甜菜M14品系研究进展.docx

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甜菜M14品系研究进展

第1章前言

1.1甜菜M14品系研究进展

国内著名教授郭德栋[1-3]采用培植甜菜（BetavulgarisL.）作为母本、利用野生型白花甜菜（B.corollifloraZoss.）作为父本完成甜菜种间的杂交繁殖，从而收获了具有白花甜菜的第九号染色体中携带的M14基因（VV+C9,2n=18+1）[4]。

通过后期的深入研究，表明甜菜M14体系具备很多优良种植性能，例如抗高温、耐低温、耐倒伏[5]等等，初步猜测可能是因为白花甜菜的第九号染色体的加入，令甜菜M14体系具有了野生型甜菜的多种优良种植性能，所以甜菜M14体系是研究与选用甜菜优质种植基因的最好品种。

本课题组在开始时期，针对基因组序列、DNA转录能力包括蛋白质表达性在盐胁迫条件下甜菜M14体系展开了广泛的研究，筛选出了与盐胁迫相关的差异表达的蛋白质点，主要研究的基因有：

半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因（BvM14-Cystatin）[6]、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因（BvM14-CCoAOMT）、乙二醛酶Ⅰ基因（BvM14-glyoxalaseⅠ）[7]、S-腺苷甲硫氨酸翻译生成酶基因（BvM14-SAMS2）等。

研究发现，这些基因均对甜菜M14品系在高盐、干旱以及氧化胁迫起到重要作用。

在实验开始阶段，采用抑制杂交方法，采用没有经过盐胁迫处理的对照实验组甜菜M14体系作为Driver，经过500mMNaCl处理作用的甜菜M14体系作为Tester，成立了盐胁迫作用下甜菜M14体系减弱cDNA数据库[8]。

充分利用生物学进行研究分析，挑选出完成盐胁迫作用的EST基因片段；以第21号EST为研究基础通过RACE技术获得了S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（S-adenosylmethioninedecarboxylase，SAMDC）基因的cDNA全长[9]。

本实验是在得到BvM14-SAMDC基因全长后，对甜菜M14品系中BvM14-SAMDC基因耐盐性功能分析的进一步研究，为揭示甜菜M14品系耐盐的机制提供了重要依据。

1.2S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的研究进展

1.2.1S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因序列特点

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶是一个进化上高度保守的脱羧酶家族，在原核生物和真核生物中得到的SAMDC基因序列几乎没有相似性，但是该酶在植物中有较高的相似性[10]，其本身并没有很强的酶活性，在催化作用之后产生共价双链型的丙酮酰，用作为酶催化辅基[11]。

Toms教授等人[12]验证了SAMDC在微生物中的进化作用，探究表明每类SAMDC具备的生理性能都需要依靠丙酮酰酶，采用共价双链构造的丙酮酸作为酶催化的基团，并没有采用氨基酸脱水反应里通用的磷酸吡哆醛基团。

和其他多种生物相比，植物里的SAMDC遗传序列具备很多显著的特点。

在植物里，SAMDC遗传序列基本都是开放型阅读框（main-ORF），其中并没有内含子，但是在5’非编码区前端的导序列里具有相应的内含子。

前半部分5’端携带有开放型阅读框（micro-uORFs），具有三四个密码子；下半部分3’端携带有微型uORFs（small-ORFs）具有五十多个密码子。

Schröder[13]教授等人发表的关于植物里SAMDC5’端遗传序列具有传统意义上的小型、微型阅读框，携带大约五十个氨基酸。

5’前导序列在进行转录过程中，频繁使用SAMDC基因序列，但是在哺乳动物里，SAMDC的uORFs对基因的复制具有抑制效果。

1.2.2S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的生理功能

S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）处在多胺以及乙烯的生产交点上[14、15]，同时，它也是谷胱甘肽生物合成的前体[16]。

下图1-1为一类多胺代谢反应，红框中就是SAMDC，我们可以看到生成多胺的第一步就是SAMDC的脱羧作用，合成dcSAM之后，剩余的氨丙基和Put在亚精胺作用下，反应生成酶（Spermidinesynthase，SPDS），进一步转化为Spd，并且在精胺生成酶（Sperminesynthase，SPMS）的催化下反应产生Spm。

所以，SAMDC是多胺反应途径里的十分关键的催化酶，而SPDS与SPMS是也是后续多胺生物合成途径中的关键酶。

SAMDC是一种高度调节酶类，它的调节可以通过基因表达水平实现，也可以通过转录后由多胺水平实现，无论是改变SAMDC基因表达量还是改变SAMDC酶活，都会使植物在生长过程中组织或细胞内多胺浓度相比上涨几倍[17]。

Heljasvaara[18]等人研究过转SAMDC基因老鼠，研究了老鼠体内多胺合成酶超表达以及它的调节作用，结果检测到在肝脏和大脑中，SAMDC酶活性上涨2-4倍；与SAMDC催化酶活性实时改变酶还有ODC催化酶，然而Spm与Spd的质量并没有产生显著改变。

Alcazar等人研究过转人类SAMDC基因的烟草，发现腐胺水平有所下降，但是Spm和Spd水平上涨2-3倍。

Alcazar教授等人还在盐胁迫作用下的水稻里复制出了SAMDC遗传基因，表明盐胁迫作用这类遗传基因进行表达翻译，论证出Put针对Spd与Spm的变化有助于提高水稻的抗盐性[19]。

SAMDC可以说是多胺生成代谢作用力最为关键的催化酶之一，所以本试验对探索植物的抗盐机制具有非常重要的意义。

1.2.3多胺的作用

多胺具备很强的阳离子效果，因此，它可以和很多带有负电荷的大分子相互结合在一起，例如DNA、油脂、维生素包括多种磷脂等，对保护细胞膜性能具有良好的作用效果。

多胺也可以和离子发生反应，从而生成离子作用的阻滞剂。

多胺可以采用影响离子蛋白的活性或细胞膜结构来控制离子通道，进而保证K+/Na+在植物细胞内保持平衡状态。

提高其耐盐性有文献曾报道，多胺被称为“保护膜”。

亚精胺的升高使（Spd+Spm）/Put的比值升高对于植物的抗逆作用是很重要的。

在盐胁迫作用下，植被体内的多胺浓度会产生很大的改变，抗盐性良好的植被可以富集浓度很高的Spd与Spm，但是抗盐性很差的植被在盐胁迫作用下富集浓度很高的Put。

因此，多胺的浓度提升就能够增加植被对盐胁迫作用的抵抗力。

多胺的合成方式是植被在不利环境下作用机制里一个关键构成部分，因此，展开多胺催化酶的实验研究，是认识多胺的作用效果的主要方式。

1.3盐胁迫对植物生长的影响

植物经常会遭受到各种不利生长环境的影响，例如严寒、盐分、干旱以及低氧等，上述不利生长环境会对植被正常生长产生严重的威胁甚至破坏。

因此盐胁迫所导致的渗透作用是造成植物发育不良的主要环境问题[33-35]；植被器官在遭受多种不利的生长环境胁迫的时候，植物的细胞膜将最先受到损坏，细胞膜的渗透性提高[36、37]，假如把受损坏的器官放置在无离子溶液里，外部溶液里电解质的浓度要比植物组织内的溶液浓度大，组织会进一步损坏，电解质浓度越高损坏程度越大。

使用电导仪检测外部电导率的改变，能够表现出细胞膜的受损程度。

电导率的数值越大表明细胞膜遭受的伤害越多；盐胁迫还可以阻止植物蛋白质的生成，以及叶绿素减少导致植被叶片变黄[38、39]，植物的光合系统会受到损伤，植物叶片中离子平衡及细胞膜的结构遭到破坏，使叶片的潜在活力下降，降低了叶绿素的活性，进而抑制了植物的生长[40]；与此同时，在盐胁迫作用下，植物会大量累积活性氧，活性氧浓度的提升会进一步产生氧化胁迫作用，这就是很多植被针对外界环境变化产生应激的一个重要部分[41、42]。

朱志华[43]教授曾经提出，高浓度的盐溶液对烟草种子的成长具有非常显著的抑制作用，这是因为高浓度盐溶液会导致植物细胞严重缩水，从而严重妨碍种子的生长发育，从而妨碍种子的萌芽[44、45]。

盐胁迫针对植物产生损坏的主要原因是由于高浓度离子的毒性，包括高浓度离子所产生的渗透压一级营养损失。

Na+与K+的超负荷累积是造成离子毒性的首要成因。

盐胁迫作用下的植物体，在自身Na+富集的过程中，K+的浓度不断减少，所以K+的实际浓度在植被抗盐性研究中具有十分关键的作用地位。

亚精胺催化酶SPDS刺激腐胺产生亚精胺，精胺催化酶SPMS刺激亚精胺和氨丙基进行反应产生精胺，上述两类催化酶也正是多胺反应过程里的作用酶。

刘婷婷[46]教授把苹果中MdSPDS1遗传基因转移到烟草中，转基因烟草中的亚精胺浓度显著提升，同时抗盐性以及抗病毒水平都大大提升。

SPMS和SPDS具有很强的同宗同源性，实验结果分析可知，SPMS非常有可能是从SPDS[47]进化而来。

SPMS可以在高浓度盐溶液以及缺水条件下对生物起到保护[48,49]，当植物遭受高温或者缺水等问题的时候，Spm高浓度富集就非常普遍了[50-52]。

在长时间的生长环境下，植物逐渐进化出了针对多种不利环境的抵抗性以及适应性。

研究不断表明，在植物遭受到盐胁迫作用的时候，通常会在自身体内生成一类具有渗透作用从而保护自身组织的化合物质等[53、54]，多胺的主要作用就是保障植物里的电子平衡，从而保障植物细胞具有正常的溶液浓度、维护细胞活性以及细胞组织正常等效果[55、56]。

植物体内还有一套抗氧化防御系统，这个氧化防御系统包括一些抗氧化酶[57]、类胡萝卜素[58]和维生素E[59]、生育醌[60]、抗坏血酸[61]以及谷胱甘肽[62等。

最近几年以来，国内外的专家学者们也不断提取出了很多在逆境条件下诱导产生的遗传基因，这些遗传基因可以对植物细胞产生有效的保护，在不利条件下，诱导的遗传基因进行表达同时在数据信息传递过程里发挥巨大作用[63、64]。

第3章结果与分析

3.1甜菜M14品系BvM14-SAMDC基因cDNA全长的获得

3.1.1甜菜M14品系叶片总RNA的获得

通过DNA/RNA计算设备检测可以得知获得的甜菜M14体系的叶片中RNA总浓度是1.94ug/μL，A260/A280依次是1.827，A260/A230比值是2.034，这就表明获得的RNA总质量以及总浓度都满足接下来深入研究的需求，使用凝胶处理提取出叶片中的RNA，处理结果如下图3-1所示。

根据下图3-1可以得知，28SrRNA的亮度比18SrRNA的亮度高出一倍，这就说明获得的RNA比较完整，效果良好，能够用在接下来的反转录翻译过程中。

3.1.2甜菜M14品系BvM14-SAMDC基因cDNA全长的获得

根据实验室前期获得的SAMDC基因全长设计引物SAMDC-1s和SAMDC-1as进行PCR。

PCR扩增生成物在1%琼脂凝胶实验中，测试结果如下图3-2所示：

产生的白带长度在2000bp范围之内，与试验前期结果的1960bp相符合，能够把白带进行回收利用，完成测序。

3.2甜菜M14品系BvM14-SAMDC基因的生物信息学分析

3.2.1序列全长及开放阅读框分析

通过基因全长引物SAMDC-1s和SAMDC-1as扩增出的iBvM14-SAMDC基因全长共1960bpi，将其序列进行开放阅读框分析及编码蛋白质结果如图i3-3：

ORF测试结果表明：

提取到的BvM14-SAMDC遗传基因cDNA长度是1960bp，5’非编码区长度是700bp，3’非编码区长度是141bp，开放型区域长度是1119bp（含有终止码），总共有372个aa，具有S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶保守结构域，相对分子量是40.7kDa，点位是4.65。

下图里的绿色条框就是起始码，红色条框是终止码，粉色条框指的是β型折叠，黄色条框指的是α型旋转。

图3-6BvM14-Tpx蛋白多重序列比对

Fig.3-6MμLtipLesequenceaLimentofthededucedaminoacidsequenceoftheBvM14-Tpxandotherreportedproteins

3.2.2蛋白质亲/疏水性预测分析

采用ProtScale在线程序预测BvM14-SAMDC氨基酸序列的亲水性/疏水性，结果如图3-4所示。

在多肽链中的105位达到最大值2.533，亲水性能最差，第366位达到最小值-3.344，疏水性最弱。

在所有肽链分布里，疏水性的氨基酸含量比较少。

3.2.3蛋白质信号肽和跨膜结构预测

对BvM14-SAMDC蛋白推定蛋白质信号肽和跨膜结构预测结果如图3-5所示。

结果表明，BvM14-SAMDC蛋白无信号肽，无跨膜结构。

3.2.4多重序列比对和系统进化树分析

利用NCBiI网站中的Blastpi软件对甜菜M14i品系BvM14-SAMDC基因编码蛋白序列进行分析。

结果如图3-6所示，图中红色部分代表保守结构域

3.3甜菜M14品系BvM14-SAMDC基因组织特异性表达分析

3.3.1甜菜M14品系根、茎、叶、花cDNA的获得

采用DNA/RNA计算设备检测可以得知甜菜M14体系根部、茎部、花叶等器官中RNA的总浓度依次是1.92、2.03、1.94、2.03ug/μL，A260/A280分别为1.952、1.960、1.827、1.978，A260/A230为2.136、2.092、2.034、2.086，这充分说明RNA的总质量和总浓度满足接下来深入检测的需求，使用凝胶提取根部、茎部、花叶中的RNA含量，处理结果如下图3-8所示。

3.3.2BvM14-SAMDC基因实时荧光定量PCR引物特异性检测

通过实时荧光定量PCR产物的溶解曲线分析，可以判定内参基因18SrRNA和BvM14-SAMDC基因在甜菜M14品系根、茎、叶、花各器官实时荧光定量PCR产物的溶解曲线表明特异性良好。

3.3.3BvM14-SAMDC基因的组织特异性表达定量分析

通过本次试验，检测了甜菜M14体系中BvM14-SAMDC遗传基因的根部、茎部、花叶等多个组织器官含有的Ct数值来针对BvM14-SAMDC遗传基因展开定性的分析研究，方程式是鰰△△CT=（Ct.SAMDC-Ct.18S）Timex-（Ct.SAMDC-Ct.18S）Time0，在方程式里，Ct.SAMDC=SAMDC遗传基因的Ct大小，Ct.18S是实际Ct大小，Time0=根部，Timex=叶片、茎部、花。

因此2-△△CT指的是叶片、茎部、花里遗传基因相对于根部的含量改变系数。

统计结果如下表3-1：

按照下表3-1数据信息绘制出柱形图，如下图3-9所示

根据上图3-9分析可得，BvM14-SAMDC遗传基因在甜菜M14体系的根部、茎部、花叶等器官中的含量并不完全相同，其中，在叶片里的含量最少，在根部的含量最多。

3.3.4BvM14-SAMDC基因的组织特异性表达结果半定量PCR的验证

BvM14-SAMDC基因组织特异性表达的结果已经通过扩增效率、溶解曲线、Ct值等用数学方法算出，为了再次验证结果的准确性，将实时荧光定量PCR反应的生成物依次吸收7μL产物完成1%琼脂凝胶实验。

采用一般的半定量RT-PCR的方法对结果进行再次验证，结果如图3-10：

根据下图3-10分析可得，1%琼脂凝胶实验测试结果表现出一条白带，并且BvM14-SAMDC基因在根中的亮度高于其他条带，从而进一步验证了实时荧光定量PCR反应结果的真实性。

3.4BvM14-SAMDC基因的原核表达

3.4.1原核表达载体pET28a-BvM14-SAMDC的构建

3.4.1.1BvM14-SAMDC基因片段的获得

通过基因特性引导物质S-WL-SAMDC与AS-WL-SAMDC，采用甜菜M14体系500mM盐胁迫作用下遗传cDNA一条单链作为模板完成PCR扩增扩用。

PCR扩增完成之后，把PCR扩增产物展开1%琼脂凝胶实验，实验结果如下图3-11（a）所示。

把PCR扩增产物和pMD18-T连接在一起，转移到大肠杆菌中之后，提取出质粒，完成EcoRⅠ与SalⅠ酶切检测，把酶切产物展开1%琼脂凝胶实验，实验结果如下图3-11（b）所示。

根据上图分析可得，BvM14-SAMDC遗传基因已经加载到了pMD18-T载体中，能够应用在接下来的合成原核翻译载体中。

3.4.1.2质粒pET28a的提取

采用碱裂解法从大肠杆菌中将pET28a质粒载体提取出来，鰰实验结果如下图3-12所示。

基因片段长度大约在5026bp范围之内，满足pET28a质粒载体的长度要求。

条带清晰，没有杂带，质粒没有断裂现象，可以进行下一步试验。

M14-SAMDC重组质粒载体的验证

分别提取pMD18-T-BvM14-SAMDC重组载体和pET28a载体质粒，依次展开EcoRⅠ与SalⅠ酶切处理之后，把酶切生成物进行回收、利用，转移到大肠杆菌JM109里，对获得的大肠杆菌完成基因特性引导物质S-WL-SAMDC与AS-WL-SAMDC的PCR扩增、检测、载体引导物质ETY-S与ETY-AS的PCR扩增包括EcoRⅠ与SalⅠ的酶切检测，如下图3-13与3-14所示。

采用引导物质以及特性引导物质PCR扩增处理之后获得的基因片段长度和预期长度基本相同，酶切处理之后产生的条带长度也和预期设计的条带长度基本相同，这表明在本次试验中，生成的质粒载体有效，能够应用在接下来的采用热激法，转移到表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）中，进行BvM14-SAMDC蛋白原核表达试验。

3.4.2BvM14-SAMDC蛋白的原核诱导表达

把携带有质粒片段基因的大肠杆菌BL21（DE3）依次采用浓度是0.1mM、0.5mM、1mM的IPTG作为转基因菌株的诱导剂，在37℃条件下诱导BvM14-SAMDC蛋白的原核表达，用超声波将菌液破碎后离心。

分别取上清、沉淀和菌体总蛋白以空质粒载体作为对照跑SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图3-15。

由图3-15可知，和对照组的菌体对比，在IPTG作用影响下，负载有pET28a-BvM14-SAMDC的阳性菌株在总蛋白以及上清里具有一定的蛋白翻译表达差异，在沉淀过程里更加显著，长度大约是40KDa，与预期大小一致，其中在1.0mM的IPTG作为诱导剂时，条带颜色最为明显，诱导效果也最好。

3.4.3BvM14-SAMDC蛋白的Western印记鉴定

3.4.3.1BvM14-SAMDC蛋白浓度的测定

把BvM14-SAMDC蛋白通过纯化处理之后，检测在A595条件下的吸光大小是0.186，推算可知蛋白浓度是0.0468mg/L。

3.4.3.2BvM14-SAMDC蛋白的Western印迹鉴定

提取10mg的BvM14-SAMDC蛋白完成Western检测鉴定，鉴定结果如下图3-16所示。

根据图3-16可以得知，通过IPTG作用三个小时之后的菌体蛋白在40kDa范围内产生条带，蛋白长度和携带His标记的蛋白长度基本相同，因此可以确定这个条带就是蛋白pET28a-BvM14-SAMDC，说明BvM14-SAMDC蛋白在基因表达过程里可以顺利翻译表达。

3.5BvM14-SAMDC基因在拟南芥中的表达及功能鉴定

3.5.1植物表达载体pCAMBIA1305.1-BvM14-SAMDC的构建

3.5.1.1BvM14-SAMDC基因片段的获得

采用基因特性引导物，通过甜菜M14体系在500mM盐胁迫作用下植物cDNA中的一条单链作为模板完成PCR扩增。

在完成PCR扩增作用之后，把PCR扩增产物展开1%琼脂凝胶电泳实验，实验结果如下图3-17（a）所示。

把PCR扩增产物和pUCm-T相互连接起来，转移到大肠杆菌JM109基因片段之后，取出质粒，展开EcoRⅠ与BamHⅠ的检测，把验证产物展开1%琼脂凝胶电泳实验，实验结果如下图3-17（b）所示。

图片中片段在1100bp左右符合BvM14-SAMDC基因的大小，证明扩增产物正确，可以进行下一步试验。

由图3-17可知，BvM14-SAMDC基因片段已成功连接pUCm-T载体。

3.5.1.2质粒pCAMBIA1305.1的提取

采用碱裂解法提取pCAMBIA1305.1质粒载体，鰰如下图3-18所示。

基因片段长度基本都是在12000bp范围内，符合pCAMBIA1305.1质粒载体的大小。

条带清晰，没有杂带，质粒没有断裂现象，可以进行下一步试验。

3.5.1.3pCAMBIA1305.1-BvM14-SAMDC重组载体的验证

分别提取pUCm-T-BvM14-SAMDC载体和pCAMBIA1305.1载体质粒，依次展开EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切作用之后，把酶切产物进行回收利用，转移到大肠杆菌的基因JM109里，对获得到的基因片段展开基因特征引导物的验证作业，如下图3-19与3-20所示。

由图3-20可知，通过特异引物PCR筛选及双酶切验证，确定pCAMBIA1305.1-BvM14-SAMDC重组载体构建成功，就能够开始接下来的转基因农杆菌EHA105的测试。

3.5.2.3利用花絮侵染法获得转基因恢复植株

利用转化pCAMBIA1305.1-BvM14-SAMDC的阳性农杆菌，花絮侵染法转化的拟南芥突变株以及野生型，获得所有的种子。

把采集到的种子放置在1/2MS培养基中（添加Kan60mg/L）如图3-25。

筛选阳性转基因植株，获得了大量抗性植株，将平板中绿色植株移入土中，以供下一步转基因拟南芥的分子生物学检测。

3.5.3阳性转基因植株的基因组PCR筛选

采用CTAB大规模小量法提取转基因拟南芥恢复植株基因组，以S-WL-SAMDC和AS-WL-SAMDC为引物，完成PCR扩增处理，选择结果如下图3-26所示。

挑选出转基因型植物叶片中多有的RNA片段，完成反转录作用生成cDNA一条链，利用特异引物S-WL-SAMDC和AS-WL-SAMDC进行RT-PCR反应，结果如图3-27所示。

根据上图可以得知，基因序列PCR与RT-PCR的检验结果和预测结果基本相同，这就说明BvM14-SAMDC遗传基因已经顺利添加到拟南芥野生型（WT）、拟南芥突变型（KO），并且生成了拟南芥充分表达型植物（OX）、拟南芥突变体恢复植株（CO）。

3.5.4T2代阳性转基因植株的抗盐性鉴定

3.5.4.1对拟南芥植株鲜重、根长的测定

将拟南芥野生型植株（WT）、SAMDC基因突变株（KO）、SAMDC遗传基因突变植株（CO）、SAMDC遗传基因过表达型植株（OX）在1/2MS培养基中，正常生长7d后，把植株依次转移到具有100mMNaCl的1/2MS培养基里，14个小时后检测植物的重量、根部长度，检测结果如下图3-28所示。

由图3-28可知，在100mMNaCl处理下SAMDC基因拟南芥突变株KO根的伸长明显受到了抑制，但是野生型拟南芥WT、转基因型植物CO都可以正常发育，拟南芥植物OX的根部相对来说比较长。

在100mMNaCl处理下SAMDC基因拟南芥突变株KO的植株鲜重比其它植株小，转基因恢复植株CO、野生型拟南芥WT比KO植株稍重，可以正常生长，拟南芥过表达植株OX最重。

说明BvM14-SAMDC基因可以减小盐胁迫对植株生长发育的抑制作用。

3.5.4.4拟南芥植株K+、Na+离子含量的测定

按照3.5.4.2处理拟南芥植株，检测拟南芥型植物里的K+、Na+实际含量。

按照钾、钠标准曲线测得的拟南芥植株叶片中的钾钠离子浓度结果如图3-31所示。

由图3-31可知，在100mMNaCl处理前后植物叶片内的钾离子含量稍有变化，其中KO的变化最大，OX的变化最小最稳定，表明在OX之植物里K+是性对较为稳定的。

当遭受胁迫的时候，植物中的K+会大大减少，Na+会大大增多，从而产生K+/Na+比例失衡。

同时，如果K+/Na+比例越低，那么植物遭受的破坏就会越严重。

如图所示Na+在处理前四种植株的含量相差不大，在完成盐胁迫作用之后，四类植物中的Na+含量大大提升，并且在KO型植物里的Na+增高最为显著，也就是说KO植株中K+/Na+比值是最低的，受到的损伤也是最大的。

OX植株的Na+增加相对来说较小，K+