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癌细胞生物论文5000字

（一）：

白藜芦醇联合奥沙利铂对人结肠癌细胞恶性生物学行为的抑制作用及机制论文

摘要目的：

探讨白藜芦醇（Res）联合奥沙利铂（Oxa）对人结肠癌细胞恶性生物学行为的抑制作用及机制。

方法：

将体外培养结肠癌HCT-116细胞分为Res组、Oxa组、联合组及对照组，分别以100μmoL/LRes、2μmoL/LOxa、100μmoL/LRes+2μmoL/LOxa、等量生理盐水处理，各组分别处理24、36、48h。

采用噻唑藍（MTT）法检测结肠癌HCT-116细胞增殖抑制情况；采用Transwell小室实验检测结肠癌HCT-116细胞侵袭能力；WoundHealing法检测结肠癌HCT-116细胞迁移能力；采用蛋白免疫印迹法检测结肠癌HCT-116细胞波形蛋白（Vimentin）蛋白表达情况。

结果：

干预48h时，Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞增殖抑制率分别为（28.41±6.25）%、（36.11±8.47）%、（83.61±12.72）%；干预48h时，对照组、Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞侵袭率分别（97.14±2.81）%、（81.23±4.52）%、（69.84±3.97）%、（37.11±3.58）%；迁移率分别为（68.57±4.02）%、（46.11±3.13）%、（31.25±2.86）%、（18.79±2.21）%；Vimentin蛋白相对表达量分别为0.93±0.14、0.52±0.08、0.31±0.04、0.13±0.02。

Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞增殖抑制率呈逐渐升高趋势（P<0.05）；与对照组比较，Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞侵袭率、迁移率和Vimentin蛋白相对表达量降低，且联合组显著低于Res组与Oxa组，差异有统计学意义（P<0.05）。

结论：

Res与Oxa联合使用具有显著的协同效应，可更有效抑制结肠癌HCT-116细胞增殖，并降低其侵袭和迁移能力，其机制可能与下调Vimentin蛋白表达有关。

关键词结肠癌；白藜芦醇；奥沙利铂；增殖；侵袭；迁移；波形蛋白；抗肿瘤；上皮细胞-间充质转化

奥沙利铂（Oxa）是继顺铂和卡铂之后的第三代铂类抗癌药物，具有较好的抗肿瘤效果，且目前已成为临床治疗胃癌及结直肠癌的一线化疗药物，白藜芦醇（Res）具有抗肿瘤、抗衰老、抗炎、抗氧化及抗血栓等多种药理学作用，已有研究证实，Res可对人乳腺癌、肝癌、胃癌、白血病等多种肿瘤细胞拮抗作用[1]。

研究报道，Oxa和Res联用具有协同抑制结直肠癌细胞增殖的作用，其机制与抑癌基因miR-34c表达上调有关[2]。

研究发现，Res能逆转人大肠癌细胞对Oxa耐药，进而抑制人大肠癌细胞增殖，诱导其凋亡[3]。

本研究旨在探讨Res联合Oxa对人结肠癌细胞恶性生物学行为的抑制作用及机制，为临床治疗结肠癌提供指导。

现报道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1细胞株结肠癌HCT-116细胞，购自南京凯基生物公司。

1.1.2药物Res（美国Sigma公司，批号：

AM569872），规格：

5g，纯度>99%；Oxa（长沙华美医药科技开发有限公司，批号：

201845683），规格：

50mg。

1.1.3试剂与仪器主要试剂：

胎牛血清、DMEM培养基（美国Gibco公司，型号：

CQ-80L）；噻唑蓝（MTT）（美国Sigma公司，型号：

298-93-1）；Matrigel胶（美国BD公司，型号：

40234A）；兔抗人Vimentin多克隆抗体（美国SantaCruz公司，型号：

AZ050）等。

主要仪器：

CO2培养箱（英国RSBiotech公司，型号：

GALAXYS）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，型号：

SW-CJ-1FD）；小室（美国Corning公司，型号：

Transwell）；光学倒置显微镜（日本OLympus公司，型号：

CKX41）；蛋白垂直电泳仪（上海能科技有限公司，型号：

VE-180）；全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司，型号：

606型）；ImageProPlus软件（美国MediaCybernetics公司，型号：

ImageProPlus）；图像分析软件（德国Leica公司，型号：

LeicaQWin）。

1.2方法

1.2.1分组与模型制备

将结肠癌HCT-116细胞分为Res组、Oxa组、联合组及对照组。

用含10%胎牛血清、100U/mL青、链霉素的DMEM培养基在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养结肠癌HCT-116细胞[4]，取对数期结肠癌HCT-116细胞，接种于96孔板中。

1.2.2给药方法

Res组、Oxa组、联合组及对照组分别以100μmoL/LRes、2μmoL/LOxa、100μmoL/LRes+2μmoL/LOxa、等量生理盐水处理，20μL/孔，各组分别处理24、36、48h。

1.2.3检测指标与方法

MTT法检测结肠癌HCT-116细胞增殖抑制情况：

细胞分组及处理同1.2.1，分别于干预24、36、48h后，加MTT（5mg/mL）溶液20μL，孵育4h，并设置8复孔，且各组均重复3次[5]。

于570nm波长处检测各孔吸光度值OD570nm。

结肠癌HCT-116细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD570nm/对照组OD570nm）×100%。

Transwell小室实验检测结肠癌HCT-116细胞侵袭力：

于Transwell小室上室铺Matrigel基质胶50μL，加无血清DMEM培养基，平衡12h；胰酶消化，离心，1500r/min，5min，收集对数期结肠癌HCT-116细胞，无血清培养基悬浮细胞，500μL/室[6]。

于下室置含10%胎牛血清的DMEM培养基，干预48h时，棉签去除上室上的细胞，0.5%结晶紫染色。

于光学倒置显微镜下观察并计数侵袭细胞数量。

侵袭率（%）=下室细胞数量/细胞总数量×100%。

WoundHealing法检测结肠癌HCT-116细胞迁移能力：

将对数期细胞调整浓度为5×105个/mL，接种于6孔板中。

以200μL无菌移液器枪头垂直于单层细胞划痕，划痕面积约10mm×1mm。

各孔加含0.1%胎牛血清的培养基。

由于结肠癌HCT-116细胞具有迁移能力，继续培养划痕会逐步融合，分别于干预0、24、36、48h时在光学倒置显微镜下观察[7]，以ImageProPlus软件计算划痕愈合率（%）=（0h时划痕宽度-24/36/48h时划痕宽度）/0h时划痕宽度×100%。

蛋白免疫印迹法检测结肠癌HCT-116细胞Vimentin蛋白表达情况：

细胞分组及处理同2.1，收集各组干预48h时的细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取50μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以β-actin为内参，经LeicaQWin图像分析软件进行分析结肠癌HCT-116细胞Vimentin蛋白相对表达情况[8]。

1.3统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组不同时间点结肠癌HCT-116细胞增殖抑制情况

各组结肠癌HCT-116细胞增殖抑制率均随时间延长而逐渐升高，且联合组显著高于Res组、Oxa组，差异有统计学意义（P<0.05）。

见表1。

2.2各组干预48h后结肠癌HCT-116细胞侵袭能力比较

干预48h，对照组、Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞侵袭率分别为（97.14±2.81）%、（81.23±4.52）%、（69.84±3.97）%、（37.11±3.58）%。

与对照组比较，Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞侵袭率均显著降低，且联合组显著低于Res组、Oxa组，差异有统计学意义（P<0.05）。

见图1。

2.3各组干预后结肠癌HCT-116细胞迁移能力比较

干预24h时，对照组、Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞迁移率分别为（18.41±2.16）%、（6.57±0.54）%、（3.12±0.29）%、（1.24±0.11）%；干预36h时，各组迁移率分别为（37.39±3.22）%、（18.54±2.23）%、（14.11±1.78）%、（2.33±0.25）%；干预48h时，各组迁移率分别为（68.57±4.02）%、（46.11±3.13）%、（31.25±2.86）%、（18.79±2.21）%。

随干预时间延长，各组结肠癌HCT-116细胞迁移率逐渐升高；与对照组比较，Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞迁移率均显著降低，且联合组顯著低于Res组与Oxa组，差异有统计学意义（P<0.05）。

见图2。

2.4各组干预48h后结肠癌HCT-116细胞Vimentin蛋白表达情况

干预48h，对照组、Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞Vimentin蛋白相对表达量分别为（0.93±0.14），（0.52±0.08），（0.31±0.04），（0.13±0.02）。

与对照组比较，Res组、Oxa组及联合组Vimentin蛋白相对表达量显著降低，且联合组显著低于Res组、Oxa组，差异有统计学意义（P<0.05）。

见图3。

3讨论

Oxa以DNA为作用靶点，通过形成铂化DNA化合物而抑制DNA的合成，并抑制DNA的修复，从而激活信号传导通路引起细胞死亡，发挥抗肿瘤的作用。

Res又名茋三酚，是一种天然多酚类的植物抗毒素。

研究显示，Res除具有抗炎、抗氧化、保护神经系统、调节骨代谢及雌激素等多种药理学作用外，还可通过抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡，抑制癌基因表达及干预信号转录等发挥抗肿瘤作用[9]。

研究报道，Oxa可抑制人结肠癌SW620细胞增殖，其机制可能与抑制SW620细胞内源性核因子-κB、信号传导与转录激活因子3（STAT3）表达有关[10]。

高俊英等[11]研究发现，Res可通过影响上皮细胞-间充质转化（EMT）过程、调控microRNAs家族的表达来影响上皮肿瘤细胞的侵袭和迁移，提示Res可通过抑制肿瘤细胞的侵袭迁移控制肿瘤的发展。

也有研究表明，Res可显著抑制胰腺癌Miapaca-2细胞的侵袭转移，且其抑制能力与药物浓度正相关[12]。

本研究结果显示，联合组结肠癌HCT-116细胞增殖抑制率显著高于Res组、Oxa组，与对照组比较，Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞侵袭及迁移率均显著降低，且联合组显著优于Res组与Oxa组，提示Res可抑制结肠癌HCT-116细胞增殖，降低其侵袭和迁移能力，且Res与Oxa联用具有显著的协同效应。

EMT过程与肿瘤细胞侵袭、转移等密切相关。

研究发现，三氧化二砷和Res联合使用可有效抑制肺癌细胞人侵袭、迁移，可能与下调Vimentin水平，抑制细胞基质的降解和EMT过程有关[13]。

臧春宝等[14]研究发现，Res可调控EMT蛋白表达，下调Vimentin蛋白表达水平，抑制EMT，进而降低食管癌细胞的侵袭、迁移，提示Res可通过抑制EMT发生，控制肿瘤细胞的侵袭和迁移。

本研究结果显示，Res组、Oxa组及联合组Vimentin蛋白相对表达量显著低于对照组，且联合组显著低于Res组、Oxa组，提示Res可下调Vimentin蛋白的表达，进而发挥抗肿瘤的作用。

综上所述，Res能明显抑制结肠癌HCT-116细胞增殖，同时降低其侵袭、迁移和Vimentin蛋白表达，与Oxa联用，可增强抗肿瘤作用，为临床治疗结肠癌提供了新思路。

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（二）：

微小RNA21对鳞癌细胞生物学影响的研究论文

【摘要】目的：

探讨微小RNA-21在口腔鳞癌组织中的表达水平，及其对鳞癌细胞系中的生物学功能的影响。

方法：

实时荧光PCR定量检测10例口腔鳞癌标本中微小RNA21的表达情况。

口腔鳞癌细胞系转染微小RNA抑制剂后，检测其对鳞癌细胞的增殖、侵袭及凋亡的影响。

结果：

微小RNA21在口腔鳞癌组织中表达明显上调，与对照组比较有显著差异。

微小RNA21抑制剂转染鳞癌细胞系后，细胞的周期发生了变化，细胞凋亡比率增高，侵袭能力下降。

结论：

微小RNA21在口腔鳞癌组织中表达上调，微小RNA21可以抑制口腔鳞癌细胞的凋亡、促进癌细胞增殖，起到了类似原癌基因的作用。

【关键词】口腔鳞癌；微小RNA；增殖；凋亡

【中图分类号】R36【文献标识码】A【文章编号】1004-7484（2019）01-0011-01

颌面部的恶性肿瘤以口腔鳞状细胞癌最多见，所占比例在80%以上，其具有侵袭局部周围组织及区域淋巴结转移的特点，晚期还可发生远处转移[1]。

目前，在手术中还无法做到肿瘤外科与整形外科完全兼顾，治疗后患者多存在明显的功能障碍和容貌破坏，严重威胁人们的身心健康。

微小RNA参与很多肿瘤的发生发展过程，其中微小RNA21在多种实体瘤细胞中表达升高，并且起到粗癌基因的角色[2]。

在口腔鳞癌的发生发展中最重要的机制是细胞中原癌基因激活和抑癌基因失活，最终导致细胞增殖和（或）凋亡调节失控[3]。

因此，本课题研究微小RNA21在口腔鳞癌细胞系中的作用。

1资料和方法

1.1一般資料本研究中参与的病人均于术前签署手术知情同意书。

病理标本收集自2017年1月至2017年12月间，就诊于哈尔滨医科大学附属口腔医院。

10对口腔鳞癌组织及相应的癌旁正常粘膜组织均采集自口腔鳞癌患者初次手术切除的外科标本。

全部病人在手术前均未经任何放疗和化疗。

收集到的标本立刻放入冻存管中，标记清楚储存于-80℃。

患者的TNM分期按照2002年美国癌症联盟-国际抗癌联盟TNM分期标准。

1.2研究方法提取组织中的RNA，逆转录后实时荧光定量PCR检测细胞中微RNA21的表达情况。

培养鳞癌细胞株，收集对数生长期的细胞支撑细胞悬液，实验分为3组，即空白对照组，阴性对照组和实验组。

利用酶联免疫方法检测细胞的增值情况，流式细胞分析的方法检测细胞凋亡情况和细胞周期。

2结果

2.1微小RNA21在鳞癌组织中的表达10例样本经RNA提取后，稀释10倍，利用Nano测定RNA浓度，满足纯度的样本进行后续试验。

实时荧光定量PCR实验结果显示，10例口腔鳞癌患者组织中微小RNA21呈现高表达。

癌周对照组织相对表达值为1，那么癌组织中平均表达水平为1.9259±0.3615，癌组织的表达显著高于配对的癌旁组织（t=2.15，P<0.05）。

2.2细胞增殖的变化利用细胞活性（R）计算公式将对照细胞统一记作1.0，便于比较不同浓度实验组的数据。

三组细胞培养72小时后，测定细胞增殖情况，数据见表1.微小RNA21抑制剂组细胞活性受到了抑制，经统计学软件分析后，有显著意义。

2.3细胞周期的变化细胞转染48小时候，收集细胞，按照细胞周期试剂盒操作，使用流式细胞仪对细胞周期进行检测，使用细胞周期分析软件分析结果显示见表2。

转染组处于G1期的细胞所占比例明显高于非特异转染组和空白组，三者之间进行比较，其差异具有统计学意义（P<0.05）；特异性转染组处于S期的细胞所占比例也明显低于非特异转染组和空白组，差异同样具有统计学意义（P<0.05）。

2.4细胞凋亡变化检测结果使用BD公司细胞凋亡软件，用Annexinv-FITC和PI标记后24小时内上机检测，结果分析显示：

空白对照组和非特异转染组的细胞凋亡率分别为8.94%和7.91%，而转染组的细胞凋亡率是24.24%。

空白组合非特异转染组的凋亡比例相似，均小于特异转染组，具有统计学意义。

3讨论

迄今为止，外科手术仍然是口腔颌面部良恶性肿瘤的主要治疗手段，由于颌面部血管和神经丰富，且解剖结构复杂，为手术治疗制造了很大障碍[4]。

而基因治疗自上世纪八十年代开始受到广泛关注，目前采用RNA干扰技术针对癌基因和抗癌基因进行相关干扰，阻止或促进其表达，从而影响特定细胞比如瘤细胞的生物学活性，改变其细胞活性，进而达到抑制细胞生长，延缓肿瘤发展的目的[5]。

本课题选择了10例口腔鳞癌患者的组织标本和鳞癌细胞系作为研究对象，以研究微小RNA21在鳞癌组织中的表达情况。

同时，为了去除标本基因表达的个体差异，在肿瘤资质周围采集了正常组织粘膜标本作为对照。

研究结果表明：

在口腔鳞癌组织细胞中微小RNA21的表达明显升高，而在正常的肿瘤周围组织中微小RNA的表达明显低于实验组。

这同其他的一些在其他实体肿瘤进行的实验结果相似，这说明微小RNA21和肿瘤的生物学性状的改变关系密切。

本研究结果显示转染微小RNA21抑制剂实验组，当微小RNA21表达受抑制后，鳞癌细胞表达微小RNA21的含量明显减少，与对照组相比有显著差异，证实转染成功。

将微小RNA21抑制剂转染入实验鳞癌细胞系后，使用流式细胞仪检测各组细胞增殖、周期和凋亡的情况。

结果发现，微小RNA21受抑制后，细胞的增殖活性受到抑制，凋亡细胞明显增多。

　　以上结果均提示微小RNA21在口腔鳞癌细胞中起着癌基因的作用，能够促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。