医学分子生物学简答总结重点.docx

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医学分子生物学简答总结重点

医学分子生物学简答题

基因与基因组

真核生物基因组特点

（1）分子量很大的DNA与蛋白质形成染色体存在于核内。

约30亿bp

（2）转录与翻译不同步，转录产物为单顺反子，功能相关基因分散排布，无操纵子结构。

（3）基因组存在高比例的非码顺序（noncodingsepuence,NCS）

（4）大量重复序列（repeatsequence）存在。

（5）基因多为不连续的，被插入序列（IS）所分隔，这种现象称为断裂基因

（6）功能相关基因构成各种基因家族

2.评判蛋白质编码基因的五项标准

（1）开放阅读框（openreadingframe,ORF）:

是始于起始密码子并终于终止密码子的一串密码子。

;

（2）序列特征——密码子偏爱和剪接点;

（3）序列保守性：

一个功能在不同物种内是保守的基因，大都表现出外显子的保守性和内含子的多变性；最好是对适当进化距离的物种间序列进行比较，但保守性序列也可能是非转录的调控单元。

（4）转录产物:

寻找基因的表达产物——RNA或蛋白质.;

（5）基因失活。

3.HGP的概念及主要内容、遗传标记

答：

HGP：

测定人类基因组全序列为目标的巨大工程

主要内容：

（1）人类基因组作图及序列分析（22+X+Y,30亿bp）；

（2）基因的鉴定与定位（约5万个基因）；

（3）基因组研究技术的建立和创新；

（4）模式生物基因组作图及序列分析；

（5）信息系统的建立、储存及相应软件的开发；

（6）相关产业的开发。

遗传标记：

第一代遗传标记是RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性酶切片段多态性）

第二代遗传标记是STR（shorttandemrepeat，简短串连重复序列），6000个标记，96年已全部完成

第三代遗传标记是SNP（restrictionfragmentlengthpolymorphism，单核苷酸多态性），不再是分析长度，而是直接测序

4.基因组学主要研究亚领域和主要研究内容

答：

5.DNA多态性的种类，并熟悉其应用

答：

1）DNA位点多态性（DNAsitepolymorphism）：

这种多态性是由控制某些性状的DNA碱基差异造成的。

应用：

DNA位点的多态性导致限制性内切酶切割位点的差异，即限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）RFLP是第一代DNA遗传学标记；由此发展成了RFLP技术（酶切、电泳、转膜、探针杂交，探针为基因序列或cDNA）

2）串连重复顺序多态性

应用：

DNA指纹分析（DNAfingerprint）；微卫星标记——第二代DNA标记

3）单核苷酸多态性——第三代DNA遗传标记

应用：

遗传性疾病研究中却具有重要意义；DNA测序；DNA芯片（DNAchip）及微阵列技术

真核基因表达调控

1.掌握真核基因表达调控的分子机制：

主要顺式作用元件和反式作用因子的特点及其作用机制。

答：

一、顺式元件（cis-actingelement）

真核生物的顺式作用元件包括三类：

Ⅰ类顺式作用元件——Ⅰ类启动子——RNApolⅠ

Ⅱ类顺式作用元件——Ⅱ类启动子——RNApolⅡ

Ⅲ类顺式作用元件——Ⅲ类启动子——RNApolⅢ

Ⅱ类顺式作用元件调控的基因主要是编码蛋白质的基因，少数是snRNA基因。

Ⅱ类顺式作用元件包括：

（一）核心启动子（Corepromoter）：

1.TATA盒：

Ⅱ类启动子的TATA盒是最主要的结构，位于转录起始点上游-30bp处；TATA盒和部分上游启动子元件组成；是TFⅡD识别部位。

功能：

确保转录精确而有效地从转录起始序列开始

2.上游启动子元件：

是一些位于TATA盒上游的可调节基因转录DNA序列。

1）CAAT盒:

能与CAAT结合转录因子（CTF）和CAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）结合

2）GC盒：

以CCGCCAAT为序列特征，能与反式作用因子Sp1结合。

特点：

一般位于启始位点-40~-110bp之间，有方向性并与距离有关。

作用机制：

调节TATA因子与TATA的结合、RNApolⅡ与启动子的结合、转录起始复合物的形成等。

3.起始子：

以转录点为中心的的保守序列，功能：

是某些基因最佳转录所需的

4.下游启动子元件：

常位于转录点下游约+30bp处，功能：

可以补偿TATA盒缺失导致的转录抑制

（二）增强子（enhancer）:

能增强启动子活性的DNA序列。

特点：

1）能远距离增强启动子的活性；2）无方向性，在启动子的上游和下游均起作用；3）对启动子的影响无严格的专一性。

作用机制：

可能通过与某些调节蛋白的结合改变染色质的结构而发挥作用。

（三）沉默子（silencer）:

能抑制启动子活性的DNA序列。

特点：

与增强子相似；沉默子与增强子的角色可因调控基因而转换。

（四）反应元件:

某些反式作用因子与特定刺激信号结合后，能与某些上游启动子元件和增强子所结合，调节基因表达，这类顺式作用元件即特称中~。

种类：

激素反应元件、金属离子反应元件、TPA反应元件、血清反应元件等。

二、反式作用因子的主要特点：

（1）一般具有三个结构域：

DNA识别结构域、转录活性域和蛋白质-蛋白相互作用结构域；

（2）能识别并结合调控区的顺式作用元件；

（3）对基因表达有正性调节（激活）和负性调节（抑制）二种方式。

（4）其调节机制涉及顺式作用元件、RNA聚合酶和其它调节蛋白。

2.掌握真核基因表达的调控的主要方式:

DNA和染色体结构对转录的调控、转录起始调控，熟悉转录后调控、mRNA稳定性调控、翻译的可调控性及调控方式、翻译后加工的调控。

一、DNA和染色体结构对转录的调控

1.DNA碱基修饰变化：

真核DNA约有5%的胞嘧啶被甲基化,降低转录活性；甲基化范围与基因表达程度呈反比。

2.组蛋白变化：

活性染色质:

①富含Lys组蛋白水平降低，②H2A,H2B二聚体不稳定性增加，③组蛋白修饰（乙酰化），④H3组蛋白巯基暴露。

3.DNA拓扑结构变化

二、转录起始调控

（1）RNApolI转录体系的调节：

RNApolI转录产物:

45SrRNA

（2）RNApolIII转录体系的调节

转录产物:

tRNA和5SrRNA

启动子特点：

基因的启动子位于转录区

tRNA基因启动子：

A盒和B盒

tRNA基因所需转录因子：

TFIIIC和TFIIIB

5SRNA基因所需转录因子：

TFIIIC和TFIIIB；还需TFIIIA

（3）RNApolII转录体系的调节

3、转录后调控

（1）mRNA加帽和加尾的调控意义

1.5′帽子结构的作用：

防止mRNA被5′→3′核酸酶降解；能被帽结合蛋白识别，增强mRNA的可翻译性，没帽子结构，翻译效率降低；促进mRNA从核到胞浆的运输过程；增强mRNA的剪接效率,帽对exon1的剪接尤为重要，需要2个帽结合蛋白参与（CBP80和CBP20）

2.Poly（A）尾的作用：

延长mRNA的半衰期限：

实际上是一个核酸水解酶降解与Poly（A）聚合酶不断添加A的一种平衡，总趋势是胞浆内Poly（A）逐渐缩短。

促进翻译效率：

Poly（A）与Poly（A）结合蛋白（PABP）结合；人为除去二者或其一，均降低翻译效率；机制不详；有些mRNA可通过除去Poly（A）降低翻译水平。

（2）mRNA选择剪接的调控作用

1.mRNA的剪接：

真核生物中约5%的pre-mRNA可以有二种或以上的剪接方式，形成多种成熟mRNA，翻译成不同的蛋白质。

2.剪接对基因表达的调控

（3）RNA编辑的调控作用

RNA编辑（RNAediting）：

是指转录后成熟的RNA分子的修饰和加工，使得RNA所携带的遗传信息发生改变的过程。

RNA编辑有核苷的插入或删除（n个核苷酸）编辑和碱基替换编辑（C→U常见）两种类型。

在真核生物的tRNA、rRNA和mRNA中都有RNA编辑。

RNA编辑有多种机制，不同生物的编辑需要不同的RNA编辑酶。

影响基因的表达，生成不同的氨基酸或新的ORF。

编辑可在多种水平被调节，且与人类疾病（肿瘤、AS等）有一定的相关性。

（四）mRNA稳定性调控：

真核mRNA稳定性常由特异的去稳定元件控制；

常见于3′-端非翻译区（3′-UTR）一为特殊的茎-环结构；另为约50nt的AU-丰富序列（AU-richsequence，ARE）,一致性序列为（AUUUA）5。

这种序列引入可致mRNA的快速降解，去除则不一定会增加mRNA的稳定性。

4、翻译的可调控性及调控方式

翻译起始的调节：

翻译起始复合物80S·Met-tRNAi·mRNA形成之前的各个环节均可进行调节。

1.5′AUG对翻译的调控：

90%以上的真核mRNA翻译始于最近5′端的第一个AUG；但有的mRNA的5′UTR有多个AUG（称5′AUG），会干扰正常的ORF。

某些癌基因存在这类调节!

2.5′UTR长度的影响:

太短会导致40S小亚基不易识别起始AUG;5′UTR少于12nt时,50%以上在40S小亚基起始时会滑起始AUG;AUG前5′UTR以17~80nt最适宜,翻译效率与长度呈正相关.

3.阻遏蛋白通过5′UTR调控翻译

5、翻译后加工的调控

（1）新生肽链的水解和N-末端修饰

（2）通过信号序列分栋、靶向运输和定位

（三）新生肽链折叠为天然构象的蛋白质

细胞凋亡及其调控的分子机制

1.细胞凋亡与坏死的区别

凋亡

坏死

诱导因素

生理性、弱刺激性

强烈刺激

细胞数量

单个细胞丢失

成群细胞死亡

膜完整性

保持至晚期

早期即丧失

细胞核

早期固缩、断裂

晚期破碎

细胞器

无明显变化

肿胀、破坏

胞内容物

无释放

释放

核片段

形成凋亡小体

破裂成碎片

基因组DNA

受调控降解

随机降解

大分子合成

一般需要

不需要

基因调控

有

无

后果

不引起炎症反应

引起炎症反应

意义

生理性死亡

病理性死亡

2.P53蛋白的调控作用

结构：

自N端起包括：

转录活化区、DNA结合区、四聚体化区和C-调节区；

1）P53的表达与活性调节：

正常状态下：

胞浆P53水平很低，半衰期很短；胞内P53被严格监控，受HDM2的负反馈调节，并通过泛素降解途径调节P53水平。

异常情况下：

当细胞DNA损伤、纺锤体丝断裂、癌基因异常表达等细胞生存面临威胁时；P53水平迅速升高和活化；

2）P53对细胞凋亡和细胞周期的调节作用：

野生型P53蛋白：

具维持细胞生长、抑制恶性增殖的作用；P53蛋白作为“基因警卫”负责维持基因组的完整性、DNA损伤修复和细胞周期的正常运转；如果损伤不能修复，P53就激活那些诱导凋亡的基因表达，使细胞进入凋亡状态。

突变型P53蛋白：

丧失抑制细胞恶性增殖功能，p53基因突变是50%以上肿瘤逃逸凋亡的重要原因;并且本身具有癌基因功能。

3.Bcl-2家族

（1）功能

1）属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，但对细胞周期和分化无影响.

2）阻止或减少各种刺激引起的细胞损伤。

如Bcl-2能阻止由r射线和多种化疗药导致的细胞凋亡。

3）Bcl-2蛋白具抗氧化作用;（4）Bcl-2蛋白抑制细胞器内Ca2+离子向胞质释放，而凋亡必须有Ca2+离子参与。

（2）Bcl-2家族对细胞凋亡的调节机制

1）Bcl-2、Bax和Bcl-x组成一个凋亡调控系统;

2）当Bax/Bax同源二聚体形成时，便诱导细胞凋亡；

3）随bcl-2表达量增加，渐多的Bax/Bax解聚，形成更稳定的Bax/Bcl-2异源二聚体，从而中和了‘Bax/Bax’诱导凋亡的作用。

4）当Bcl-xs存在时，优先形成Bcl-xs/Bcl-2，使Bax/Bax形式保留，诱导细胞凋亡。

4.凋亡细胞的生化特征的检测

（一）琼脂糖凝胶电泳法：

染色体组DNA提取1~1.5%琼脂糖电泳（含EB或SYBR-greenI）

电泳后于紫外灯下观察并照相留底，有无200bp左右的ladder出现作为判断细胞凋亡，亦可进行聚丙烯酰胺凝胶电泳.

（2）原位末端标记技术（insituend–labeling,ISEL）：

原理:

凋亡时DNA断裂，利用末端DNA转移酶（TdT）或DNA聚合酶将带有生物素（或荧光素）标记的核苷酸（biotin-16-dUTP）掺入到断裂的DNA的3’端，再使其与带有HRP的亲和素蛋白结合，经显色后，可观察到细胞内是否存在DNA片段。

主要方法有3种:

1.原位缺口平移法（ISNT）：

DNA聚合酶I介导

2.原位末端标记法：

klenow大片段介导

3.TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）：

TdT该法特异性和敏感性较高，可检出早期的凋亡细胞.

5.掌握细胞凋亡的组织学和形态学变化、凋亡小体的形成、生化特征

（一）细胞凋亡的组织学变化

生理或病理下：

只发生在单个或几个细胞，其紧邻细胞完好；与紧邻细胞间有空隙，有离群、脱落感；不引起炎症反应

（2）主要形态学特点（多阶段）

注意点：

凋亡全过程，质膜仍保持完整，细胞内容物不释放，不引起炎症反应。

1.细胞体积：

变小，细胞皱缩变圆

2.细胞核的变化:

核内染色质凝聚、形成染色质块，并聚集于核的边缘呈多种形状排列（如：

新月形），然后逐步分裂为碎片（核碎片形成）。

3.细胞质的变化：

（1）胞质出现空泡，脱水浓缩，体积减少约30%

（2）细胞器的变化:

A.线粒体早期体积增大，嵴增多晚期成空泡状；B失去微绒毛、细胞突起及细胞表面皱褶，膜电位下降，膜流动性下降；C.内质网腔扩大；D.细胞骨架变得致密和紊乱。

4.凋亡小体（apoptoticbody）的形成：

凋亡的最后阶段，由胞质分割形成大小不等，含有细胞质膜、细胞器及核碎片的膜包被小体

（3）细胞凋亡的生化特点

1.DNA片段化（主）

2.其它生化改变：

1）胞浆Ca2+和H+水平：

凋亡的发生伴随胞浆Ca2+和H+水平的升高。

2）细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）外翻：

膜磷脂的不对称性分布改变,凋亡时PS由质膜内侧翻向外侧（早期特征）

3）线粒体：

细胞凋亡时，呼吸链受损，ATP合成下降，线粒体跨膜电位（mitochondrialtransmembranepotential,Δψm）下降；膜通透性增加。

6.掌握Caspase的种类、结构特点、活化和引起细胞凋亡的机制；

答：

Caspase的性质和种类：

Caspase即天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶。

1）分为3个亚类：

Caspase-1亚家族，Caspase-2亚家族，Caspase-3亚家族；

2）根据前体分子（procaspase）N端的原结构域（prodomain）分为2类:

启始分子（initiator）,如-8、-9、-10等，为蛋白酶级联反应的启始者，其活化后再切割和活化下游Caspase；

效应分子（effector）,如-3、-6、-7等，作为上游酶的底物被切割活化，再作用于多种蛋白质或酶，促使细胞凋亡。

效应caspase引起细胞凋亡的机制：

1）灭活细胞内凋亡抑制蛋白：

非凋亡细胞中,CDA（caspase活化的DNAase）与其抑制蛋白（ICDA）结合;凋亡细胞中,caspase剪切ICDA;CDA游离并进入核内降解DNA,细胞凋亡.

2）剪切细胞结构蛋白：

如Caspase对核板的降解作用;在凋亡过程中,caspase在单一位点剪切核纤层蛋白（lamin）,导致核板塌陷,染色质浓缩

3）剪切效应蛋白:

如参与基因表达蛋白因子,如PARP；

7.掌握细胞凋亡信号传递途径的种类和特点；

特点:

同一性：

各种因素引起的凋亡的形态与生化改变均相同。

多样性：

刺激因素、细胞类型、环境因素不同时，从凋亡程序启动到凋亡发生，其信号传递途径是不同的。

细胞凋亡的信号传递途径种类:

（1）死亡受体介导的细胞凋亡;

（2）线粒体相关蛋白的凋亡诱导途径：

线粒体跨膜电位（Δψm）的下降，线粒体膜通透性转运孔（MPT）破坏或开放，开放的后果是，Δψm下降、氧化磷化脱偶联、GSH耗竭、ROS产生等，并形成恶习性循环。

（3）细胞核凋亡诱导途径;

（4）粒酶B介导的细胞凋亡：

CrB由CTL分泌进入靶细胞胞浆后,其丝氨酸蛋白酶在胞浆pH7.0条件下发挥最佳活性，切割胞浆和核中的多种底物；Caspase依赖的死亡通路是CrB介导细胞死亡的重要途径之一。

8.掌握死亡受体介导的细胞凋亡途径；

答：

DNA体外重组技术

1.DNA重组技术基本程序

外源DNA的获取-----克隆载体的选择与构建----目的基因与载体的连接----连接物（重组DNA）导入合适受体细胞----重组体的筛选----克隆基因的表达

2.作为基因工程载体所需具备的基本条件：

（1）带有复制子，能在宿主细胞内携带外源基因一同进行复制。

（2）有单酶切位点、多克隆酶切位点（多种酶单一位点），供外源基因的插入。

（3）具有多个筛选标志：

如抗药基因、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应等。

（4）表达型载体还应有使外源基因表达的完整的转录单位：

如强启动子、前导序列、增强子等调控元件。

3.目的基因与pBR322经BamHI酶切后进行重组如何筛选得到阳性克隆？

请写出设计和实验方案

答：

4.选择一感兴趣的目的基因，试述如何利用所学的DNA体外重组技术克隆出该基因（简述设计方法）。

PCR的应用

1.PCR过程中的DNA模板变性、模板与引物退火、引物延伸3步的温度设置一般大致是多少？

要考虑的主要因素是什么？

答：

DNA模板变性：

95℃左右高温使模板DNA完全变性（93~95˚C左右）

模板与引物退火：

55℃左右引物与模板形成复合物的几率>>DNA分子自身的复性（引物Tm-5˚C）

引物延伸：

72℃左右耐热DNA聚合酶在最适温度下催化DNA合成反应。

（酶最适温度）

2.衡量PCR好坏的参数主要有哪些？

一般来说好的结果如何体现？

答：

特异性Specificity:

最好只有目的DNA带。

产量Quantity:

DNA带明亮。

真实性Fidelity:

DNA序列正确。

3.简述PCR的原理、组成、条件优化

（1）PCR原理：

类似于DNA的天然复制过程，是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5`末端和3`末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸，直至完成新的DNA合成，反复重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。

PCR反应的特异性依赖于2个与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，取决于2个引物设计的好坏，依赖于引物与模板结合的正确性，退火温度。

（2）PCR的过程：

（1）．DNA模板变性（denature）：

95℃左右高温使模板DNA完全变性;

（2）．单链DNA模板与引物退火（annealing）：

引物与模板形成复合物的几率>>DNA分子自身的复性;（3）．引物的延伸（extension）：

DNA聚合酶在最适温度下催化DNA合成反应。

5'端是人工合成的引物，是特定的，3'端没有固定的终止点。

（3）PCR的反应体系：

1）寡核苷酸引物。

引物的常用浓度范围：

PCR反应中引物的浓度是0.1～1μmol/L，在100μl中引物的量为25～100pmol,假如用25μmol/L浓度的引物贮备液只需加1～4μl。

配制时注意:

①由于引物呈很轻的干膜状附在管壁上,打开时极易散失,故打开管子前要先离心,再慢慢打开,溶解时加足量水后盖盖,充分上下振荡5～10min②溶解后分装,冻存于-20℃；

2）PCR反应缓冲液：

Tris-Cl（pH8.3～8.8）；KCl或（NH4）2SO4:

促使引物退火；MgCl2:

影响酶活与精确度,产物的特异性；明胶或BSA或Tween-20:

稳定酶活性；甲酰胺:

使引物与模板特异性配对；

3）耐热DNA聚合酶；

4）dNTP：

常用浓度是20～200μmol/L；避免反复冻融,分装冻存于-20℃；

5）模板DNA：

抽提方法：

简单的水煮沸法，去垢剂裂解细胞→蛋白酶消化蛋白→有机溶剂抽提→乙醇沉淀核酸。

（4）PCR引物的设计原则：

1）引物长度在15～30个碱基；2）引物的碱基的分布是随机的,避免5个以上的嘌啶和嘧啶的连续排列,尤其3'不应有连续3个G或C；3）避免两引物间的互补,特别是3'端；4）引物自身不应有连续超过3个bp的互补序列；5）引物的3'端不能有任何修饰,3'决定产物的特异性；6）引物的5'端限定PCR产物的长度,5'端可进行修饰；7）引物与非扩增序列同源性应<70%或<连续8个互补；8）扩增编码区中,引物3'端不要终止于密码子的第3位。

（5）PCR反应“平台效应”出现的早晚取决于：

1。

Taq聚合酶的性能；2。

模板DNA的拷贝数；3。

底物dNTP浓度；4。

其他多种因素

（6）PCR的条件优化：

1）PCR循环数；2）使用增强剂（DMSO，PEG-6000，甲酰胺，甘油，Tween-20）；3）热启动PCR。

（7）PCR技术的应用：

1）基因分析：

（一）基因缺失的检测；

（二）基因突变的检测；（三）基因易位的检测；（四）外源致病基因的检测；2）定位克隆；3）序列分析。

4.以TaqMan技术为例，简述实时荧光PCR的原理。

（1）PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使探针上的荧光基团和淬灭基团分离，使荧光基团在激发光作用下发出荧光；

（2）每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

5.用于核酸探针标记的32P-（d）ATP主要有几种，DNA切口平移标记法、随机引物标记法和3′或5′末端标记分别应该用哪种？

为什么？

6.简述采用Biotin标记探针进行North-South杂交原理和操作流程。

答：

①电泳,转膜，紫外交联固定

②洗膜封闭

③杂交：

生物素标记的探针与靶DNA结合

④HRP标记的链亲和素与探针上的生物素结合

⑤底物在HRP催化下,反应发光

后继的化学发光检测：

1）曝光：

用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记，保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上X光片，曝光1-5分钟；2）显影：

取出X光片，按使用说明书显影和定影。

7.简述WesternBlotting间接法操作流程。

与直接法相比较，主要的差别是什么？

间接法：

①电泳分离,转膜,固定蛋白于膜上

②漂洗和封闭

③一抗与蛋白结合（小鼠单抗或兔多抗）

④HRP,AP标记二抗与一抗－蛋白复合物结合

⑤底物与二抗-HRP,AP反应,显色或发光

直接法：

①电泳分离,转膜,固定蛋白于膜上

②漂洗和封闭

③HRP/AP标记抗体与蛋白结合

④底物与抗体-HRP/AP反应,显色或发光

8.三种印迹技术的比较

Southern

Northern

Western

样品

DNA

RNA

蛋白质

限制性内切酶消化

需要

不需要

不需要

电泳

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳

SDS-PAGE电泳

变性

碱变性

甲醛或戊二醛变性

高温变性

转移膜

NC膜或尼龙膜

NC膜或尼龙膜

NC膜或PVDF膜

紫外交联仪等固定

需要

需要

不需要

杂交标记物

标记探针