单抗的制备纯化和鉴定.docx

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单抗的制备纯化和鉴定

单抗的制备、纯化和鉴定

一、实验目的：

单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。

了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。

二、实验原理：

骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。

将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。

经在HAT培养基[含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。

只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。

三、试剂与器材：

细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。

四、操作方法：

1、抗原制备；　

一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。

A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。

一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。

B.颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。

例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。

有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。

2、免疫动物；

目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。

就品系而言以Balb/c小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。

Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。

大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。

现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人杂交瘤技术。

免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。

正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1.0×107~5.0×107种不同的抗体。

因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。

所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。

B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。

有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，虽然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。

故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。

3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；

脾细胞制备

（1）免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠，拉颈或用CO2处死小白鼠。

（2）将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。

（3）把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。

（4）用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。

（5）直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。

（6）以2.5％FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）。

（7）把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。

（8）重复⑹、⑺步骤。

（9）计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。

骨髓瘤细胞制备

骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。

选择骨髓瘤细胞的条件：

①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；④生长速度快，繁殖时间短。

目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：

①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（简称SP2）；③P3/X63-Ag8.653（X63-Ag8.653）（简称653）；④FO

以653最为常用，它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（MinerolOilplasmacytoma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。

骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。

由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。

为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml8－氮鸟嘌呤。

取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再悬浮并计数。

饲养细胞

在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feedercell）。

在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。

许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。

应用腹腔渗出细胞的好处是：

一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。

腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。

也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。

（1）拉颈处死小鼠。

（2）70％酒精浸泡消毒10min。

（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。

（4）用注射器将4ml11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。

（5）1000r／min离心10min。

（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。

台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。

（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。

如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。

4、细胞融合；

　　小鼠骨髓瘤可以在体外培养液中生存并大量繁殖。

经过用某种抗原免疫的小鼠及淋巴细胞能分泌某种抗体，但小鼠的B淋巴细胞在一般培养某中不易存活。

如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗体的B淋巴细胞在融合因子（聚乙二醇，PEG）作用下产生融合，则融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性，又具有B淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，在HAT选择培养基中可以选择得到杂交细胞。

这种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中大量繁殖生长，从培养液上清中可以收集到大量某B淋巴细胞产物——单克隆抗体。

（1）、取末次免疫后的第3天小鼠脾细胞悬液，将108小鼠脾细胞与1-5×107Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞混合于50毫升刻度离心管中，经1000转/分离心7分钟；

（2）、弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37℃水中进行水浴（一小烧杯中），准备融合；

3）、将37℃水浴中保温的50%PEG1.0毫升（实际应用0.7毫升）用滴管缓慢滴入离心管中，在60秒钟内滴完，在37℃水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；

4）、加完PEG后，将细胞悬液放在37℃水浴中静置90秒钟，立即在2—4分钟内加入15毫升无血清的RPMI-1640培养基（37℃），开始要一滴一滴地加，由于稀释使PEG停止作用。

注意尽可能不搅动细胞；

5）、再经100转/分离心10分钟。

弃去上清液，加25毫升HAT培养液，轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个24孔培养板中，每孔0.5毫升；

6）、将培养板放在水蒸汽饱和CO2孵箱中，37℃孵育。

CO2含量为5%；

7）、每2—3天换一次HAT培养液，连续2周观察杂交瘤细胞是否出现。

2周后使用HT培养基。

5、杂交瘤细胞的选择培养；

一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。

HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。

　　因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。

所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。

我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。

　　50×HAT

　　H:

　5×10-3M

　　A:

　2×10-5M

　　T:

　8×10-4M

　　一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。

6、杂交瘤细胞的筛选

筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。

一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

　　检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

　　常用的方法有:

　　1.　ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。

　　2.　RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。

　　3.　FACS（荧光激活细胞分类仪）用于检查细胞表面抗原的McAb检测。

　　4.　IFA用于细胞和病毒McAb的检测。

　　上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。

　　可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

7、杂交瘤细胞的克隆化

   克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。

犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。

在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。

要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。

克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。

即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

（一）　克隆化方案

　　用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。

　　1.　有限稀释法的程序

　　①　制备饲养细胞悬液（同融合前准备）

　　②　阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml

　　③　取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。

余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。

余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。

　　④　培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。

　　⑤　第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。

　　注:

初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。

　　2.　软琼脂法

　　①　软琼脂的配制

　　含20％FCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640

　　1％琼脂水溶液：

高压灭菌，42℃预热。

　　0.5％琼脂：

由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。

置42℃保温。

　　②　用上述0.5％琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。

　　③　按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。

　　④　1ml0.5％琼脂液（42℃预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。

　　⑤　混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。

　　⑥　4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。

　　⑦　检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。

8、单克隆抗体的检定；

对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。

应对其做如下方面的鉴定:

　　1.　抗体特异性的鉴定：

除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。

例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。

②　制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。

　　2.　McAb的Ig类与亚类的鉴定：

一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。

如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。

至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。

在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3％），将有利于沉淀线的形成。

　　3.　McAb中和活性的鉴定：

用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。

例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

　　4.　McAb识别抗原表位的鉴定：

用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。

　　5.　McAb亲和力的鉴定：

用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。

9、分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

1．杂交瘤细胞的冻存　　及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。

因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。

如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。

　　杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以装一支安瓿冻存。

　　细胞冻存液：

50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。

　　冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。

冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。

也可用细胞冻存装置进行冻存。

冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

　　2．细胞复苏方法　将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5%CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。

10、单克隆抗体的大量制备

大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：

　　1.　体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。

但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产，费用较高。

　　2.　体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

　　①　实体瘤法　对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml,共2～4点。

待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg／ml。

但采血量有限。

　　②　腹水的制备　常规是先腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或液体石腊于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。

也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。

腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。

11、单克隆抗体的提纯

1．材料

（1）20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液20mMol/LNaCl

（2）20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液40mMol/LNaCl

（3）20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液80mMol/LNaCl

（4）20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

（5）饱和硫酸铵液

（6）DEAE—纤维素柱

2．操作方法

（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00×105转离心30min，去沉淀。

（2）在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50％硫酸铵浓度。

（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5000r/min离心10min，去上清。

（4）将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液（40mMol/LNaCl）中（溶液可能混浊）。

（5）装入透析袋于Tris－HCl缓冲液（20mMol/LNaCl）中透析除盐。

（6）离心去沉淀。

（7）溶液稀释（1:

100或更高倍稀释）后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量

1A280unit=0.8mg蛋白质

一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg~36mg。

（8）过DEAE—纤维素柱：

纤维素柱高40cm，以20mMol/LNaClTris缓冲液平衡。

透析样品以Tris缓冲液等量稀释。

样品进入柱床速度为1ml~2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。

大部分单克隆IgG于40mMol/L和80mMol/LNaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120mMol/L~150mMol/LNaCl洗脱。

测OD280nm收集蛋白峰，单克隆IgG保存备用。

杂交瘤产生各种免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫程序。

免疫一次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞。

免疫多次的多为IgG。

12、影响因素、失败原因分析

由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。

　　其主要失败原因和影响因素有:

　　1.　污染：

包括细菌、霉菌和支原体的污染。

这是杂交瘤工作中最辣手的问题。

一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。

支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。

在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。

对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖^菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。

　　2.　融合后杂交瘤不生长：

在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。

②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。

③骨髓瘤细胞污染了支原体。

④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。

　　3.　杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体

　　①　融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。

　　②　有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。

　　③　对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。

也可能发生染色体丢失。

Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。

　　三要:

　　要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。

　　要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。

　　要定期进行再克隆。

　　三不要:

　　不要让细胞“过度生长”。

因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。

　　不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。

　　不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。

　　4.　杂交瘤细胞难以克隆化

　　可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。

若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。