浙江专用高考生物大二轮复习生物技术实践专题讲义.docx

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浙江专用高考生物大二轮复习生物技术实践专题讲义

生物技术实践专题讲义

微生物的利用与酶的应用

传统发酵技术与植物组织培养

第1讲　微生物的利用与酶的应用

[考纲要求]　1.大肠杆菌的培养和分离。

2.分离以尿素为氮源的微生物。

3.果汁中的果胶和果胶酶。

4.α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测。

1．培养基与微生物培养

提醒

（1）LB固体培养基添加琼脂等凝固剂，用于单菌落的分离。

（2）全营养LB培养基与尿素固体培养基：

①全营养LB培养基（含琼脂糖）是基础培养基；②尿素固体培养基：

选择培养基（如以尿素作为唯一氮源的尿素培养基）和鉴别培养基（如尿素培养基中加入酚红）。

（3）加入尿素前的固体培养基用高压蒸汽灭菌法灭菌，尿素溶液用G6玻璃砂漏斗过滤。

2．灭菌与消毒的比较

类型

适用范围

操作方法及注意点

消毒方法

煮沸消毒法

日常生活

100℃煮沸5～6min

巴氏消毒法

不耐高温的液体

70～75℃煮30min或80℃煮15min

化学药剂

水源或生物体结构部分等

擦拭，如用70%酒精擦拭双手；成熟紫葡萄用高锰酸钾浸泡5min；外植体在70%酒精中浸泡10min，再放入5%次氯酸钠溶液中浸泡5min，然后用另一5%次氯酸钠溶液浸泡5min

紫外线

房间、仪器设备

紫外线照射30min

热水

泡菜坛等

热水清洗坛内壁两次

灭菌方法

灼烧

接种环、接种时用的试管口或瓶口等

直接在酒精灯火焰的外焰烧红接种环或试管口和瓶口过火

高压蒸汽

灭菌

生产和实验室常用器具，如培养基、培养皿等

高压蒸汽灭菌锅内，条件一般为1kg/cm2，温度121℃，15min（若为葡萄糖，则灭菌条件为500g/cm2压力，温度90℃以上，30min）；灭菌时间从高压锅内有压力后开始；高压锅或灭菌锅压力和大气压相同时才能打开锅盖

过滤灭菌

尿素等加热会分解的物质

G6玻璃砂漏斗过滤。

G6玻璃砂漏斗使用前用纸包好进行高压蒸汽灭菌；G6玻璃砂漏斗使用后用1_mol/L盐酸浸泡，抽滤去酸，再用蒸馏水洗至洗出液呈中性，干燥后保存

其他

操作空间：

专门的接种室；

操作设备：

超净台（用前打开紫外灯和过滤风，用时关闭紫外灯，台面用70%酒精擦拭）；

操作环境：

酒精灯火焰旁

3．微生物分离的两种常用方法的比较

项目

划线分离法

涂布分离法

操作原理

连续划线。

由于划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落

将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。

在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养皿表面形成单个菌落

操作工具

接种环

玻璃刮刀

使用要求

用时需灼烧

放置在70%酒精中，用时需灼烧

分离特点

操作简单，不易分离获得单菌落

操作复杂，易分离获得单菌落

分离结果（图示）

相同点

使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种

提醒

　划线分离操作的注意事项

（1）每次划线之前及最后一次划线之后都需要灼烧接种环。

（2）灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。

（3）划线时最后一区域不要与第一区域相连。

（4）划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。

4．大肠杆菌的培养与分离操作

（1）原理

①接种在LB液体培养基中使其快速分裂增殖。

②将待检测微生物样品通过划线分离法或涂布分离法接种在LB固体培养基上，样品中的每一个细胞都可以生长繁殖形成单个菌落。

（2）流程

5．分离以尿素为氮源的微生物

（1）实验原理

①筛选以尿素为氮源的微生物，使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养。

②有些细菌合成的脲酶能通过降解尿素作为其生长的氮源。

③细菌合成脲酶能将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强，pH升高，从而使加入酚红指示剂的培养基变红。

（2）操作步骤

提醒

　分离以尿素为氮源的微生物中的易错点

（1）误以为分离以尿素为氮源的微生物时，配制的培养基中加入酚红作为酸碱指示剂，加入琼脂作为凝固剂。

应加入琼脂糖作为凝固剂。

（2）误以为降解尿素的反应中反应物只有尿素。

降解尿素的反应中反应物除了尿素外还有水。

（3）误以为尿素灭菌采用高压蒸汽灭菌法。

尿素遇高温会分解，所以其灭菌方法为G6玻璃砂漏斗过滤除菌。

6．探究酶活性最适条件和用量的实验设计

（1）探究影响果胶酶活性因素实验的分析

①实验原则：

遵循单一变量原则、对照原则，严格控制变量，尽量减少无关变量的影响。

②实验原理：

果胶酶活性受温度、pH或酶抑制剂的影响，在最适温度或pH时，其活性最高，果肉的出汁率、果汁的澄清度都与果胶酶的活性大小呈正相关。

（2）三个实验的变量分析

实验名称（目的）

自变量

因变量

注意事项

探究温度对果胶酶活性的影响

温度

果汁量（澄清度）

①底物和酶在混合时的温度是相同的；

②温度梯度越小，实验结果越精确；

③苹果泥和果胶酶的用量在各个试管中应相同；

④pH应为最适pH

探究pH对果胶酶活性的影响

pH

果汁量

（澄清度）

①温度应为最适温度；

②pH梯度可用NaOH和HCl溶液调节；

③用玻璃棒搅拌使反应充分进行

探究果胶酶的

用量

果胶酶的用量

果汁量（澄清度）

①制备苹果匀浆后迅速加热，使苹果匀浆中的果胶酶变性；

②温度、pH应为最适且保持不变

提醒

　关于果胶的两点说明

（1）果胶的作用：

粘合细胞。

（2）果胶的鉴别方法：

果胶不溶于乙醇，滴加95%的乙醇出现沉淀。

7．固定化酶的制作原理、方法及作用

（1）固定化酶的制作原理、方法

（2）α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

1．微生物利用的正误判断

（1）从有机废水中分离能分解有机物的微生物时，接种后的培养皿需要放在光照培养箱中培养（　×　）

提示　异养微生物不需要光照。

（2）消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害（　√　）

（3）每一次划线后都要将接种环灼烧（　√　）

（4）除第一次划线外，每一次划线的起点都是第一次划线的末端（　×　）

提示　除第一次划线外，每一次划线的起点都是上一次划线的末端。

（5）筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源（　√　）

（6）可分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低（　×　）

提示　氨使培养基的酸碱度升高。

（7）划线分离操作简便，但涂布分离更容易得到单菌落（　√　）

（8）高压蒸汽灭菌法是进行各种无菌操作都需要进行的灭菌方法（　×　）

（9）利用LB液体培养基和LB固体培养基分别对微生物进行分离培养和扩大培养（　×　）

（10）进入无菌室，首先打开超净台上的紫外灯和过滤风，然后在酒精灯的火焰旁制备固体平面培养基（　×　）

2．酶应用的正误判断

（1）将果胶酶用于果汁生产，既能提高果肉的出汁率又能提高果汁的澄清度（　√　）

（2）酶的活性受温度、pH和酶用量等因素的影响（　×　）

提示　酶用量不影响酶的活性。

（3）果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，它溶于乙醇（　×　）

提示　果胶不溶于乙醇。

（4）用固定化α淀粉酶进行淀粉水解实验时不需考虑温度（　×　）

提示　温度影响酶的活性。

（5）固定化α淀粉酶可永久使用（　×　）

提示　固定化酶能够重复使用，但不是永久使用。

（6）α淀粉酶固定化实验结束后，将固定化柱放在常温下即可（　×　）

提示　固定化柱应低温保存。

（7）固定化酶是通过物理或化学的方法将非水溶性的酶固定在某种介质上，使之成为可重复使用的酶制剂（　×　）

（8）鉴别果胶最简便的方法是加入95%的乙醇（　√　）

（9）果胶酶常存在于动物细胞，用于消化纤维素等营养成分（　×　）

（10）制备固定化酶柱时，用10倍体积蒸馏水洗涤的目的是洗去未吸附的α淀粉酶（　√　）

考向一　考查微生物的利用

1．（2019·浙江名校协作体高三联考）请结合以下酵母菌在人类生产生活中的实际应用，回答下列问题：

（1）为了筛选出符合要求的酵母菌，科研人员在培养基中添加了青霉素，其目的是_________；为了将分离到的菌株纯化，挑取了菌落在3块相同的平板上划线，以获得单菌落。

下图所示的划线分离操作中，正确的是________。

科研人员发现其中一块平板的各划线区均未见菌生长，最可能的原因是________________________________________________。

（2）酿酒和制醋是古老的生物技术，与此生产有关的微生物分别是酵母菌和______________。

以果汁为原料经发酵制作醋的过程中，首先酵母菌在无氧条件下进行酒精发酵；然后相关菌种在________条件下将上述发酵产物转变为醋酸。

答案　

（1）抑制细菌生长　B　接种环温度过高，菌被杀死　

（2）醋化醋杆菌　有氧

解析　

（1）为了筛选出符合要求的酵母菌，科研人员在培养基中添加了青霉素，其目的是为了抑制细菌的生长。

划线分离操作中，下一次划线要在上一次划线末端处开始。

若其中一块平板的各划线区均未见菌生长，最可能的原因是接种环温度过高，菌被杀死。

（2）与酿酒和制醋有关的微生物分别是酵母菌和醋化醋杆菌。

以果汁为原料经发酵制作醋的过程中，首先酵母菌在无氧条件下进行酒精发酵；然后醋化醋杆菌在有氧条件下继续将上述发酵产物转变为醋酸，醋化醋杆菌是好氧生物。

2．（2019·浙江超级全能生9月联考）食品安全国家标准中有奶粉可能含有的细菌克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）的检测标准，其流程如图，请回答：

　　　　　　　↓36±1℃，18±2h

　　　　　　　↓44±0.5℃，24±2h

　　　　　　　↓36±1℃，24±2h

↓

　　　　　　　↓25±1℃，48±4h

↓

↓

注释　a．一般奶粉中含有的细菌较少，BPW属于增菌培养基。

b．mLST－Vm培养基：

氯化钠、胰蛋白胨、乳糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、十二烷基硫酸钠、蒸馏水、万古霉素。

c．克罗诺杆菌属及少数其他细菌能在③显色培养基上呈现较浅的蓝绿色。

d．TSA培养基：

胰蛋白胨、植物蛋白胨、氯化钠、蒸馏水等。

e．克罗诺杆菌属还有许多生化指标需要精细鉴定，最终生成报告。

（1）过程中的BPW培养基为________（填“固体”“液体”或“半固体”）培养基。

（2）②选择培养时，mLST－Vm培养基中添加的万古霉素是一种抗生素，分析可得，克罗诺杆菌属对该抗生素________（填“敏感”或“不敏感”）。

（3）由于②的培养产物细菌浓度未知，为避免对其进行稀释的工作，从②转移至③培养时，需采用的接种方法为____________。

③过程所需的显色培养基在制备时的次序是________。

A．调节pH　B．称量药品　C．溶解　D．倒平板　E．灭菌

（4）克罗诺杆菌属能产生黄色素，积累到一定量的时候，可使整个菌落呈现黄色，故TSA培养后要挑取黄色菌落，除注释中的成分外，TSA培养基中还应包含________。

（5）食品安全关系每个人的生命，对一种细菌的鉴定程序也相当严格。

在上述检测程序中，步骤____________（填序号）对克罗诺杆菌属具有一定的选择或鉴定作用。

答案　

（1）液体　

（2）不敏感　（3）划线分离法　BCAED　（4）琼脂（或琼脂糖）　（5）②③④⑤（缺一不可）

解析　

（1）BPW培养基为增菌培养基，即用于扩大培养，为液体培养基。

（2）本实验的最终目标是筛选出克罗诺杆菌属，因此步骤②中的万古霉素需要将克罗诺杆菌属保留下来，并尽可能多地杀灭其他杂菌，因此克罗诺杆菌属对万古霉素不敏感。

（3）检测样品中细菌数量不确定，经过①②培养后，菌液中的密度大小不确定，若采用涂布分离法，需要一个合适的稀释浓度，这样不符合题意，因此可采用划线分离法，接种环在平板上划线到末端时，一般可形成单菌落；制备培养基的流程为BCAED。

（4）在TSA培养基上要挑取菌落，可见TSA培养基是固体培养基，因此在配方中还应添加琼脂或琼脂糖。

（5）国家安全标准相当严格，上述流程中的②③④⑤在一定程度上都对克罗诺杆菌属进行选择或鉴定，以确保检测的准确性。

考向二　考查酶的利用

3．（2019·浙江4月选考节选）回答与果胶和果胶酶有关的问题：

（1）通常从腐烂的水果上分离产果胶酶的微生物，其原因除水果中果胶含量较高外，还因为

________________________________________________________________________。

（2）为了获得高产果胶酶微生物的单菌落，通常对分离或诱变后的微生物悬液进行________。

（3）在某种果汁生产中，用果胶酶处理显著增加了产量，其主要原因是果胶酶水解果胶使______________________________。

果汁生产中的残渣果皮等用于果胶生产，通常将其提取液浓缩后再加入___________使之形成絮状物，然后通过离心、真空干燥等步骤获得果胶制品。

（4）常用固定化果胶酶处理含果胶的污水，其主要优点有______________________和可连续处理等。

在建立和优化固定化果胶酶处理工艺时，除考虑果胶酶的活性和用量、酶反应的温度、pH、作用时间等环境因素外，还需考虑的主要有________________和____________________。

答案　

（1）腐烂的水果中含产果胶酶的微生物较多

（2）涂布分离（或划线分离）　（3）水果组织软化疏松及细胞受损　95%乙醇　（4）提高果胶酶的稳定性　固定化的方法　固定化所用的介质

4．（2019·浙江丽衢湖9月联考）回答下列“果汁中的果胶和果胶酶”的相关问题：

（1）自制的果汁很浑浊，主要是含有大量杂质，杂质的主要成分是________，可用________检测。

市售果汁为达到澄清透明且不降低品质的要求，常用______________处理。

（2）市售果汁在制作过程中要进行灭菌，灭菌是指使用强烈的理化因素杀死_______________。

不同的物质灭菌方式有所区别，如葡萄糖，为防止__________________，要用500g/cm2压力（90℃以上）灭菌30min，而尿素只能用G6玻璃砂漏斗过滤灭菌，原因是________________。

（3）果汁饮料要求细菌总数≤100个/mL，大肠杆菌数＜3个/100mL。

为了检测某成品受细菌污染情况，需要培养和计数，其中所用的细菌分离方法是______________。

答案　

（1）果胶　乙醇　果胶酶（或果胶酶和果胶甲酯酶）

（2）（物体内外）所有的微生物　葡萄糖分解碳化　尿素加热会分解　（3）涂布分离法

解析　

（1）果汁中因为含有大量的果胶而显得浑浊，果胶不溶于乙醇，可以用乙醇来对其进行检测，这是简便的鉴定方法。

为了去除果胶又不影响果汁质量，可以用果胶酶或果胶酶和果胶甲酯酶处理。

（2）灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物。

不同的物质灭菌方式有所区别，如葡萄糖，为防止葡萄糖被分解碳化，要用500g/cm2压力（90℃以上）灭菌30min；而尿素因为加热会分解，所以只能用G6玻璃砂漏斗过滤灭菌。

（3）对饮料中的细菌进行培养和计数要用活菌计数法，即涂布分离法。

1．（2019·全国Ⅰ，37）已知一种有机物X（仅含有C、H两种元素）不易降解，会造成环境污染。

某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌（目标菌）。

Ⅰ号培养基：

在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X（5g/L）。

Ⅱ号培养基：

氯化钠（5g/L），硝酸铵（3g/L），其他无机盐（适量），X（15g/L）。

Ⅲ号培养基：

氯化钠（5g/L），硝酸铵（3g/L），其他无机盐（适量），X（45g/L）。

回答下列问题：

（1）在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是__________________。

Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是________。

（2）若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会____________，其原因是_________________________________________________________。

（3）Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是__________________。

（4）假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供________和__________________。

答案　

（1）牛肉膏、蛋白胨　X　

（2）下降　不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖　（3）涂布分离法　（4）能量　合成其他物质的原料

解析　

（1）牛肉膏蛋白胨培养基中，牛肉膏、蛋白胨为微生物生长提供了氮源，而Ⅱ号、Ⅲ号培养基中除X外的其他物质均不含碳，所以能为微生物提供碳源的有机物是X。

（2）因为Ⅱ号培养基中碳源只有X，属于选择培养基，只有能降解X的细菌才能增殖，而不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖。

（3）要对菌落进行计数，应采用涂布分离法进行接种。

（4）在有氧条件下，丙酮酸参与细菌的有氧呼吸，可以为该菌的生长提供能量和合成其他物质的原料。

2．（2019·全国Ⅱ，37）物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。

W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。

某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌（目标菌）。

回答下列问题：

（1）要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是________。

（2）在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落（如图所示）。

如果要得到目标菌，应该选择____________菌落进一步纯化，选择的依据是_________。

（3）土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。

若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即__________

______________________________________________________________________________。

（4）该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶（酶E）。

为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。

①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加__________，三处滴加量相同。

②一段时间后，测量透明圈的直径。

若C处没有出现透明圈，说明________________；

若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明___________________________________。

答案　

（1）W　

（2）乙　乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W　（3）将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源　（4）①缓冲液　②缓冲液不能降解W　酶E与天然酶降解W的能力相近

解析　

（1）要从土壤中分离出能降解含氮有机物W的目标菌，所用选择培养基应以该特定物质W为氮源。

（2）题图信息显示，在乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W，若要得到目标菌，应该选择乙菌落进一步纯化。

（3）若要通过设计实验确定甲、乙两种细菌能否利用空气中的氮气作为氮源，需将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若某细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。

（4）①实验应遵循单一变量原则，故C处应滴加缓冲液。

②一段时间后，测量透明圈的直径。

若C处没有出现透明圈，说明缓冲液不能降解W；若A、B处形成的透明圈大小相近，说明酶E与天然酶降解W的能力相近。

3．回答下列与细菌培养相关的问题。

（1）在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________（填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”）。

通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是______________________________。

硝化细菌在没有碳源的培养基上________（填“能够”或“不能”）生长，原因是__________________________________________________。

（2）用平板培养细菌时一般需要将平板________（填“倒置”或“正置”）。

（3）单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是__________________________________________________。

（4）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。

答案　

（1）蛋白胨　不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同　能够　硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源　

（2）倒置　（3）在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征　（4）灭菌

解析　

（1）细菌培养时常用牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏能提供碳源、氮源、磷酸盐、维生素，蛋白胨能提供碳源、氮源、维生素，而葡萄糖不能提供氮源，NaNO3不能为微生物提供碳源。

不同细菌生长繁殖所需要的最适pH是不同的，应该根据培养细菌的不同来调节培养基的pH。

硝化细菌是化能自养型细菌，可以利用空气中的CO2作为碳源，因此在没有碳源的培养基上能够生长。

（2）在平板培养基上培养细菌时，一般需要将平板倒置，这样可以防止皿盖上的水珠落入培养基。

（3）不同种类的细菌所形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定的特征，不同种细菌在一定培养条件下表现出各自稳定的菌落特征，可以作为菌种鉴定的重要依据。

（4）使用后的培养基在丢弃前需要进行灭菌处理，以免污染环境。

4．（2018·浙江金丽衢十二校5月联考）普通酵母菌直接利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因转入酵母菌中，经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种（过程如图1所示）。

请回答下列问题：

（1）图1中，为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以____________作为唯一碳源。

②、③过程需重复几次，目的是______________________________________________________。

（2）某同学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图2所示。

该同学的接种方法是________________________________________________________________________；推测该同学接种时可能的操作失误是________________。

（3）以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵母菌在相同的适宜条件下密闭发酵，接种工程酵母菌的发酵罐需要先排气，其原因是______________________________________________。

（4）上述工程酵母菌培养过程中，有关操作正确的是______。

A．玻璃刮刀无需灭菌

B．培养基分装到培养皿后进行灭菌

C．倒平板和取菌液都必须在酒精灯火焰旁进行

D．获得的菌种如果需要保存，可置于37℃恒温保存

答案　

（1）淀粉