抗冻机制ICECBFCOR途径及抗冻相关蛋白的研究文献综述和外文翻译.docx

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抗冻机制ICECBFCOR途径及抗冻相关蛋白的研究文献综述和外文翻译

文献综述和外文翻译

（2012届本科）

文献综述

题目：

抗冻机制ICE-CBF-COR途径及抗冻相关蛋白的研究

抗冻机制ICE-CBF-COR途径及抗冻相关蛋白的研究

摘要：

低温对农业的产生巨大的影响，特别是在对农作物的品质和产量上。

全球大部分农作物种植区在北半球以北的温寒带地区，这些地区小麦、玉米、水稻等主产农作物，每年因低温灾害使得农作物损失高达2000多亿美元，加上环境日益恶化，气候异常，低温可能随时侵袭冬季农作物，损失将会更严重。

如何提高农作物的耐低温能力进而提高农作物品质与产量已经成为研究的重点。

目前，与植物抗冻性有关的分子生物学研究取得了很大进步，大量研究发现表明经过冷驯化可诱导植物相关抗冻基因及其它调节因子的表达，进而提高植物的抗冻性。

抗冻机制中ICE-CBF-COR途径在提高植物抗冻性方面发挥着重要作用，并且研究较多，本文介绍了ICE-CBF-COR的机制以及相关的抗冻蛋白研究概况。

关键词：

低温；抗冻；ICE-CBF–COR；抗冻相关蛋白

植物机体细胞内的生物膜体系与植物抗冻性有密切关系。

当寒冬来临或是遇到骤然低温时，非抗冻性植物细胞的生物膜会发生相变，使之液晶相变成凝胶状态，并且使膜的结构破坏，结果在原生质膜上形成透性较大的非脂类的“洞穴”，成为许多电解质自由出入的通道，细胞质内的溶胶因而大量排出，最终引起植物死亡。

许多植物在遭受严寒前经过一个缓慢的降温过程，其抗冷性会逐渐提高，这一过程称为冷驯化或冷锻炼。

冷驯化实质就是进过低温信号转导，植物调节自身以适应环境的过程。

冷驯化可以在一定程度上该改变植物体内的一系列生理反应，通过外界环境温度因子刺激植物的相关信号受体，经植物本身的特有的信号传导系统，进而调节植物抗冻蛋白和其它调节蛋白表达，非蛋白因子（IP3,ABA等）含量，从而提高植物抗冻能力。

在冷驯化中，根据基因表达的蛋白产物，可将其分为两大类蛋白，一类是具有直接保护细胞免受胁迫伤害的功能蛋白；另一类是传递信号和调控基因表达的调节蛋白[1]。

传统育种法在提高植物抗冻性上存在诸多缺点，因而利用转基因技术定向提高植物的的某一功能是现代育种的重要方法，是当今研究作物育种研究的热点。

植物抵御冻害的途径主要有2条:

一是避免细胞内冰晶的形成和阻止冰晶的生长；二是维持细胞膜的结构稳定性和蛋白质核酸的生物活性。

因此，改造作物抗冻遗传特性的分子生物学工作也主要是围绕着这两个方面进行的。

对于抗冻蛋白（AFPs）及其基因的研究就是其中的一项重要内容.抗冻蛋白有抑制冰晶生长的作用，而且这种作用在不同的方向上有强弱之分，因而引起冰晶形态的改变。

[2]

图1.低温影响植物的过程

图2.非依赖于ABA的非冷驯化机制中的ICE-CBF-COR途径

抗冻基因ICE-CBF-COR途径

在植物适应低温胁迫的过程中，其体内发生了一系列分子水平的反应。

这些反应按照有序的时空顺序发生，相互联系，形成了一整套低温应答的分子机制。

了解植物低温应答的分子机制对列产存植物耐寒品种非常重要。

在植物低温应答的分子机制中，ICE-CBF-COR途径研究较为深入。

1.1冷调节基因（cold-regulatedgenes，COR）

低温驯化可诱导大量蛋白质的合成，其中大多数既可对低温作出快速反应，又能受脱落酸（ABA）和水胁迫的诱导，编码这些蛋白的基因称为冷诱导基因（cold-inducedgenes）或冷调节基因（cold-regulatedgenesorcold-responsivegenes,cor）.目前已分离鉴定的冷诱导基因的植物主要有拟南芥、苜蓿、油菜、菠菜、马铃薯、大麦、小麦、水稻、黑麦。

冷调节基因（COR）的启动子区域含有具有5个碱基核心序列CCGAC的脱水反应元素DRE（Dehydrationresponsiveelement）做为顺式作用启动子元素，能在低温胁迫时激活COR基因的表达[3]。

MasakazuH等将Cu2COR19转入烟草，和对照烟草植株相比较，转基因植株电渗值较低、发芽率较高、抗冻性有所提高口[4]。

在这些基因表达的产物中，一些已证实是有己知酶活性的蛋白，它们可能对提高抗寒性有一定程度的作用,如拟南芥冷诱导基因中的fad8基因[5]和大麦中的blt4基因[6]，它们分别编码脂肪酸去饱和酶和一种脂肪迁移蛋白，通过这种脂肪酸去饱和酶或脂肪迁移蛋白改变质膜的组成以提高膜的冷稳定性。

1.2转录因子CBF（C-repeat-bindingfactor）

转录因子也称反式作用因子，是能够结合在某基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质，活化后从胞质转位至胞核，通过识别和结合基因启动子区的顺式作用元件,启动和调控基因表达。

一个典型的植物转录因子包括:

DNA结合域、低聚糖位置、转录调节区域和一个核酸定位信号[7]。

转录因子的研究时间已经很久，但是有关转录因子CBF的研究在近些年来对植物抗逆研究方面中才有了突破性的进展。

转录因子CBF是冷驯化过程中重要的转录因子，其作用是响应冷信号，是能结合到COR基因的DRE序列上,并快速启动下游COR基因的表达的蛋白质.对CBF的研究是植物冷驯化研究的重要组成部分，因此，有人把转录因子CBF看作是当植物面临低温时能够激活一些COR基因的开关[8]。

CBF可与CRT（c—repeat）／DRE（DehydrationResponseElement）元件结合。

这2个元件均含CCGAC核心序列，即LTRE（Low．temperature—responsiveElement）元件。

该核心序列普遍存在于冷诱导和脱水诱导基因的启动子中，为这类基因的诱导表达所必需[9]。

YamaguchiShinozaki和Shinozaki（1994）从RD29A基因的启动子中鉴定出一个9bp（TACCGACAT）的DNA调控元件DRE（dehydration-responsiveelement），（Yamaguchi-ShinozakandShinozal，1994）.同年，从COR15基因的启动子中又鉴定出另一调控元件CRT（C-repeat，TGGCCGAC）（Tbataetal.，2000）.这两个元件均含有CCGAC核心序列，即LTRE（low-temperature-responsiveelement）元件（Jiangetal.，1996）.随后证明，CRT/DRE或其核心序列普遍存在于冷诱导和脱水诱导基因的启动子中，为这类基因的冷诱导和脱水诱导表达所必需.

CBF转录因子广泛存在于拟南芥、玉米、番茄、油菜、烟草、水稻和小麦等许多种植物中，并参与多种基因的表达，该基因家族的成员都含有60个左右氨基酸残基组成的非常保守的DNA结合区（即AP2／ERF结构域），这类蛋白根据结构又可分为5类：

AP2类、DREB类、ERF类、RAV类及其他类型。

而在有关不同植物种属CBF基因表达调控和功能的研究，对拟南芥的报道较为全面，对棉花以及其它作物的研究相对较少[10]。

Stockinger等采用酵母单杂交（yeastone-hybrid）方法从拟南芥中分离出一个cDNA，其编码产物能与CRT/DRE特异结合，且在酵母系统中可激活含有CRT/DRE作为上游激活子序列的报告基因的转录（Stockingeretal.，1997）.所以，此蛋白具有转录激活因子的作用，被命名为CRT/DRE结合因子CBF1，Southern杂交结果表明，CBFI是一个单拷贝或低拷贝数基因.以包含CBFI编码区的片段作为探针，从拟南芥文库中又筛选获得CBF2和CBF3基因（Medinaetal.,1999;Liuetal.，2002）.与此同时，在独立进行的另一研究中，Liu等鉴定出5种DRE结合蛋白，其中DREBIA、DREBIB和DREBIC分别对应于CBF3、CBF1和

CBF2（Liuetal.,1998）.3个CBF基因构成一个小基因家族，以CBFI-CBF3-CBF2的顺序正向重复排列于拟南芥染色体IV短臂的72.8cm处，相互之间连锁.CBF3位于CBF1下游3kb处，CBF2位于CBF1少下游7kb处（Medinaetal.,1999;Liuetal.,2002）.在3个CBF基因的可读框中都不含内含子，CBF1包含642个核苷酸，CBF2和CBF3各含有651个核昔酸.3个可读框的核苷酸高度同源，其相似性大于80%，其氨基酸序列的同源性在85%以上.核苷酸和氨基酸序列高度同源、在染色体上紧密连锁以及转录方向相同等事实表明，3个CBF基因具有共同的起缘，可能是一个祖先基因连续重复两次后，通过突变或群体中的选择演变而成（Medinaetal.1999;Liuetal.，2002）.

在正常生长温度下，植物体内的CBF基因不表达，几乎检测不到其转录物的存在.将拟南芥植株转移到低温环境中，3个CBF基因的转录在15min内明显提高，在接下去的1~2h之间继续提高，2h后开始下降，但在24h内仍然保持着比正常温度下生长的植株中要高的水平.相反，在ABA处理和脱水胁迫条件下，没有CBF转录物积累.与拟南芥中的情况一样，油菜、小麦、黑麦和番茄中类似CBF基因的转录也在经受低温胁迫后15~30min内快速提高，几小时内达到最高，随后开始下降（Jagloetal.，2001）.这些结果表明，CBF基因的表达为低温特异诱导而不受ABA和脱水胁迫的调控.拟南芥中3个CBF基因冷诱导表达的模式相同，其转录物以非常相似的动力学过程积累（Medinaetal.，1999）.而且，CBF基因的这种冷诱导表达是非器官特异的，它们的转录物在叶、茎、根等器官中积累到相似的水平（Shinwarietal.,1998;Medinaetal.,1999）.CBF的表达受到了ICE1及HOS1等基因的调控。

未经冷驯化条件下，在-5~6℃环境中冷处理1-2d，拟南芥野生型植株全部死亡或存活很少，而超表达CBF1或CBF3的转基因植株仍保持相当高的存活率（Jaglo-ottosenetal.,1998;Liuetal.,1998;Kasugaetal.,1999;Liuetal.,2002）.

由于CBF转录激活因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达，所以利用CBF转录因子来改良植物抗逆性比起单纯的使用下游的某种单基因来改变植物的抗逆性更可以获得较为理想的综合效果，这为基因工程改良植物抗逆性提供了一种全新的技术途径，具有广阔的应用前[11]。

1.3转录激活因子（inducerofCBFexpression,ICE）

研究发现CBF基因的表达调控是一个复杂的过程，CBF蛋白的翻译需要其他因子的参与，因此，ICE因子得以发现。

ICE是在低温时诱导CBF家族表达的转录激活因子,它在低温时能特定地结合到CBF的启动子序列上,诱导CBF的表达,而后CBF结合到其下游目的基因启动子的DRE序列上,诱导COR基因的表达，进而提高植株的抗冻性[12]。

在已研究的ICE中，ICE1（inducerofCBFexpression1）是直接调控CBF表达的上游信号。

2003年Viswarmthan等人分离得到ICE转录因子中的ICE1（inducerofCBFexpression1）[13]。

ICE1编码含有一个bHLH（basichelix—loop—helix）结构域、具有DNA结合特征的MYC、MYB类蛋白，而上述蛋白通过bHLH结构域与MYCR／MYBR元件互作，诱导CBF基因的表达[14]。

二、抗冻相关蛋白

植物的抗寒力与体内的抗寒基因所表达的抗寒蛋白密切相关，起主要作用的蛋白有两种：

（1）冷诱导蛋白：

COR蛋白（ColdRegulatedprotein）等，在低温诱导后产生的蛋白嵌入膜脂双层或附着于膜表面，起稳定膜结构的作用，

（2）抗冻蛋白或重结晶抑制蛋白：

AFPs（Antifreezeproteins）、IAPs（Ice-activeproteins）或IRI（Icerecrystallisationinhibition）蛋白等，吸附或附着于冰晶表面，改变冰晶形态并抑制冰晶的生长。

低温诱导蛋白是植物在温度逆境条件下诱导产生的一系列蛋白,抗冻蛋白（AFPs）是是其中之一[15]，其本身是一类抑制冰晶生长的蛋白质，能以非依数性形式降低水溶液的冰点，但对熔点影响甚微，从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现差值，这种差值称为热滞活性（THA）或抗冻活性，差值越大，抗冻活性越大[16]，抗冻蛋白亦称为热滞蛋白或温度迟滞蛋白。

最初发现的抗冻蛋白（AFPs）是从极区海鱼中发现的,在鱼类和昆虫类中研究较深入。

有关植物（AFPs）的研究却是最近些年才开始的，直到1998年，英国York大学的Daw等首次在胡萝卜发现了AFPs及其基因[17]。

Griffith等[18]明确指出,在冷驯化的小麦（Triticumaestivum）中有内源AFPs的产生，Urrutia等[19]也在多种植物中发现了AFPs的存在。

研究发现,AFPs蛋白的一个显著特征是具有热滞活性,即该蛋白能以非依数性形式降低水溶液的冰点而不影响水溶液熔点。

AFPs能结合到冰核的表面抑制冰晶的生长,避免冰晶所造成的细胞物理性损伤。

研究还发现有些AFPs除了具有抗冻活性外,还具有一些酶活性和抗菌、抗虫活性。

目前已克隆到的植物抗冻蛋白基因有黑麦草1117kD的AFP的cDNA[20];冬黑麦中3117kD的AFPs的CHT基因,2418kD的AFPs的CHT46基因[21]等。

其中来自冬黑麦中的这两个抗冻蛋白基因，均已被转化到大肠杆菌中，检测结果表明，表达蛋白具有抗冻活性。

随着植物抗冻机理方面的研究加深，目前，已在许多植物中观察到抗寒蛋白的合成，新合成的抗寒蛋白有47kD拟南芥抗寒蛋白[22]、39kD小麦抗寒蛋白[23]等，它们的共同性质是：

热稳定性，富含甘氨酸、低芳香族氨基酸和高亲水性氨基酸，可使蛋白质保持高度的可伸缩性以保护细胞由于低温引起的脱水作用。

2002年Fan等人以胡萝卜幼苗为材料，进行PCR扩增，克隆到1个1099bp的基因，并鉴定为抗冻蛋白基因，将该基因连上CaMV35S启动子上，构建到pCAMBIA2300载体上并转人烟草中，观察发现在0℃条件下，转基因烟草所受的冻害明显低于对照烟草[24]。

这表明植物具有类似于鱼类的降低冰点、修饰冰晶形态和抑制冰重晶化等特性，在提高细胞在冰冻胁迫下的抗结冰能力中起着重要作用。

2008年，王艳等将鳖甲抗冻蛋白基因mpAFPl49转入烟草中[25]，低温处理2d，发现转基因烟草的抗冻性明显优于野生型，并且当温度恢复到室温后，转基因烟草恢复生长，而野生型烟草却因受到不可逆的低温冻害而停止生长。

在2010的最新报道中，ChunzhenZhang等人发现经过冷驯化后重，重结晶结晶抑制蛋白（IRI）中的LpIRI-a和LpIRI-b增强了宿主细胞的抗冻能力[26]。

除了上述两类蛋白与植物的抗冻相关外，Zhi-YanDu等发现ACBPs蛋白的过表达，使得植物中的二不饱和的甘油酯卵磷脂减少，植物抗冻性提高[27]。

目前从植物中分离克隆并能够用于转化的植物抗冻蛋白基因并不多，并且不同植物的抗冻蛋白的DNA和氨基酸序列几乎没有同源性，因此今后关于植物抗冻蛋白基因的分离克隆将是植物抗寒基因工程研究的一个热点[28]。

植物的抗冻性是在长期进化中逐渐形成的，不同的气候环境植物的抗寒能力不同。

植物冷驯化过程发生一系列生理反应。

PeterA.Gorsuch（2010）通过实时反转录聚合酶链反应（RT-PCR法），发现经低温处理过的成长叶片中CBF1含量增多，同时其它的基因的转录及翻译蛋白的含量也都有明显变化，说明低温可诱导从基因翻译到蛋白等一系列复杂环节[29]。

三、存在问题及展望

在地球环境日益恶化的过程中，气候环境变化变得更加复杂，寒冷气候变化变得更加无规律，而当今世界的种植面积又在与日剧减，粮食基础是人类一切活动的前提。

为此，唯有提高农作物的产量、品质才能解决人类的粮食总量与耕地少的问题。

因此提高植物的抗冻性，培育抗冻作物品种对于农业有十分重要的意义。

而这些的实现需要以基因工程为基础，需要更多的科技人员投入到其中。

提高植株的尤其是农作物的抗性已成为全球研究的重点之一。

在植物抗冻领域方面，植物基因工程的理论和技术体系已基本建立，但目前还不够完善，就目前存在以下问题

（1）关于农作物的抗冻性的研究主要集中在水稻、小麦等一些作物上，对于其他的作物的抗冻基因、抗冻蛋白及相关影响因子的研究较少，要建立更加全面的农作物的抗冻机理、信息，还需要更多的研究

（2）抗寒能力强弱由植物的基因决定，而植物的抗冻性状一般受多基因控制。

已分离鉴定出许多与低温胁迫有关的基因及其产物，但其具体功能尚需进一步研究。

低温胁迫下植物的响应是多基因表达产生的响应综合，但并非是简单累加，研究低温响应相关基因间以及它们表达的关系，使这些基因的表达效应达到最高，提高植物耐寒能力，延长植物耐受低温的时间，从根本上提高植物抗寒性。

可低温诱导的基因很多且大多已被克隆和鉴定，应用分子生物学手段，植物低温胁迫的响应生化和分子生物学机制正被逐步阐明，但仍有许多问题亟待研究，如低温信号是如何被感知等。

（3）植物中AFPs蛋白，虽然能降低原生质溶液冰点以尽量避免植物体内形成冰晶、抑制冰晶的重结晶、修饰胞外冰晶的生长形态；调节原生质体的过冷状态等。

但是具体作用机制还不很清楚，需要更深的研究[30]。

（4）在将外源基因导入模制作物基因中时，要考虑到外源基因与内源基因是否相协调，即使是同源性高的植物间的外源基因对内源基因影响相对较少，但还是会出现转基因植物出现的基因沉默问题，同源关系远的植物间的转基因面临的问题更多。

今后有必要利用生物化学与分子生物学手段分离和克隆更为优良的，适用于植物基因工程的抗冻蛋白基因，同时也需要对目前已获得的抗冻蛋白在结构、功能上进行深人分析。

尽管现在有关抗冻基因及转抗冻基因植物方面的研究不多，但在不远的将来一定会得到飞速的发展[31]。

（5）目前转基因工程多限于在模式植物拟南芥中，这也就表明我观察到抗冻性只能从单一模式作物拟南芥中获得，信息不全面。

我们研究植物抗寒性的一个最主要原因是提高农作物的抗寒性以增加其品质、产量，调整其种植地域。

为此今后的更多研究应转向农作物开发方面。

尽管现在有关抗冻基因及转抗冻基因作物方面的成功报道还不多，但是，我们相信，在科研人员的努力下，在不久的将来，导入抗冻基因的植物将会得到飞速的发展，植物的抗冻机理，抗冻基因、抗冻相关蛋白、及其他影响因子之间的相互关系将会得到更进一步阐明。

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