成纤维细胞培养），都应加以说明。

②形态学：

确定出细胞种类（成纤维细胞或上皮细胞等），细胞体积大小范围、核数目、核仁和染色质量多少，双核和多核巨细胞的有无，胞质中有无色素，以及电镜图像特征等。

（2）细胞生物学方面

①细胞生长曲线：

即细胞增殖数目，一般计算7～10天，接种细胞7～10组。

方法是：

每日抽查一组，先吸出培养液，加胰蛋白酶或EDTA消化数分钟（注意勿消化过度，以防细胞丢失，导致计算误差），吸出消化液，再把原培养液倒入培养瓶，用吸管吹打瓶壁细胞制成悬液，计算出每毫升细胞数。

按此计算出细胞总数，最后用坐标纸绘出逐日细胞数，即得细胞生长曲线。

②细胞分裂指数：

一般习惯上按1000个细胞中的分裂细胞计数，作为细胞分裂指数，计算分裂指数要用加盖片培养法，细胞也要接种5—7组，接种量及其他条件与上法相同，以后逐日抽出每组盖片，进行固定染色，制成标本。

然后镜下观察，计算出分裂相数量。

取得逐日分裂相数目后，即可绘出细胞分裂指数曲线。

4细胞培养物中支原体的污染检查

已知污染来源：

支源体系由血清或细胞培养过程中应用的其他培养成分所携带；来源于动物，实验室工作人员的口咽部。

排除支源体污染的3个主要方法：

（1）抗生素处理卡那霉素、金霉素、四环素、泰乐菌素。

（2）用支源体血清处理用特异性抗血清处理被支源体污染的细胞培养物，可永远清除污染物。

（3）高热处理因支源体对热较敏感，可将培养物放于41℃下18h，以破坏支源体，而细胞群不被破坏，或有少许损害。

（二）细胞培养工艺参数的检测

1温度控制

动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。

培养温度37℃，培养容器的温度控制误差约在±0.05℃之内。

2pH控制

细胞生长的最适pH因细胞类型不同而异，范围为7.0～7.5。

缓冲液系统通常用CO2、碳酸氢盐调节，pH值取决于培养液中的CO2和碳酸氢盐的浓度比。

加入CO2即pH值降低，而加入碳酸氢盐则使pH值升高。

控制方法：

（1）加酸或加碱液方法，对pH值加以控制，但此法有产生局部pH值和增加培养液渗透压的危险。

（2）较安全的方法：

通过供给细胞所需的氧而改变通入反应器气流中的CO2浓度。

用CO2控制pH值会强烈受溶氧控制系统的影响，这因为控制溶氧（空气、N2或O2），加入任何气体都将导致CO2被置换，从而引起pH值升高。

在设计pH值控制系统时，应顾及溶氧控制。

3溶氧（DO）的测量与控制

在低氧压下，细胞往往生长缓慢，而氧压过高，会使培养液变得对细胞具有毒性。

溶氧的最适水平依赖于不同细胞的类型，空气饱和度应在10％～100％范围内。

可根据需要向培养液内加入氧气、空气或氮气控制溶氧。

4葡萄糖和乳酸的监测

为了及时了解大规模培养细胞的健康状况，应逐日或隔日吸取培养液样品进行乳酸的产量及葡萄糖摄入量的测定，以便监测细胞生长的动态状况。

5产物的收集和检测

根据大规模培养系统中的pH、DO数值及葡萄糖、乳酸等参数的动态变化，监控细胞生长状况，井定期抽样检测细胞分泌产物的含量。

应用不同类型的细胞，采用不同的产物检测方法。

一般用免疫荧光间接法、血凝法、免疫酶标法以及放射免疫法等。

一般产物的收集可采用批量收集和微机程序控制连续收集两种方法。

五、动物细胞培养方法与操作方式

（一）细胞培养方法

体外培养的动物细胞有两种类型。

一种是非贴壁依赖性细胞，来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞属于这一类型，可采用类似微生物培养的方法进行悬浮培养。

另一种是贴壁依赖性细胞，大多数动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体细胞属于这一类型，它们需要附着于带适量正电荷的固体或半固体表面上生长。

1贴壁培养

成纤维细胞和上皮细胞等贴壁依赖性细胞在培养中要贴附于壁上，原来是圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。

一般在数天后铺满生长表面，形成致密的细胞单层。

大多数动物细胞属于贴壁依赖性细胞，如HeLa、Vero、BHK、CHO等。

培养贴壁依赖性细胞，最初采用滚瓶系统，1967年开发了微载体系统培养贴壁依赖性细胞。

采用微载体系统培养动物细胞，细胞贴附于微载体上，悬浮于培养基中，逐渐生长成单层。

2悬浮培养

悬浮培养，是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程。

主要用于非贴壁依赖性细胞培养，如杂交瘤细胞等。

动物细胞的悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展起来的。

悬浮培养设备结构简单，可以借鉴微生物发酵的部分经验，放大效应小。

但是悬浮培养的细胞密度较低，转化细胞悬浮培养有潜在致病危险，培养病毒易失去病毒标记而降低免疫能力。

3固定化培养

对非贴壁依赖性细胞常用海藻酸钙包埋，对贴壁依赖性细胞常用胶原包埋。

（1）吸附选择适当的条件，将细胞和支持物混合，细胞便贴附在支持物的表面。

缺点：

负荷能力低，有细胞脱落的危险。

由于细胞位于支持物表面，细胞没有抗机械剪切的保护，但扩散限制小。

（2）共价贴附细胞和支持物通过化学键结合，减少了细胞泄漏。

但需化学试剂处理，这对细胞活性不利。

由于是贴附，扩散限制小，但细胞不能得到保护。

（3）离子/共价交联如果用聚合物（聚胺等）处理细胞悬液，则会在细胞之间形成桥，使之絮结。

通常细胞活性高，但机械稳定性差，易发生细胞泄漏。

用戊二醛处理可以增强机械稳定性，防止细胞泄漏。

共价交联试剂往往导致一些细胞死亡。

离子交联和共价交联类似于包埋，往往产生扩散限制。

（4）微囊在液体状态和生理条件下制备的，对细胞的生长条件改变不大，因此使包埋的细胞能够成活，也能培养生长。

微囊化后，降低了培养时对细胞的剪切力。

微囊里面处于一种微小的培养环境，与液体培养差不多，细胞生长良好。

微囊化培养能提供很高的细胞密度，使得产物浓度增加，纯度提高。

（5）包埋此法步骤简单，条件温和，细胞和高聚物或单体混合，随着凝胶的形成，细胞嵌入到高聚物的网络中。

由于有一系列高聚物可采用，通常可以选择合适的系统，使细胞处于活性状态。

这种方法负荷量大，细胞泄漏减少，高聚物网络能保护细胞抵抗剪切。

当然，它也存在一些缺点，如扩散限制，并非所有细胞都能处于最佳基质浓度，而且大分子基质不能渗透高聚物网络，往往有一些物质被排斥在外。

（二）细胞培养的操作方式

1分批式操作

分批式培养是指将细胞和培养液一次性装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一段时间反应后，将整个反应系取出。

分批式培养过程中，细胞的生长可分为延迟期、对数生长期、减速期、稳定期和衰退期5个阶段。

延迟期是指细胞接种到细胞分裂繁殖这段的时间。

2流加式操作

流加式操作是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补充至反应器内，使细胞进一步生长代谢，到反应终止时取出整个反应系。

特点：

①能够调节培养环境中营养物质的浓度。

避免某种营养成分的初始浓度过高而出现底物抑制现象；

能防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成；

②整个过程中反应体积是变化的。

3半连续式操作

又称为反复分批式培养或换液培养，是指在分批式操作的基础上，不全部取出反应系，剩余部分重新补充新的营养成分，再按分批式操作的方式进行培养。

这是反应器内培养液的总体积保持不变的操作方式。

4连续式操作

连续式操作，是指将细胞种子和培养液—起加入反应器内进行培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。

与分批式操作和半连续式操作不同，连续培养可以控制细胞所处的环境条件长时间的稳定，可以使细胞维持在优化状态下，促进细胞生长和产物形成。

此外，对于细胞的生理或代谢规律的研究，连续培养是一种重要的手段。

连续培养过程可以连续不断地收获产物，并能提高细胞密度，在生产中被应用于培养非贴壁依赖性细胞。

5灌注培养

灌注式操作是指细胞接种后进行培养，—方面新鲜培养基不断加入反应器，另一方面又将反应液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。

当高密度培养动物细胞时，必须确保补充给细胞以足够的营养以及去除有毒的代谢废物。

在分批培养中，可以来用取出部分用过的培养基和加入新鲜的培养基的办法来实现，这种办法的缺点在于当细胞密度达到一定量时，废代谢物的浓度可能在换液前就达到了产生抑制作用的程度。

降低废代谢产物的有效的方法就采用新鲜的培养基进行灌注。

通过调节灌注速度，可以把培养过程保持在稳定的、废代谢物低于抑制水平的状态下。

六、动物细胞大规模培养系统（了