五肉的品质评定及其超高压处理技术.docx

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五肉的品质评定及其超高压处理技术

动物性农产品加工

实验指导

（自编教材）

聊城大学农学院实验管理中心编印

实验一双水相萃取法富集分离螺旋藻藻蓝蛋白的研究

一、实验目的

让学生掌握双水相体系的构建和天然产物的提取方法。

二、实验要求

（1）上课前应阅读本任务书中相应的部分，明确实验的内容和要求。

（2）根据实验内容阅读教材中的有关章节，弄清基本概念和方法，使实验能顺利完成。

三、实验原理

双水相系统是指某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，Albertsson于20世纪50年代后期开发了双水相萃取法。

70年代以后，众多科学家发展了双水相萃取技术在生物分离过程中的应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离与纯化开辟了新的途径。

四、实验材料、仪器和试剂（粗五号字宋体）

螺旋藻、PEG4000、硫酸钠、氯化钾、分光光度计、50ml量筒4个、500ml烧杯4个、电子天平、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O

五、实验步骤或方法

1、螺旋藻细胞的破碎及其含量计算

准确称取0.5g螺旋藻粉，加入100mLpH为7.0的0.01mol/L的磷酸缓冲液，采用反复冻融（3次）的方法对藻体细胞进行破碎，在显微镜下观察计数细胞破碎率可达到90%以上。

将破碎的螺旋藻细胞悬浊液于4000r/min离心20min，倾倒上清液可得到含藻蓝蛋白的粗提液。

测粗提液在620、650nm下的吸光度，计算藻蓝蛋白的含量。

螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其检定的标准。

藻蓝蛋白（PC）在620nm处有最大光吸收值，其含量测定计算方法如式

（1）所示。

藻蓝蛋白的纯度为溶液在620和280nm的吸光度的比值。

PC=0.1425*A620

（1）

其中，藻蓝蛋白的质量浓度（g/L），A620代表波长在620nm处的吸光度。

2、相图的绘制

准确称取质量分数为50%的PEG原液于试管中，加入19%硫酸钠原液，混合，直至试管开始出现混浊为止，计量加入硫酸钠的量，再加入适量水，使体系变澄清，计量加入的水，并继续加入硫酸钠，使系统再次变混浊，如此反复操作，计算达到混浊时PEG和硫酸钠在系统中的质量分数，得出PEG和硫酸钠的相图。

3、双水相萃取方法

在粗提液中加入一定量的PEG和无机盐，充分振荡使成相物质溶解，同时完成了藻蓝蛋白在双水相系统中的分配过程。

此双水相系统静置一定时间，当两相达到相分离，分别用移液管抽取上下相的溶液，在波长280、620、650nm下测吸光度，计算藻蓝蛋白的质量浓度和纯度。

最佳提取条件为：

12%PEG4000、15%Na2SO4、1%KCl。

六、实验结果及数据处理（或实验图像、现象等）

藻蓝蛋白收率、分配系数经双水相系统萃取过的螺旋藻细胞破碎液（粗提液）中，藻蓝蛋白富集于双水相系统的上相中,因此计算藻蓝蛋白收率（E）、分配系数（K）如下式:

式中的V代表溶液体积，下标0,t,b分别代表粗提液、萃取后双水相系统上相和下相的溶液。

绘制PEG-硫酸钠双水相相图，并计算藻蓝蛋白收率（E）、分配系数（K）。

七、思考题

1、双水相体系的原理是什么？

2、双水相相图的作用是什么？

3、双水相萃取法与什么优点？

参考文献：

刘杨,王雪青,庞广昌,谢卓峰.双水相萃取法富集分离螺旋藻藻蓝蛋白的研究.海洋科学,2008,32（7）:

30-37.

附录：

磷酸盐缓冲液（PhosphateBuffer,PB）

试剂：

NaH2PO4·2H2O  Na2HPO4·12H2O

配制方法：

配制时，常先配制0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PB），根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。

（1）0.2mol/L的Na2HPO4；称取NaH2PO4.2H2O31.2g（或NaH2PO4·H2O27.6g）加重蒸水至1000ml溶解。

（2）0.2mol/L的Na2HPO4：

称取Na2HPO4.12H2O71.632g（或Na2HPO4·7H2O53.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g）加重蒸水至1000ml溶解。

（3）0.2mol/LpH7.4的PB的配制：

取19ml0.2mol/L的NaH2PO4和81ml0.2mol/L的Na2HPO4·12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PB（pH约为7.4～7.5）。

若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。

0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.7～8.0）

pH 0.2mol/LNaH2PO4（ml） 0.2mol/LNa2HPO4（ml）

5.7     93.5           6.5

5.8     92.0           8.0

5.9     90.0          10.0

6.0     87.7          12.3

6.1     85.0          15.0

6.2     81.5          18.5

6.3     77.5          22.5

6.4     73.5          26.5

6.5     68.5          31.5

6.6     62.5          37.5

6.7     56.5          43.5

6.8     51.0          49.0

6.9     45.0          55.0

7.0     39.0          61.0

7.1     33.0          67.0

7.2     28.0          72.0

7.3     23.0          67.0

7.4     19.0          81.0

7.5     16.0          84.0

7.6     13.0          87.0

7.7     10.5          89.5

7.8      8.5          91.5

7.9      7.0          93.0

8.0      5.3          94.7

实验二超滤法生产大豆浓缩蛋白

一、实验目的

让学生掌握超滤方法大豆分离蛋白的制备方法。

二、实验要求

（1）上课前应阅读本任务书中相应的部分，明确实验的内容和要求。

（2）根据实验内容阅读教材中的有关章节，弄清基本概念和方法，使实验能顺利完成。

三、实验原理

目前应用于食品的大豆蛋白有大豆浓缩蛋白和大豆分离蛋白,目前膜分离已经应用于这

两种大豆蛋白的生产中。

膜分离过程没有相变,能够保持天然蛋白质的物理化学特性;超滤能够截留传统生产工艺中流失的清蛋白,提高蛋白质回收率。

与冷冻干燥、蒸发相比，膜分离能耗较少；根据实际应用的需要膜分离可以在低温、常温和较高的温度下进行。

四、实验材料、仪器和试剂

大豆粕、氢氧化钠、电子天平、超滤设备、磨酱机

五、实验步骤或方法

1、实验步骤：

低温脱脂豆粕→稀碱浸提（料液比1:

15，在400r/min下搅拌30min，调pH值8.0）→离心分离（在3500r/min下离心15min，保留上清液）→沉淀重复上面的步骤→预处理（过60目尼龙滤筛）→超滤→蛋白浓缩液。

2、工艺要点：

1）、将大豆粕干法粉碎至40-60目，然后加水混合，用磨酱机磨细。

2）、第一次浸提时加水为大豆重的15倍，前后两次浸提的加水比例以1.5：

1较好，用氢氧化钠将浸提液的pH值调到8.0，进行搅拌30min。

3）、超滤。

六、实验结果及数据处理

记录实验过程和实验过程中的现象。

七、思考题

1、超滤的原理是什么？

2、超滤过程受什么因素的影响？

3、超滤在食品中的应用。

实验三猪胰脂肪酶的分离纯化及其性质研究

一、实验目的

本实验主要对学生进行酶的分离纯化、酶的鉴定、酶活性和特性等分析技术的训练。

使学生在大学四年当中可以得到良好的科学素养的熏陶和科学兴趣的培养，并让其中一些基础好、有潜力的本科生通过循序渐进和适当的学习和训练，具备从事科研工作的基础知识能力和前沿洞察力，使学生的知识、能力和素质全面协调发展。

二、实验原理

采用层析设备纯化脂肪酶，并鉴定脂肪酶，测定脂肪酶的活性。

三、实验要求

（1）上课前应阅读本任务书中相应的部分，明确实验的内容和要求。

（2）根据实验内容阅读教材中的有关章节，弄清基本概念和方法，使实验能顺利完成。

四、实验材料、仪器和试剂

新鲜猪胰脏、SephadexG-100、低温离心机、真空冻干机、层析工作站系统、低温层析柜、紫外分光光度计、磁力搅拌器、真空泵、聚乙烯醇、橄榄油、酚酞、透析袋、罗丹明B、硝基苯酚、异丙醇、无水乙醇等。

五、实验步骤或方法

1、粗猪胰脂肪酶的制备

取新鲜猪胰脏50g切成薄片，用组织捣碎机搅成胰浆，加入pH8.00.2mol/L磷酸盐缓冲液250ml，用磁力搅拌器搅拌2h，用双层纱布过滤，取溶液，接着1500r/min离心去除沉淀，溶液加入冷却到5℃的丙酮150ml，用磁力搅拌器继续搅拌30min，用低温离心机4℃，2000r/min离心20min，取沉淀，然后用200ml75%的丙酮溶解搅拌，再离心。

沉淀放在低温真空干燥机中冻干。

冻干的固体粉末加入到冷却5℃的氯仿-甲醇（2:

1）100ml中，用磁力搅拌器搅拌20min，用低温离心机离心，2000r/min，倒掉上层溶液，沉淀溶于50ml乙醚中，搅拌离心，沉淀再溶于50ml丙酮溶液，搅拌离心。

沉淀放在低温真空干燥机中冻干。

冻干粉末溶于20mlpH8.00.2mol/L磷酸盐缓冲液，搅拌20min，在8000r/min离心30min，取上层溶液，加入硫酸铵，饱和度为60%，同时调节pH为8.0，静止30min，离心取沉淀，沉淀溶于10mlpH8.00.2mol/L磷酸盐缓冲液中，透析，用PEG20000浓缩，真空低温冻干即得粗猪胰脂肪酶。

2、粗脂肪酶的纯化

上步冻干粉末溶于缓冲液（pH8.00.2mol/L磷酸盐缓冲液2ml），进行凝胶层析，填料选为SephdaxG-100，缓冲液用pH8.00.2mol/L磷酸盐缓冲液。

将含有胰脂肪酶的小管收集，超滤浓缩，在真空低温冻干，获得的粉末就是猪胰脂肪酶。

利用SephadexG-100纯化粗酶液

（1）SephadexG-100的预处理

取2.5gSephadexG-100，至于烧杯中，加入蒸馏水，轻轻搅拌，弃去悬浮颗粒，如此反复洗涤几次后，加入过量（pH8.00.2mol/L磷酸盐缓冲液）缓冲液，室温下溶胀72h。

（2）装柱

取直径1.0cm，长50cm的层析柱，垂直固定在铁架台上，将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约5~7cm的pH8.00.2mol/L磷酸盐缓冲液，然后缓慢加入溶胀好的凝胶，注意使柱中无气泡，打开出样阀。

凝胶缓缓下沉，继续加入，用玻璃棒轻轻搅拌，使柱中无界限。

待凝胶柱装好后，在凝胶表面放一层滤纸，避免上样时破坏胶面。

用缓冲液平衡层析柱，并打开恒流泵控制流速为12mL/h。

（3）上样

将柱的上端打开，用吸管将凝胶上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。

沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱凝胶表面。

拧开下端的螺旋夹，使样品进入凝胶中，快要进完时，加1~2mL缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。

（4）洗脱、收集

当样品完全进入凝胶后，用（pH8.00.2mol/L磷酸盐）缓冲液洗脱样品，洗脱速度为0.4mL/min，并分管收集，1.5mL/管，收集100管。

（5）凝胶柱的重复使用与保存

当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。

保存方法有三种：

①在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%NaN3或0.002%洗必泰）或高压灭菌后4℃保存。

此法至少可以保存半年以上。

②用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。

③长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃~80℃干燥后保存。

3、脂肪酶的酶活测定

以橄榄油为底物，采用酸碱滴定法。

酶活力单位定义：

40℃，pH7.5条件下，以每分钟产生1μmol脂肪酸所需的酶量定义为1个活力单位μmol/（min·ml），以U表示。

取100ml锥形瓶4个，1个作为对照组，另3个为测定组。

反应过程如下：

对照组测定组1测定组2测定组3

0.025mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）5ml5ml5ml5ml

聚乙醇橄榄油乳化液4ml4ml4ml4ml

95％乙醇15ml---

40℃水浴预热5～10min

粗酶液

40℃水浴保温15min（精确计时）

95％乙醇-15ml15ml15ml

酚酞指示剂3滴3滴3滴3滴

用0.05mol/L标准氢氧化钠滴定至微红色，记录滴定消耗的体积。

计算：

脂肪酶活力单位＝（A－B）N·f/t

式中：

A为样品耗碱液体积，B为对照组耗碱液体积，N为每毫升碱液微克分子数，f为稀释倍数，t为作用时间（min）

4、脂肪酶性质研究

4.1.温度对脂肪酶活性的影响：

取一定量的纯化后的酶液，设定温度为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，底物浓度3mg/ml，pH为8.0，反应时间为15min，测定酶的活力。

以相对酶活为纵坐标，反应温度为横坐标，绘制反应温度曲线。

4.2.pH对脂肪酶活性的影响：

分别配制pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的磷酸钠盐底物缓冲液，使酶在不同的pH缓冲液中，在37℃条件下进行酶-底物的反应，测酶的活力。

以相对酶活为纵坐标，绘制酶反应pH值曲线。

4.3.热稳定性试验：

将一定量的酶液，根据不同菌株的最适温度分别放置在三个温度梯度的水浴内保温，每隔20min在最适反应温度、反应pH值的条件下测定残余酶活。

以相对酶活为纵坐标，反应时间为横坐标，绘制酶活曲线。

（陈贵元，2007）

4.4.酸碱稳定性试验：

不同pH值的缓冲液（从pH5.0到12.0，每1个pH单位为一个梯度）中，酶液与缓冲液1:

1混合在4℃下放置过夜，然后将酶液调回到最适作用pH值，在最适反应温度下测定残余酶活。

以相对酶活为纵坐标，反应pH值为横坐标，绘制酶活曲线（顾美英，2006）

六、实验结果及数据处理

测定脂肪酶得率、脂肪酶活力及其脂肪酶性质。

七、思考题

1、猪胰脂肪酶在体内的存在形式是什么？

2、试验中选用氯仿和甲醇的混合液的目的是什么？

3、试验中用丙酮和乙醚的主要作用是什么？

实验四超高压技术应用于食品新产品开发

一、实验目的

掌握超高压处理技术原理、方法，并用此方法开发新型食品。

二、实验原理

超高压技术是一种冷杀菌技术，对食品的营养成分破坏少。

利用超高压技术加工食品，有效地克服了传统的热加工法处理食品所带来的种种弊端，在满足能源问题、化学污染问题和社会对高质量食品的需求等方面充分体现出了其自身价值。

尤其是近年来人们对食品的新鲜度的要求越来越高，希望食品在加工过程中能保持其原有的新鲜度，因而导致了微加工食品概念的诞生，推动了对非热加工技术的研究开发。

三、实验要求

（1）上课前应阅读本任务书中相应的部分，明确实验的内容和要求。

（2）根据实验内容阅读教材中的有关章节，弄清基本概念和方法，使实验能顺利完成。

四、实验材料、仪器和试剂

超高压处理设备、苹果、聚乙烯塑料包装袋、真空包装机、结晶紫中性红胆盐琼脂、煌绿乳糖胆盐肉汤、细菌菌群检测片、大肠菌群检测片

五、实验步骤或方法

1原料处理

选取形状正常、新鲜、无机械损伤、无病虫害的苹果，经清洗、沥干后，削皮，去核，手工横切为5mm厚左右的薄片。

将处理后的苹果薄片用聚乙烯塑料袋真空密封包装。

2超高压处理技术

为防止高压挤破单层包装袋，将已真空密封包装苹果薄片的聚乙烯塑料袋用大聚乙烯塑料袋进行二次真空包装。

二次包装后的袋装试样浸泡于高压容器的传压介质油中，按照实验设计设定的压力和保压时间等参数，进行高压处理。

处理后样品经清洗并置冰箱4°C保藏，所有性质的测定在24h内进行。

超高压设备有效容积0.6L，升压速度100MPa/min，解压时间15s，压力腔夹套温度设置为25°C。

室温下，苹果片的超高压预处理工艺条件为：

600MPa，10min。

3维生素C含量的测定

称取100g苹果鲜样，加入100mL的2%（w/v）草酸溶液于研钵中研磨成匀浆状。

然后取20g匀浆于100mL容量瓶中，用1%（w/v）草酸稀释至刻度，混合摇匀，过滤，然后吸取10mL滤液，置于50mL的锥形瓶中，用已标定过的2，6-二氯靛酚染料液滴定，直至溶液呈粉红色15s不褪去为止（同时做空白试验）。

计算公式如下：

x=（V－V0）×T×100/W

式中：

x——每100g样品中抗坏血酸毫克数，mg/100g；

T——1mL染料溶液相当于抗坏血酸标准溶液的量，mg/mL；

V——滴定样液时消耗染料溶液的体积，mL；

V0——滴定空白时消耗染料溶液的体积，mL；

W——滴定时所取的滤液中含样品的质量，g。

4色泽的测定

采用WSC-S型全自动测色色差计测定样品的颜色。

采用亨特均匀表色系统测定L、a、b值表示样品的颜色，重复三次。

其中L表示白度，L值越小，表明产品的白色程度越小；a值表示色泽的红/绿，a<0表示的是绿色程度，a值越小，绿色程度越高；b值表示色泽的黄/蓝，b>0，表示的是黄色程度，b值越大，黄色程度越高。

色差值ΔE反映了茭白色泽的总体变化，ΔE越大表示茭白的颜色变化越大。

式中，L0、a0、b0为茭白对照样的值，L、a、b为茭白处理样的值。

5超高压处理后微生物计数和大肠杆菌数计数

（1）以无菌操作将试样25g剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水的灭菌乳钵内，经充分研磨做成1:

10的均匀稀释液；

（2）用lmL灭菌吸管吸取1:

10稀释液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇试管，混合均匀，做成1:

100的稀释液；

（3）另取lmL灭菌吸管，按上条操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支lmL灭菌吸管；

（4）根据食品卫生标准要求，选择2一3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移lmL稀释液于灭菌培养皿内，每个稀释度做三个培养皿；

（5）稀释液移入培养皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入培养皿约15mL，并转动培养皿使混合均匀。

同时将营养琼脂培养基倾入加有lmL稀释液灭菌培养皿作空白对照。

六、实验结果及数据处理

记录实验所得结果。

七、思考题

1、超高压处理技术的原理？

2、苹果在经过超高压处理后出现什么变化？

3、超高压处理技术的发展方向？

实验五肉的品质评定及其超高压处理技术

一、肉的感官评定和肉的物性测定

（一）实验目的：

通过本实验要求掌握肉的感官检查、评定方法和标准及其肉的颜色与嫩度的测定方法。

（二）主要内容：

1、仪器用具:

检肉刀1把、手术刀1把、外科剪刀1把、镊子1把、温度计1支、100ml量筒1个、表面皿1个、酒精灯1个、石棉网1个、色差计、嫩度计

2、肉的感官检查方法

（1）用视觉在自然光线下，观察肉的表面及脂肪的色泽，有无污染附着物，用刀顺肌纤维方向切开，观察断面的颜色。

（2）用嗅觉在常温下嗅其气味。

（3）用食指按压肉表面，触感其硬度指压凹陷恢复情况、表面干湿及是否发粘。

（4）称取切碎肉样20g，放在烧杯中加水100ml，盖上表面皿置于电炉上加热至50—60℃，取下表面皿，嗅其气味，然后将肉样煮沸，静置观察肉汤的透明度及表面的脂肪滴情况。

3、评定标准：

按国家标准评定

鲜猪肉的卫生标准（GB2722-81）

一级鲜度

二级鲜度

色泽

肌肉有色泽，红色均匀脂肪洁白

肌肉色稍暗，脂肪缺乏光泽

粘度

外表微干或微湿润

外表干燥或粘手

弹性

指压后凹陷立即恢复

恢复慢，且不完全

气味

正常

稍有氨味或酸味

煮沸肉汤

透明、澄清，脂肪团聚于表面，有香味

稍有混浊，脂肪呈小滴状，无鲜味

冻猪肉的卫生标准（GB2707-81）

一级鲜度

二级鲜度

色泽

肌肉有光泽色药均匀脂肪洁白无霉点

肌肉色稍暗红,缺乏光泽,脂肪微黄,或有少量霉点

组织状态

肉质紧密,有坚实感

肉质软化,松弛

粘度

外表及切面微湿润,不粘手

外表湿润,微粘手,切面有渗面液,不粘手

气味

无异味

稍有氨味或酸味

3、肉色的测定：

肉色指肌肉地颜色。

虽然肉色本身不会对肉类的滋味和营养价值有什么作用，但由于它直接反应了肌肉生理学、生物化学和微生物学方面的变化，且易于鉴别，因此，通常把肉色作为重要的肉质性状来测定。

一般绵羊肉呈鲜红色或红色，羔羊肉呈淡红色，老羊肉呈暗红色。

肉较绵羊肉色红，对肉色起作用的主要物质是肌红蛋白和血红蛋白，且以前者为最主要，约占80％－90％。

肉色的评定方法有目测法和仪器测定法。

（1）目测法：

是在自然光下（忌强光，亦忌弱光）用肉眼观测肉样的方法。

要求羊宰后1－2小时取肉样观测，或采取的肉样在4℃冰箱存放24小时以后再观测。

肉样通常取自胴体腰椎结合处的背最长肌。

此法简便易行，适宜于现场操作，并能有效地区分正常肉和劣质肉。

一般牛肉、猪肉的肉色评定依此法与标准肉色版对比按5级分制打分。

目前关于肉还没有标准肉色版可供参考。

冯维祺等（1996）建议肉肉色评定采取3级评分制，1分为红色（正常色），2分为稍深红色（属正常色），3分为暗黑色。

（2）仪器测定法：

是借助光学仪器直接测定肌肉颜色的方法。

如日本KONICAMINOLTA小型色差计CR-10按L（亮度）、a（红色度）、b（黄色度）值以及b/a值来评定肉色。

4、肌肉的嫩度测定：

肌肉嫩度指煮熟地肉入口后，人们咀嚼时的口感惬意程度。

是对肌肉中肌纤维和肌原纤维的组织学、细胞学和分子结构的总概括。

一般来说，口感柔嫩，则表示容易咀嚼，这与肌肉纤维的直径大小有关，同时也反应了肌肉蛋白质的结构特性及其在物理、化学作用下发生的变性。

凝集和水解程度。

因此，肌肉嫩度也常常是作为衡量肉