原子光谱在制药行业测定药物中微量元素的应用.docx
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原子光谱在制药行业测定药物中微量元素的应用
原子光谱在制药行业测定药物中微量元素的应用
摘要
由于现代分析仪器已经赋予分析工作与医药产品相关的具体、准确、有意义的信息，在过去的10-15年里，对不同元素进行的分析，包括金属元素和非金属元素，在制药行业中已经变得越来越重要。
有了毒理学数据做依据，药典和监管机构重新审视了测定药品中金属和非金属的传统方法，分析师已经开始采用原子光谱技术来满足他们分析的需求，例如，火焰-石墨炉原子吸收光谱法（FAAS,火焰AA或FAA和GFAAS）、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）。
新技术，如激光诱导击穿光谱（LIBS）和激光消融等离子质谱（LAICP-MS）在制药行业元素分析中的应用也越来越广泛。
本文将提供原子光谱在分析药品、原料药、原料和药物中间体中金属和非金属的不同应用。
而原子光谱在分析临床样本、食品营养、代谢和药物代谢动力学样本中金属和非金属的应用在本文中将不会提及。
1前言
1.1概述
多年来，各种元素的毒性早已众所周知并且被记录下来。
早在公元前二世纪，大家就已经知道接触到铅这种元素对人体是有害的，据说，中国的一个皇帝嬴政就死于汞中毒，当时他企图服用含汞的丸药来达到长生不老的目的。
毒理学家继续研究元素对人体的影响，并且在安全数据的基础上修改了安全限制，从而导致了测定药品中各种元素含量的需要。
一百多年来，测定美国销售的药品的标准，只是美国药典中第231章中的重金属元素测试。
美国药典第一章的目的是作为筛选有限种类元素的工具，随着时间的推移，这一程序已被修改，旨在提高其性能以提供更可靠的信息。
目前美国药典第231章的重复部分中，重金属元素是基于被测元素的硫化物沉淀，并假设样品与标准铅相比较有着相似的的行为。
当美国药典中首次出版重金属元素的测定方法时，制药中多数考虑的元素与锑（Sb），砷（As），镉（Cd），铜（Cu），铁（Fe），铅（Pb）和锌（Zn）有关，并没有验证执行，这种方法只是作为一种筛选工具。
在当前的章节里，美国药典第231章甚至没有提供具体元素的信息，定量的信息也同样没有提及。
结果被报告为极限测试。
此外，虽然美国药典第231章被列为“重金属元素”一章，但是并没有明确界定哪些元素可以用这种方法进行检测。
更没有国际公认的“重金属元素”的定义，这就使得美国药典第231章理解和使用起来相当的复杂。
除了美国药典第231章讲重金属元素的一章以外，美国药典中还有一些其他关于分析金属和非金属元素的章节。
一般章节像第241，251，261，291，591，和206章，分别提供了关于铁，铅，汞，硒，锌，铝的测定方法。
第191章，一般药物鉴别实验，提供了铝，锑，钡，铋，钙，钴，铜，铁，铅，锰，锂，镁，钾，钠，锌和汞的鉴别方法。
然而，其中的一些实验并没有仪器基础，并且提供足够分析信息的能力有限，在一些情况下只能给出定性的信息。
1.2目的和范围
随着现代仪器技术不断发展及成熟，提供元素的定性和定量信息已经成为可能，这些元素包括药品中的金属（包括过渡金属，其他金属或过渡后金属，碱金属，碱土金属，内过渡元素）和非金属（硼（B），硅（Si），锗（Ge），砷（As），锑（Sb），碲（Te），钋（Po））。
随着对药品中元素更快更具体的信息的需要逐渐增加，化学分析家更加频繁地倾向于使用原子光谱技术，来提供药物开发过程中各阶段金属和非金属含量的有关信息。
本文将着重分析使用原子光谱技术医药原料（药品，活跃的药学成分（原料药），原料及中间体）中金属和非金属的信息。
包括简要讨论工具技术，方法开发和验证方法。
1.3分析物的利益和限制
虽然元素分析长期以来盛行于医药工业，但是对于金属或非金属是否应该被检测，在这一行业还从未有过统一意见。
各种药典都提及“重金属元素”，但是这一概念是个误导词，因为这个词并没有一个为大家统一接受的定义，很难为被测物建立一种常规的检测方法。
在他的论文里，重金属这个词，Duffus强调了不同的途径来将元素分类，使重金属成为一个独立的族群，这些途径包括原子量，原子数，密度，化学性质，毒性。
Duffus得出结论，没有任何一个权威机构给“重金属元素”一个明确的定义。
虽然美国药典第231章的目的是为了筛选铜，铁，锑，砷，镉，铅和锌，其他元素如汞，银，铂，钯，处于其他原因，在制药行业也有重要的意义。
此外，在某些情况下，药典中的方法被证明是无法测定某种金属的，例如汞。
欧洲药品评价局（EMEA）试图提供一些该行业关于分析物利益的指导，以及一些基于那些元素安全性方面的限制，已经发布了关于金属催化剂残留限制的指导。
这个EMEA指导方针旨在涵盖反应过程一部分的元素（催化剂），表1中提供。
最近，为了解决哪些元素应该被检测的问题，以及哪些限制是可以接受的问题，美国药典提出了两种方法，232和233。
这些元素和限制是在毒理学研究的基础上被美国药典提出的。
参考EMEA指导方针，许多元素不包括在拟议的232章中，但是美国药典的章节并不仅仅是为了声明在生产和制药中增加了哪些元素，同样也可能找到那些再生产过程中无意中进入药品中的元素。
尽管如此，美国药典提出的第232章在很大程度上与EMEA的每日允许风险（PDE’s）相和谐。
除了以下的偏差：
EMEA指南不包括砷，镉，铅，汞的信息，美国药典第232章不包括关于铁，锌的信息。
美国药典第232章允许使用任何样品制备过程和分析方法，满足了章节里的验证需求。
拟议的一章为样品制备提供了指导，在过程中使用任一电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）或电感耦合等离子体质谱（ICP-MS），而没有固定的方法。
在特定样品中关于分析物的限制都基于232章提出的PDE’s，同样也基于每日剂量。
由于这个原因，对于特定药品的限制必须由分析师给出。
1.4原子光谱技术
几种不同的技术，包括原子光谱法，火焰原子吸收光谱法（FAAS），石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS），电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）电感耦合等离子体质谱（ICP-MS），在不同样品中分析金属和非金属含量方面已使用多年，其中包括医药化合物。
在这些常见的原子光谱技术中，火焰和石墨炉原子吸收光谱，根据朗伯-比尔定律，相较于ICP-AES或ICP-MS而言，更加长久地用于药品中金属或非金属元素的分析。
FAAS被认为不如GFAAS敏感，FAAS在较低的含量如百万分之一（ppm,w/w）敏感，GFAAS在较低的含量如十亿分之一（ppb,w/w）时敏感，前者通常需要毫升单位的样品，而后者需要微升单位的样品。
FAAS通常是二者中较昂贵的技术，也比GFAAS需要较少低技能水平的分析师。
采用火焰原子吸收光谱分析可以比采用更费时的石墨炉原子吸收光谱法更快。
忽略技术因素，火焰和石墨炉原子吸收光谱技术，都需要为每个样品使用一个中空的阴极（HCL）或无电极放电灯（EDI）。
ICP-AES和ICP-MS，同样也适用于多种类型的样品，在近几年已经越来越多的应用于制药行业。
这两种技术都能够快速、多元化分析，ICP-MS有更高的敏感性，通常到每兆单位，而ICP-MS则在百万分之一到十亿分之一单位之间，存在更多潜在的光谱干扰。
ICP-AES和ICP-MS的分析技术优于FAAS和GFAAS，这四者中ICP-MS需要最高的技术水平。
ICP-MS非常适用于气象色谱（GC），同样，作为部分进样系统也适用于液相色谱（LC）。
此外，在这几种技术中ICP-MS的仪器技术最昂贵，它的消耗也是最昂贵的。
除了这些更常用的原子光谱技术，激光烧蚀电感耦合等离子体光谱法（LA-ICP-MS）和激光诱导击穿光谱（LIBS）在分析药物化合物的金属和/或非金属中也开始有更多的使用，虽然他们仍然在医药工业中没有广泛使用。
二者都是固体样品技术，所以不需要或者很少需要进行样品制备。
这些技术中的困难包括缺乏适当地固体标准，使用激光诱导击穿光谱时缺乏现成的，随时可用的仪表。
2原子吸收光谱
2.1火焰原子吸收光谱法（FAAS）
在火焰原子吸收光谱法中，液体样品是通过喷雾器送气到火焰的。
在雾化器中，样品转化为雾，水滴和雾的混合物很容易在火焰中燃烧。
火焰提供了一种中性原子或分子的来源以吸收能量，同时分解或原子化样品。
最常用的火焰是空气/乙炔火焰，燃烧的温度范围是2120-2400℃，而一氧化二氮的火焰，可能有助于破坏氧化物可以形成，燃烧的温度范围是260-2800℃。
一种在形式上连续的外部光源，无极放电灯（EDL）或空心阴极灯（HCL），用于发射谱线以提供能量使得样品从基态跃迁到激发态，与喷入火焰的分析物样品浓度成正比。
2.2石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS）
在石墨炉原子吸收光谱中，样本（通常是液体）通过一个小开口放进加热石墨管中沉积，被称为mini-massmann炉。
在炉中，作为样本室，当炉管被加热时中性原子或分子从基态激发，从而加热样品。
样品可能直接沉积到石墨炉壁上，或者沉积在石墨炉内部的一个被称为L’vov的小石墨平台上。
采用的一系列加热步骤包括干燥，炭化或灰化，雾化和清理。
根据样品的性质也可能使用其他的加热步骤。
在雾化步骤，石墨炉被快速加热到很高的温度（通常达到炽热），通常在2500–2700℃。
炉管中样品的瞬态吸收信号是由原子化的分析物产生和控制的。
在火焰AA中，朗伯-比尔定律被用于考证分析物浓度与吸收讯号的关系。
在石墨炉原子吸收光谱中可能发生光谱干扰，为了克服这项缺陷，不同的背景矫正方法已经出现了多年。
2.3电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）
电感耦合等离子体原子发射光谱在一个给定样本中使用氩等离子体激发和电离元素。
这种等离子体的温度一般范围是6000到10000k。
样品通过喷雾器吸进了等离子体，通过喷雾室产生小水滴，然后通过中心管以及同心的火炬。
样品在等离子体的高温下发生溶解、蒸发、雾化和电离。
氩等离子体的原子和电子的碰撞激发出分析物的原子。
激发态的原子释放出不同频率的光，给定样品的能量释放是特定的。
光强度与分析物浓度成正比。
由于有成千上万的潜在发射谱线，分析过程中分析物波长的选择是至关重要的。
2.4电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）
像电感耦合等离子体原子发射光谱一样，电感耦合等离子体质谱在一个给定样本中使用氩等离子体激发和电离元素，样品的产生系统与电感耦合等离子体原子发射光谱一样。
然而电感耦合等离子体质谱使用质谱检测，而不是基于波长检测。
近年来，电感耦合等离子体质谱已经有了多种应用。
四级质谱仪更常用，然而特定时间的迁移作为一种高分辨率的工具是可用的。
随着等离子体中产生的离子进入质谱仪，离子在磁场中根据质荷比（m/z）被分离开。
从理论上讲，由于样品受到等离子体的加热而减少其离子成分，电感耦合等离子体质谱的质量变化通常涵盖了从6到240个原子质量单位（amu）。
因此，这就提供了一个相对于电感耦合等离子体原子发射光谱的优势，那就是电感耦合等离子体质谱存在较少的潜在干扰。
干扰的本质在于电感耦合等离子体质谱中多荷粒子、氯化物和多原子在等离子体中形成的干扰。
仪表技术以及仪表参数的选择可能对减少干扰有所帮助，这主要取决于样本。
2.5固体分析技术：
激光烧蚀电感耦合等离子体光谱法（LA-ICP-MS）和激光诱导击穿光谱（LIBS）
激光烧蚀电感耦合等离子体光谱法和激光诱导击穿光谱可用于固体样品的分析，可以较少的甚至不用进行样品的准备，在有限的基础上已经使用多年。
对于这两种技术，各种各样的激光均可用，基于分析需要进行激光筛选。
激光诱导击穿光谱中，激光聚焦于固体样品表面，当激光的功率足够时，样品会蒸发，在激发态释放出不同种类的中性原子或电子。
与激光烧蚀电感耦合等离子体光谱法相比，激光诱导击穿光谱是一种比较基础的技术，因为它是一种固体样品技术，激光诱导击穿光谱可用于深度剖析样品和元素的映射。
除了在必要时可以和电感耦合等离子体原子发射光谱联用以外，激光烧蚀电感耦合等离子体光谱法非常类似于激光诱导击穿光谱。
激光束集中到固体样品的表面，引起固体样品表面材料的分解和蒸发，一个氩运载体用来将这些材料运送到等离子体内，在那里进行雾化和电离。
像激光诱导击穿光谱一样，激光烧蚀电感耦合等离子体光谱法也可用于深度剖析样品和元素的映射。
激光烧蚀电感耦合等离子体光谱法和激光诱导击穿光谱都有很好的灵敏度（ppm到ppb），但是对于真正的定量分析来说，合适的固体标准是必需的。
虽然这种标准可能买不到，但是准备还是可能的，彻底的混合是绝对必要的。
2.6冷蒸气和氢化物生成技术
冷蒸气和氢化物生成技术在测定汞时是非常常用的，或者是测定一些易形成氢化物的元素如锡、砷、硒、锑、铋。
这两种技术都可以和以解决方案为基础的原子光谱联用。
通过冷蒸汽发生法测定汞时，用化合物减量法来产生原子，冷蒸汽被惰性气体扫进火焰或者等离子体中。
在氢化物形成技术中，与硼氢化钠和盐酸反应生成目标分析物的氢化物。
这两种技术都极其灵敏，根据样品和实验室环境影响，检测限在ppb到ppt之间波动。
3应用
由于应用于制药工业的原料药（API’s）、原料和中间体的制造商在理论上可以在合成过程中使用元素周期表中的任何一种元素，生产中用到的药品和原材料可能接触到各种材料，包括与合成无关的元素和合成中的添加剂，忽略它们是否收录在EMEA指南或者美国药典232和233章中。
各种各样的金属盒非金属应用于制药工业，其中的一些也作为药物的活性成分（API）使用。
表2提供了药物制剂中金属组分的例子。
很多其他的金属和非金属元素，虽然它们在药物制剂产品中并不代表重要成分，但是它们在药品合成过程中可能作为试剂和催化剂使用。
钯（Pb）和铂（Po）是制药行业中常见的催化剂。
除了那些应用于药品合成的金属和非金属之外，其他的金属或非金属应该考虑其毒性。
就像铅，汞，砷和镉，这是，正如以前提到的，EMEA指南强调的以及美国药典232章提出的关于金属催化剂残留的问题。
因为金属和非金属元素进入药品中有多种途径，制药行业对开发过程中的各个阶段进行元素监控都很感兴趣。
由于API评估的减员率很高，有价值的资源根据特定化合物开发的阶段被分配。
因此，分析需求，分析金属或非金属元素的需求，极大地取决于开发的不同阶段。
早期发现和临床前化合物通常只需准备极有限的量，所以分析测试只局限于基本测试。
一种化合物通过开发过程进入到临床阶段，分析测试变得更加需要，金属元素的测试不仅仅在原料药中实施，也包括在原材料、中间体甚至仪器设备中进行测试。
使用原子光谱分析不仅局限于原料药，同样也应用与清洁验证和药物的指纹图谱鉴定。
此外，原子光谱技术也和其他的分析技术联用来为制药化学家提供药品中金属元素含量的有效信息，使用高通量筛选来评估制剂产品和过程中间体。
随着制药工业的扩展，列入了生物源性化合物作为他们的投资对象，应用原子光谱技术来评估这些类型样品中的含量得到越来越多的关注。
此外，工业上聚焦于大容量注射剂（LVP’s）中金属元素含量，鉴别或者指纹识别假冒伪劣药物。
单包装中元素的含量和药物的容器对于工业生产也很重要。
由于这些原因，原子光谱各种不同技术的应用不再局限于一种方法在药典中是否可用或适用。
原子光谱在制药行业中应用时分析物的量只局限于给定分析中技术的选择和灵敏度要求。
在任何情况下，应用EMEA指南或者美国药典232章，很明显，传统的极限测试法再也不能满足制药行业或者病人的需求。
表3提供了一个更全面的关于测定药物中金属或非金属元素相关文件的清单。
4样品制备技术和验证方法
4.1固体样品的消化和直接稀释
因为潜在分析物和样品的种类都很多，没有那一种样品制备技术可以适用于任何分析。
样品制备的形式可以是通过直接稀释，酸消化，使用泥浆，或固体样品分析，对于广泛的样品类型并不需要进行样品制备。
比识别一种适用于所有样品的单个的样品制备技术更重要的是一种适用于特定样品和在所需水平内特定的目标分析物的制备技术。
一般来说，除非分析方法包括直接分析固体样品，医药样品需要在溶液中以便进行分析。
从历史上看，原子光谱学领域的分析师们发现，采用一些酸消化的形式来更准确的为元素分析制备样品是很重要的。
进行酸消解时，至关重要的是用于消解样品的酸中不含有样品中所含的金属或非金属元素。
超高纯度酸，元素浓度范围在ppb到亚ppt范围内的，是现成可用的，并且虽然它们比差质量的酸更贵，但是它们是分析成功的关键。
消解可以使用以下几种方式：
开放式容器，封闭的容器，微波辅助（主要是高温高压力），热板。
消解时通常会涉及到酸的使用，原子光谱法中最常用的是硝酸，然而盐酸，硫酸，与氢氟酸也使用。
过氧化氢，在超高纯度，也常用来辅助消解有机样品。
消解技术的选择和酸或组合酸和过氧化氢依赖于样本混合物的性质，同样也取决于分析物的性质。
一些元素，例如汞，在消解条件下是挥发的，在开放的容器中进行消解可能是不适当的。
一些样品如果不在高温高压下可能不会消解，所以可能需要微波辅助进行消解。
当一个完全消解的过程需要用到过氧化氢时，在样品用硝酸进行预消解后不能加入过氧化氢，因为过氧化物与有机物反应可能爆炸。
尽管对样品中的元素进行准确分析时有时可能用到酸消解，但它并不总是必需的。
最简单的样品制备技术是直接稀释法，将样品溶解在某种溶剂中进行分析。
对于许多药物来说，直接稀释法为样品制备提供了一种消解的替代法。
忽略样品直接稀释法中溶剂的选择，所有的分析方法--样品，标准溶液和空白溶液—都必须尽可能的与基质互相匹配。
这可能对将基质的影响最小化有所帮助。
当分析中用直接稀释法制备样品时，必须注意分析物中不会引入所使用的溶剂中潜在的污染物。
由于在样品，标准溶液和空白溶液的制备中水扮演了重要的角色，水的质量极其重要。
去离子水的电阻率至少在18MΩcm（电导率=0.056μscm-1）。
在酸消解中使用的酸，使用酸的例子，含有ppt和亚ppt浓度元素的超高纯度酸是可以用的，而且只要有可能就应该努力用这些酸。
然而，有机溶剂并不适用于已验证的低浓度金属元素或非金属元素，所以在用直接稀释法制备样品时必须注意考虑有机溶剂的选择。
4.2元素分析的分析方法
分析药物中金属元素的主要分析方法还是涉及FAAS，GFAAS，ICP-AES，或者ICP-MS。
美国药典第851章，分光光度法和光散射为分析师在制药过程中使用原子吸收法提供了指南。
一些美国药典中的方法使用火焰原子吸收。
各种各样的药品已经对多种元素进行了检测。
其中包括市售儿童糖浆中铅和镉的含量以及片剂中镁的分布。
一原子吸收为基础的技术同样也被用来间接测定药品如环丙沙星，阿莫西林和双氯芬酸钠。
尽管元素分析有更灵敏，更多功能的技术，以原子吸收为基础的方法仍然常用于制药工业。
虽然工业上已经应用这些技术对药品中的元素进行分析，美国药典2004年出版的等离子光谱总章第730页，进一步促进了使用ICP-AES和ICP-MS在制药行业中对药品进行元素分析。
2010年出版的美国药典第232和233章中进一步强调了ICP-AES和ICP-MS在制药工业中的应用。
出版的结果是，分析行业的人士也在寻找其他技术进行元素分析。
一些技术如激光诱导击穿光谱技术（LIBS），在药品元素分析中已经得到了更广泛的应用。
虽然一些初步的工作在液体样品中完成，激光诱导击穿光谱技术在药物分析中的大量工作以对完整固体样品进行分析为中心，同样也重视片剂的包衣和混合均匀度。
4.3方法验证的考虑
分析技术的选择很大程度上取决于样品基质的性质，实验室中可用的分析工具，可用的样品材料的量，所需的分析物和所需分析方法的灵敏度。
各种分析技术和仪器的可用性，以及各种样品制备技术和样品类型的多样性，使得为分析方法开发和验证选择合适的分析方法尤为重要。
不适当的样品制备不能被一种多用途的分析技术抵消，在一个特定的实验室中分析仪表也可能受限。
在一些情况下，只有酸消解能够提供正确的结果，如果用直接稀释法代替，验证是否得到了准确的结果是很重要的。
确定药品中可接受的元素含量水平，不仅仅取决于金属的毒性，同样也取决于产品质量—无论是美观和实用性。
例如，即使是微量的铁，也可能会改变原料药的颜色。
随着对大分子药物研究的增加，元素对蛋白质和酶活性和稳定性的重要性将导致生物制剂产品中元素分析的增加。
在对微量元素进行方法验证过程中，遵循国际协调会议（ICH）和美国药典的需要是很关键的。
方法验证的关键点中有一点是方法的灵敏度，必须很好的阐释说明。
当分析物的浓度很高时，方法的灵敏度将不再是问题，然而准确性，精密度和稳定性仍然很重要。
特别重要的是，无论研究微量的或者高浓度的样品，都表明了不能显示出光谱干扰，这就可能导致错误结果的出现。
此外，研究分析物的回收率也是很重要的。
验证方法的准确性和充分的回收率可能使用标准加入法。
除此之外，方法的精密度也需要对相对标准偏差进行研究。
稳定性也同样需要进行研究，这需要多天，多个分析师和多种仪器对结果进行分析。
5结论
从产品质量和用药安全性的角度来看，对药品进行元素分析的需要变得越来越重要。
分析中带来的挑战和分析物基质使得样品制备技术的选择成为分析成功的关键。
可用的分析仪器技术多种多样，从更加成熟的火焰技术到石墨炉原子吸收光谱到更新的技术，像电感耦合等离子体质谱，使检测从亚ppb到百分浓度的所有元素成为可能。
展望未来，药品中可接受的元素含量的限制可能会减少，而不是增加，因此得出结论，更高灵敏度的技术像电感耦合等离子体质谱开始在药品元素分析中扮演重要的角色。
此外，固体样品技术也将在药品元素分析中扮演重要的角色。
各种分析技术的多样性是分析师能够面对制备样品基质的挑战，降低了药品安全性和质量问题的检测限。
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