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蛋白酶整理

一、蛋白酶的分类、主要用途及作用

二、产蛋白酶菌株的筛选

三、产酶发酵

四、蛋白酶活性测定的方法

蛋白酶的分类、主要用途及作用

酶：

酶是具有生物催化功能的生物大分子。

蛋白酶：

水解蛋白质肽键的一类酶的总称

蛋白酶分类：

1据水解多肽的方式分为内肽酶和外肽酶

2据反应的最适pH值分为酸性，碱性，中性蛋白酶

蛋白酶简介：

广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。

微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。

催化蛋白质水解的酶种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。

蛋白酶对所作用的底物有严格的选择性，一种蛋白酶只能作用于蛋白质分子中一定的肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。

蛋白酶分布广泛，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富，由于动植物资源有限，工业生产上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌等微生物发酵设备。

一、酸性蛋白酶

定义：

酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类

注：

酸性蛋白酶是指蛋白酶具有较低的最适pH,不是指酸性基团存在于酶的活性部位.

简介：

主要来源于动物的脏器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。

根据其产菌的不同，微生物酸性蛋白酶可以分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶，根据作用方式可以分为两类：

一类是与胃蛋白酶相似，主要的产酶微生物是曲霉、青霉和根酶等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛酶和栗疫酶等，

从酶的活力-PH曲线分析,在酶的活性部位中含有一个或更多的羧基，这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。

酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。

基本性质

酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右

应用

1酿酒：

酸性蛋白酶在酿酒的过程中起协同作用，具有溶解发酵原料，促进微生物繁殖，降解酵母菌体蛋白等多种功能。

2毛用酸性蛋白酶最适ph3.5，最适温度40度，用该酶处理预处理后的羊毛，可以得到较大的减量率和较好的细度。

面临的问题：

酶对羊毛的作用活力不高。

3食品工业：

食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量

4啤酒生产：

能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。

饲料添加剂：

提高饲料利用率。

二、碱性蛋白酶

简介

碱性蛋白酶是由造育的地衣芽孢杆菌发酵而得，主要成分为枯草杆菌蛋白酶，是一种内切酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27300。

基本性质

适宜于在40-55℃、PH9-11的碱性条件下使用，超出以上范围酶的活力下降。

重金属离子和阳离子表面活性剂对其活力有抑制作用，应用中应避免。

应用

碱性蛋白酶是目前市场上流行的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤去污能力，特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢,具有独特的洗涤效果。

二、中性蛋白酶

简介

　　中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。

在一定温度、PH值下，本品能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物。

可广泛应用于动植物蛋白的水解

基本性质

水解温度35～55℃PH值：

6.0～7.5

应用

　1动植物蛋白水解粉（HAP、HVP）生产的应用

　　利用中性蛋白酶的酶促反应，可把动植物的大分子蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，以利于蛋白质的有效吸收和利用，其水解液AN%高，水解度高，风味佳，已广泛用于生产高级调味品和食品营养强化剂，各种动物来源性抽提物生产功能性骨、肉提取物（骨素）、水产提取物、蛋白胨、肽等及研究开发一些高附加值的功能食品。

　　2焙烤行业的应用：

　　中性蛋白酶可将面团的蛋白质水解成胨、肽类甚至氨基酸，从而减弱面团筋力，使它具有良好的可塑性和延伸性，保持清晰美观的印花图案。

改善成品的光泽、使饼干断面层次分明，结构均匀一致，口感松爽酥脆。

　　3大豆分离蛋白的应用：

　　能水解大豆分离蛋白成小分子肽，大大提高了大豆分离蛋白的生物效价，使其易为人体消化吸收，同时还提高了溶解，降低了粘度，改善了大豆分离蛋白的功能特性。

　　4酵母抽提物、酵母浸膏的生产应用

　　提高最终产品的蛋白质利用率及风味

　　5啤酒工业：

　　添加中性蛋白酶分解蛋白质为多肽和游离氨基氮，特别对大麦，大豆等植物性蛋白作用效果明显，用于啤酒生产，可排除蛋白质产生的"冷混浊"现象。

　　6医药工业的应用：

　　含中性蛋白酶的药物，可起到消炎、利胆、止痛、助消化的功效。

　　7纺织工业的应用：

　　用中性蛋白酶处理过的羊毛，其抗张度比常规方法高，毛线手感柔软，收缩性为0；还可用于蚕的脱胶和蚕丝的精炼。

　　8皮革工业的应用：

　　利用中性蛋白酶可制成脱毛剂，经鞣制的皮革，脱毛干净，粒而清晰，无明显损伤，毛孔细致光亮。

　　9饲料工业的应用：

　　加入饲料配方中或直接与混合饲料混合饲喂，可提高蛋白质的利用率和降低饲养成本。

产蛋白酶菌株的筛选

方法一（形成芽孢产蛋白酶菌株的筛选）

实验方案设计

一、实验原理

枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。

枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。

由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。

但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。

例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。

又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。

1.枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。

由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。

2.枯草芽孢杆菌的产酶特征。

利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。

根据透明圈直径（H）和菌落直径（C）之比值（H/C）可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。

3.枯草芽胞杆菌的形态特征

枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。

有芽孢0.6×1～1.5μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。

菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。

在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。

菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。

4.枯草芽胞杆菌的生理生化特性

枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚、H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。

葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。

二、实验材料及用具

（1）肉汤培养基：

组成：

蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，煮沸后调节ph7.2-7.4，121度高压灭菌15min。

配置100ml，其中20mL液体培养基放入250mL锥形瓶中（内装玻璃珠10颗）；50mL固体斜面培养基分装在试管中：

5mL/支，10支。

（2）酪素培养基：

组成：

蛋白胨10g，葡萄糖1g，氯化钠5g，氯化钙0．1g，L-酪氨酸0．1g，琼脂22g，酪素5g，蒸馏水1000mL，pH7．2～7．4，112℃，灭菌30min．

200mL放入500mL的锥形瓶中，6个平板，pH6.5～7.0，121℃，灭菌20min，倒好平板后进行无菌检查。

（3）生理盐水：

0.85%NaCl水溶液，9mL/支×10支

（4）其他：

平皿10套、温度计、水浴锅、移液管、显微镜、涂布器2个，三角瓶（250mL，500mL规格）、革兰氏染色液等。

三、实验步骤

1.采样从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样。

2.增殖培养（富集培养）

取土样平摊于一干净的纸上，从四个角和中央各取一点土，混匀，称取1g，置于装有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，六层纱布封口，于80℃水浴加热处理10min，以杀死样品中的微生物营养体细胞。

然后30℃，150r/min，振荡培养24h。

取样镜检形成芽孢的情况。

3.涂布分离

将增殖培养液置于80℃水浴中加热10min，再次杀死不形成芽孢的营养体细胞，以浓缩芽孢杆菌（第二次加热处理前，取1ml培养液经适当稀释后作革兰氏染色，观察是否有枯草芽孢杆菌存在，本实验中略去该步骤）。

然后取1mL处理液以10倍稀释法分别稀释到10-4，10-5，10-6等。

分别取0.1mL菌液于无菌的酪素培养基平板上（初筛平板，每个稀释度平均两皿），用灭过菌的涂布棒将菌液均匀涂布在酪素平板上，倒置于30℃培养箱中培养24~48h。

观察酪素平板上菌落周围的透明圈，挑（H/C）比值大的菌接入斜面培养基，30℃培养24h，备用。

4.纯化

用平板划线分离法在酪素平板或牛肉膏蛋白胨平板上分离纯化挑选出的菌株。

5.纯种鉴定

菌种经革兰氏染色，油镜观察，从细胞形态及菌落特征进行鉴别。

①细胞形态，菌落特征，芽孢形成情况。

②产蛋白酶能力的测定：

直接观察在酪素平板上菌落周围所形成的透明圈。

6.菌种保藏该实验分离得到的枯草芽孢杆菌作为后续实验的菌种使

方法二（利用蛋白水解圈）

一实验原理

通过样品采集、富集培养、浓度稀释、涂布培养、传代培养和鉴定来分离产蛋白酶的菌株。

为了得到含有较多所需菌株的样品，采集样品时要在含有枯叶草根等土壤肥沃的地方采集。

通过富集培养使能产生蛋白酶的菌株数量增加，比例增大，利用显微计数法计数，稀释到合适的浓度，使其涂布培养后长成单个菌落，然后进行传代培养，再进行鉴定，在鉴定时为了菌株不受污染，利用影印平板法将菌株接种到两个平板的对应位置，一个平板用来接种到试管中，另一个平板用来检验。

Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，检验时将福林试剂滴到菌落上，若菌落周围出现透明圈，则说明菌落周围的蛋白质被细菌分解了，细菌产生了蛋白酶。

本实验含有一个对照，即培养基不接菌种的平板，该对照若无杂菌生长，则说明在这种培养基长出的菌落是所接中的细菌生长的.

自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。

水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。

不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。

二、实验器材

1菌株

从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株

2溶液和试剂

蛋白胨，葡萄糖，氯化钠，氯化钙，L-酪氨酸g，琼脂，酪素，蒸馏水等

3仪器和用品

三角烧瓶，移液管，培养皿，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，培养摇床，高压灭菌锅。

4.培养基：

酪素培养基（液体和固体平板）

三、操作步骤

1.取少量土样混于无菌水中，用酪素液体培养基进行富集培养基。

2.在无菌操作下，梯度稀释后涂布到酪素平板上，涂布前应先观察只含酪素碳源的平板是否无杂菌的生长，若有杂菌应重新配培养基，37℃培养24h左右观察

建议用地衣芽孢杆菌作为对照菌株

3.产蛋白酶菌株的观察、纯化与转接

对平板上的总菌数和产蛋白酶的菌数进行记录，选择蛋白水解圈最大的5个菌株进行测量和记录菌落和透明圈得直径，利用影印平板法进行传代培养纯化，然后转接到肉汤琼脂斜面上，37℃培养24h，获得菌种，并对其理化性质进行鉴定。

产酶发酵

参考书：

酶工程（第二版）郭勇科学出版社

蛋白酶活性测定的方法

一、　原理

蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。

磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。

由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。

利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。

二、　仪器和设备和试剂

1.仪器和设备

（1）分析天平：

精度0.0001g；

（2）恒温水浴：

精度±0.2℃；

（3）计时表；（4）分光光度计；（5）沸水浴器；（6）振荡混合器

（7）pH计:

精度0.01pH单位

2.试剂和溶液

（1）乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶

甲液：

称取乳酸（80%-90%）10.6g,加水溶解并定容至1000ml。

乙液：

称取乳酸钠（70%）16g,加水溶解并定容至1000ml.

使用溶液：

取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。

（2）　磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶

准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO3.12H2O）6.02g，和磷酸二氢钠（NaH2PO3.2H2O）0.5g,加水定容至1000ml

（3）　硼酸缓冲液（pH=10.5）适用于碱性蛋白酶

甲液：

称取硼酸钠19.08g,加水溶解并定容至1000ml。

乙液：

称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000ml.

使用溶液：

取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀，用水稀释至1L。

（4）0.4mol/L碳酸钠溶液：

准确称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.

（5）0.4mol/L的三氯醋酸液：

准确称取65.4g三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000ml

（6）0.5mol/L的NaOH：

准确称取2gNaOH溶解并定至100ml

（7）　10.00mg/ml酪素溶液

称取酪素1.000g,准确至0.001g,用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液（若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴）润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.

（8）　100μg/ml酪氨酸标准溶液

准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,用1mol/L的盐酸60ml溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.

吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/mlL-酪氨酸标准溶液.

（9）　酶样的制备

准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。

滤液可作为测试酶用.该酶已经稀释100倍。

（10）福林试剂

在1ml容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠（NaWO4`2H2O），125g钼酸钠（NaMOO4`2H2O），350ml蒸馏水，25ml85%的磷酸及50ml的浓盐酸，充分混匀后回流10h。

回流完毕，再加25g硫酸锂，25ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，以便驱除过量的溴，冷却后定容至500ml，过滤，置于棕色瓶中暗处保存。

使用前4倍蒸馏水稀释。

三、步骤

1.　标准曲线的绘制

L-酪氨酸标准溶液按下表配制。

试管号

取100μg/ml酪氨酸标准溶液（ml）

蒸馏水（ml）

酪氨酸实际浓度（μg/ml）

分别取上述溶液各1.00ml（须做平行试验），各加0.4mol/L碳酸钠溶液（作用？

）5.00ml。

福林试剂使用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算回归方程。

计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值，其K值应在95~100范围内。

2.　样品测定：

（1）先将酪素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min；

（2）取4支试管，各加入1ml酶液；

（3）取一支作为空白管，加2ml三氯乙酸，其他3管作为测试管各加入1ml酪素，摇匀，40℃保温10min；

（4）取出试管，3支测试管中各加入2ml三氯乙酸，空白管中加1ml酪素；

（5）静置10min，过滤沉淀；

（6）各取1ml滤液，分别加0.4mol/L的Na2CO35ml、福林试剂1ml。

在40℃显色20min。

680nm处测OD值。

以空白管调零点。

注：

中性蛋白酶制剂和酸性蛋白酸制剂，除反应与显色温度为30℃±0.2℃外，其他操作同上，标准曲线做同样处理。

四、计算

酶活定义：

1g固体酶粉（或1ml液体酶），在40℃（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、碱性pH=10.5）条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位。

计算酶的活性单位依据以下公式：

　　蛋白酶的活力=A×K×4/10×nUg/（ml）

　　　　A：

样品平行试验的平均OD值

　　　　K：

吸光常数

　　　　4：

反应试剂的总体积

　　　　10：

酶解反应时间

　　　　n：

酶液稀释总倍数

待解决的问题：

碳酸钠溶液的作用

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