微生物学实验指导书包工学生用.docx
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微生物学实验指导书包工学生用
实验一细菌革兰氏染色法实验
一、实验内容
1.学习微生物涂片及无菌操作技术；
2.学习革兰氏染色技术。
二、实验目的
1．学习微生物涂片及无菌操作技术；
2．掌握革兰氏染色技术，了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类学上的意义；
3．进一步巩固显微镜的使用技术。
三、实验原理及实验步骤
（一）实验原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。
革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。
实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。
革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
（二）实验步骤
涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。
（见图1）
（1）涂片
①常规涂片法
取一洁净的载玻片，用记号笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片（取菌时需保持无菌操作，以免污染菌源，无菌操作的方法和步骤见图2），干燥、固定（见图3）。
玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
②“三区”涂片法
在玻片的左、右端各加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与左边水滴充分混合成仅有枯草芽孢杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。
再用无菌的接种环调取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量的大肠杆菌液延伸到玻片中央，与枯草芽孢杆菌相混合含有两种菌的混合区，干燥、固定。
要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
（2）初染
滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）于两个玻片的涂面上，染色1～2min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。
（3）媒染
用碘液媒染约lmin，水洗。
（4）脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。
脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
脱色时间一般约20～30s。
（5）复染
在涂片上滴加番红液复染约2～3min，水洗，然后用吸水纸吸干。
在染色的过程中，不可使染液干涸。
（6）镜检
干燥后，用油镜观察。
判断两种菌体染色反应性。
菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。
（附显微镜的构造与使用步骤）
（7）实验结束后处理
清洁显微镜。
先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。
染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。
图1革兰氏染色程序
1加草酸铵结晶染lmin；2水洗；3加碘液媒染lmin；4水洗；5乙醇脱色约20–30s；6水洗；7番红复染约2min；8水洗；9用吸水纸吸干
图2无菌操作过程图3涂片、干燥和热固定
四、实验器具材料
1.器材：
显微镜、香泊油、二甲苯、擦镜纸、载玻片、接种环、酒精灯、火柴、吸水纸。
2.染色液及试剂：
蒸馏水、结晶紫染色液、路戈氏碘液、95%的酒精、番红染色液。
3.菌种：
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌斜面菌种。
五、思考题
1.哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？
其中最关键的环节是什么？
2.进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题?
3.革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?
乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?
4.不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？
5.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?
6.如果涂片未经热固定，将会出现什么问题?
加热温度过高、时间太长，又会怎样呢?
附：
显微镜的构造与使用步骤
1、显微镜的主要构造
普通光学显微镜的构造主要分为三部分：
机械部分、照明部分和光学部分。
见图4。
图4普通光学显微镜的结构示意图
1.物镜转换器；2.物镜；3.游标卡尺；4.载物台；5.聚光器；6.彩虹光；7.光源；8.镜座；9.电源开关；10.光源滑动变阻器；11.粗调螺旋；12.微调螺旋；13.镜臂；14.镜筒；15.目镜；16.标本移动螺旋
（1）机械部分
①镜座：
是显微镜的底座，用以支持整个镜体。
②镜柱：
是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。
③镜臂：
一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。
④镜筒：
连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。
⑤物镜转换器（旋转器）：
接于棱镜壳的下方，可自由转动，盘上有3－4个圆孔，是安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声时，方可进行观察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。
⑥镜台（载物台）：
在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔，我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器（推片器），推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可使玻片标本作左右、前后方向的移动。
⑦调节器：
是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。
a粗调节器（粗螺旋）：
大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台作快速和较大辐度的升降，所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野中，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物象。
b细调节器（细螺旋）：
小螺旋称细调节器，移动时可使镜台缓慢地升降，多在运用高倍镜时使用，从而得到更清晰的物象，并借以观察标本的不同层次和不同深度的结构。
（2）照明部分
装在镜台下方，包括反光镜，集光器。
①反光镜：
装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱的时候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。
②集光器（聚光器）位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。
a聚光镜：
由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光线射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的强弱。
b光圈（虹彩光圈）：
在聚光镜下方，由十几张金属薄片组成，其外侧伸出一柄，推动它可调节其开孔的大小，以调节光量。
（3）光学部分
①目镜：
装在镜筒的上端，通常备有2－3个，上面刻有5×、10×或15×符号以表示其放大倍数，一般装的是10×的目镜。
②物镜：
装在镜筒下端的旋转器上，一般有3－4个物镜，其中最短的刻有“10×”符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，最长的刻有“100×”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。
在物镜上，还有镜率（N.A.）的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜率如下表：
物镜
镜率（N.A.）
工作距离（mm）
10×
0.25
5.40
40×
0.65
0.39
100×
1.30
0.11
表中的工作距离是指显微镜处于工作状态（物象调节清楚）时物镜的下表面与盖玻片（盖玻片的厚度一般为0.17mm）上表面之间的距离，物镜的放大倍数愈大，它的工作距离愈小。
显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为10×，目镜为10×，其放大倍数就为10×10=100。
2、实验步骤
（1）低倍镜观察
①取镜和放置：
显微镜平时存放在柜或箱中，用时从柜中取出，右手紧握镜臂，左一手托住镜座,将显微镜放在自己左肩前方的实验台上，镜座后端距桌边1－2寸为宜，便于坐着操作。
②对光：
用拇指和中指移动旋转器（切忌手持物镜移动），使低倍镜对准镜台的通光孔（当转动听到碰叩声时，说明物镜光轴已对准镜筒中心）。
打开光圈，上升集光器，并将反光镜转向光源，以左眼在目镜上观察（右眼睁开）,同时调节反光镜方向，直到视野内的光线均匀明亮为止。
③放置玻片标本：
取一玻片标本放在镜台上，一定使有盖玻片的一面朝上，切不可放反，用推片器弹簧夹夹住，然后旋转推片器螺旋，将所要观察的部位调到通光孔的正中。
④调节焦距：
以左手按逆时针方向转动粗调节器，使镜台缓慢地上升至物镜距标本片约5mm处，应注意在上升镜台时，切勿在目镜上观察。
一定要从右侧看着镜台上升，以免上升过多，造成镜头或标本片的损坏。
然后，两眼同时睁开，用左眼在目镜上观察，左手顺时针方向缓慢转动粗调节器，使镜台缓慢下降，直到视野中出现清晰的物象为止。
如果物象不在视野中心，可调节推片器将其调到中心（注意移动玻片的方向与视野物象移动的方向是相反的）。
如果视野内的亮度不合适，可通过升降集光器的位置或开闭光圈的大小来调节，如果在调节焦距时，镜台下降已超过工作距离（>5.40mm）而未见到物象，说明此次操作失败，则应重新操作，切不可心急而盲目地上升镜台。
（2）高倍镜观察
①选好目标：
一定要先在低倍镜下把需进一步观察的部位调到中心，同时把物象调节到最清晰的程度，才能进行高倍镜的观察。
②转动转换器，调换上高倍镜头，转换高倍镜时转动速度要慢，并从侧面进行观察（防止高倍镜头碰撞玻片），如高倍镜头碰到玻片，说明低倍镜的焦距没有调好，应重新操作。
③调节焦距：
转换好高倍镜后，用左眼在目镜上观察，此时一般能见到一个不太清楚的物象，可将细调节器的螺旋逆时针移动约0.5-1圈，即可获得清晰的物象（切勿用粗调节器!
）
如果视野的亮度不合适，可用集光器和光圈加以调节，如果需要更换玻片标本时，必须顺时针（切勿转错方向）转动粗调节器使镜台下降，方可取下玻片标本。
（3）油镜观察
①在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。
②将集光器上升到最高位置，光圈开到最大。
③转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。
④用左眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。
如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外重找时应按：
低倍→高倍→油镜程序。
在加油区内重找应按：
低倍→油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。
⑤油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。
3、显微镜使用的注意事项
（1）持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或碰撞到其它地方。
（2）轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，以免碰翻落地。
（3）保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，机械部分用布擦拭。
（4）水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即擦净。
（5）放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏物镜。
（6）要养成两眼同时睁开的习惯，以左眼观察视野，右眼用以绘图。
（7）不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要任意拆卸各种零件，以防损坏。
（8）使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内，其步骤是：
取下标本片，转动旋转器使镜头离开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器（但不要接触反光镜）、关闭光圈，推片器回位，盖上绸布和外罩，放回实验台柜内。
最后填写使用登记表。
（注：
反光镜通常应垂直放，但有时因集光器没提至应有高度，镜台下降时会碰坏光圈，所以这里改为平放）
实验二微生物的显微镜直接计数实验
一、实验内容
用显微镜直接计算啤酒酵母菌培养液的酵母菌数。
二、实验目的
了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。
三、实验原理及实验步骤
1．实验原理
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。
菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（PetrofHausser）细菌计数板。
两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
镜检计数法是将单细胞微生物的悬液或孢子悬液，注入血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数的。
所以可根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内微生物的数目，包括死菌和活菌。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图1），计数区的刻度有两种（图2）：
一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。
但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
图1计数网的分区和分格
图2血球计数板构造
A.正面图；B.纵切面图
1.血球计数板；2.盖玻片；3.计数室
计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。
盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
已知：
1cm3体积=10mm×10mm×10mm=1000mm3
所以：
1cm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106。
因此：
每ml菌悬液中含有细胞数=每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）
2．实验步骤：
1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。
2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
3．将待测菌的菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。
也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。
然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。
4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。
由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。
如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。
如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。
每个样品重复计数2-3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。
7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。
洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
四、实验器具材料
1器材：
血球计数板（含特制的盖玻片）、显微镜、玻棒、吸水纸、擦镜纸、1ml无菌吸管。
2计数样品：
稀释10倍的啤酒酵母菌培养液，9ml无菌水（试管装）
五、思考题
1计算每毫升（每克）所测样品的含菌数。
2用血球计数板测定微生物细胞数量有何优缺点？
实验三培养基的配制与灭菌
一、实验内容
细菌培养基的配置、酵母菌培养基的配制、霉菌培养基的配制、高压蒸汽灭菌灭菌方法。
二、实验目的
1．了解各类微生物培养基配制的方法。
2．掌握高压蒸汽灭菌的方法及基本原理。
三、实验原理及实验步骤
（一）实验原理
1.培养基配制的原理
牛肉膏蛋白胨培养基被广泛用于培养细菌，麦芽汁培养基和马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养酵母菌和霉菌。
马铃薯葡萄糖培养基有时也可用于培养放线菌。
豆芽汁葡萄糖培养基也是培养酵母菌及霉菌的一种优良培养基。
察氏培养基主要用于培养霉菌观察形态用。
麦芽汁培养基为天然培养基，马铃薯葡萄糖培养基和豆芽汁葡萄糖培养基二者均为半合成培养基，而察氏培养基则为合成培养基。
培养基配方中出现的自然pH系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现的pH。
2.高压蒸汽灭菌的原理
高温可以使细胞原生质变性而失去生命能力，因此一般采用加热的方法进行灭菌和消毒。
此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内0.1MP，121℃保持15-30min进行灭菌。
时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌为准。
这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。
待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。
导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。
其原因有三：
一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表1），二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸汽有潜热存在。
1g水在100℃，由气态变为液态时可放出2.26U（千焦）的热量。
这种潜热能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气的蒸汽温度低于饱和蒸汽的温度。
灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见（表2）。
现在法定压力单位已不用磅和kg/cm3表示，而是用Pa或bar表示，其换算关系为：
1kg/cm3=98066.5Pa，1Ib/in2=6894.76Pa。
一般培养基用0.1MPa（相当于1Ib／in2或1.05kg／cm3），121.5℃，l5-30min可达到彻底灭菌的目的。
灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。
例如含糖培养基用0.06MP（8Ib/in2或0.59kg/cm3），112.6℃灭菌15min但为了保证效果，可将其他成分先行121.5℃，20min灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。
又如盛于试管内的培养基以0.1MPa、121.5℃灭菌20min即可，而盛于大瓶内的培养基最好以0.1MPa122℃灭菌30min。
表1蛋白质含水量与凝固所需温度的关系
卵白蛋白含水量%
30分钟内凝固所需温度℃
50
56
25
74-80
18
80-90
6
145
0
160-170
表2灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系
压力表
全部空气排出时的温度
2/3空气排出时的温度
1/2空气排出时的温度
1/3空气排出时的温度
空气全不排出时的温度
MPa
Kg/cm3
Ib/in2
0.03
0.35
5
108.8
100
94
90
72
0.07
0.70
10
115.6
109
105
100
90
0.10
1.05
15
121.3
115
112
109
100
0.14
1.40
20
126.2
121
118
115
109
0.17
1.75
25
130.0
126
124
121
115
0.21
2.10
30
134.6
130
128
126
121
（二）实验步骤
1、培养基配制步骤
（1）牛肉膏蛋白胨培养基的配制
1）培养基成分
牛肉膏3g
蛋白胨10g
NaCl5g
琼脂10-20g
蒸馏水1000ml
pH7.0-7.2
2）配制方法
①称量
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。
牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。
也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。
另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。
②溶化
在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。
待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。
最后补足所失的水分。
③调pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达所需pH范围内。
反之，则用1mol/LHCl进行调节。
注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。
对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。
④过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。
一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。
⑤分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。
分装过程中注意以下事项：
a.不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。
b.液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。
c.固体分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。
分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
d.半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
⑥加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。
⑦包扎
加塞后，将全部试管用橡皮筋捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用橡皮筋扎好。
用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用橡皮筋扎好，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
⑧灭菌
将上述培养基以0.1MPa，121．3℃，20min高压
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