三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨.docx

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三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨

三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨

【摘要】　　目的探讨以芦丁作为对照品，采用三氯化铝比色法测定中药总黄酮含量的专属性，并建立ＡｌＣｌ３比色法测定中药总黄酮含量的最优条件。

方法通过对几类典型结构的黄酮类及多酚类化合物ＡｌＣｌ３显色前后的吸收峰进行比较，分析以芦丁为对照品的ＡｌＣｌ３比色法测定中药总黄酮的合理性。

结果ＡｌＣｌ３显色后，部分黄酮类物质在４２１ｎｍ处有较强吸收。

结论采用ＡｌＣｌ３比色法测定中药总黄酮的含量具有合理性，并建立了ＡｌＣｌ３比色法测定中药总黄酮含量的最优条件。

【关键词】ＡｌＣｌ３比色法总黄酮芦丁

　　Abstract：

ObjectiveＴｏｄｉｓｃｕｓｓｔｈｅｓｐｅｃｉａｌｉｔｙｏｆＡｌＣｌ３ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙｗｉｔｈｒｕｔｉｎａｓｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｆｏｒｅｖａｌｕａｔｉｏｎonｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｎｄｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆＡｌＣｌ３ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ．MethodsTomａｋｅａｓｅｒｉｅｓｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｎｄｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓｗｉｔｈｔｙｐｉｃａｌstructureｗｉｔｈＡｌＣｌ３ａｎｄmeasureｔｈｅｉｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓａｔｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ２００～６００ｎｍ．ResultsＡｔｔｈｅｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｏｆ４２１ｎｍ，ｓｏｍｅflavonoid-likecompoundsshowedｔｈｅｓｉｍｉｌａｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｗｉｔｈｒｕｔｉｎ．ConclusionＩｔｉｓｒｅａｓｏｎａｂｌｅｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅtheｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｂｙｕｓｉｎｇＡｌＣｌ３ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙｗｉｔｈｒｕｔｉｎａｓｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｓｔａｎｃｅａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆＡｌＣｌ３ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ．

　　Keywords：

ＡｌＣ３cｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ；Ｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；Ｒｕｔｉｎ

　　黄酮类化合物是以Ｃ６－Ｃ３－Ｃ６结构为基本母核的色原烷或色原酮的衍生物，以其广泛的药理作用倍受青睐，而中药材中总黄酮的含量测定成为近年来研究黄酮化合物所关注的焦点。

中药总黄酮的含量测定一般采用比色法、高效液相色谱法等［１］。

比色法是被《中国药典》所采用的最常见的总黄酮测定方法，其中又以ＮａＮＯ２－Ａｌ３－ＮａＯＨ比色法常用［２］。

这种方法以ＮａＮＯ２－Ａｌ３为显色剂，在碱性条件下，利用其与黄酮物质生成红色铝螯合物为特征，以芦丁为对照，在５１０ｎｍ处测定吸光度，从而得到待测物质总黄酮的含量。

郭亚建等［３］曾对这种方法的专属性进行了讨论，发现具有邻二酚羟基的非黄酮类物质在芦丁显色的最大波长处也有较强吸收，而黄酮类成分黄芩素、山柰酚在此波长处没有吸收，从而说明采用ＮａＮＯ２－Ａｌ３－ＮａＯＨ比色法，以芦丁作为对照，不能排除非黄酮类物质的干扰，这种方法测定中药总黄酮含量的专属性不强。

　　因此，本实验采用另一种常用的比色法：

ＡｌＣｌ３比色法，对几类典型结构的黄酮类化合物及多酚类化合物ＡｌＣｌ３显色前后的吸收峰进行比较，分析以芦丁为对照品的ＡｌＣｌ３比色法测定中药总黄酮的合理性，并对芦丁显色的ｐＨ值，ＡｌＣｌ３浓度、显色温度等条件进行优化研究。

　　1仪器与试药

　　Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３紫外分光光度计；ＰＨＳ－３Ｃ精密ｐＨ计。

　　试剂：

芦丁，葛根素，２，３－二羟基苯甲酸，绿原酸，和厚朴酚，阿魏酸，儿茶素，木犀草素，异鼠李素，山柰奈酚，槲皮素，金丝桃苷，蒙花苷、橙皮苷均购自中国药品生物制品检定所。

三氯化铝，醋酸钠，冰醋酸，甲醇均为分析纯，水为双蒸水。

　　2方法

　　供试品的制备以芦丁为例，精密称取芦丁标准品１０．０ｍｇ，甲醇定容至５０ｍｌ，配成０．２ｍｇ／ｍｌ的芦丁母液。

　　显色试剂的配置精密称取ＡｌＣｌ３１．３４ｇ，甲醇定容至１００ｍｌ，配成０．１ｍｏｌ／Ｌ的溶液。

精密称取ＣＨ３ＣＯＯＮａ·３Ｈ２Ｏ２．７２ｇ，双蒸水溶解至１００ｍｌ，配成０．２ｍｏｌ／Ｌ的溶液。

精密量取１．１５ｍｌ冰醋酸，双蒸水稀释至１００ｍｌ配成０．２ｍｏｌ／Ｌ的醋酸溶液［４，５］。

　　芦丁紫外吸收峰的扫描精密量取１ｍｌ芦丁母液溶液，置于１０ｍｌ容量瓶，加入２ｍｌ０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＡｌＣｌ３溶液，甲醇定容，充分显色２０ｍｉｎ［６］，在２００～６００ｎｍ范围扫描，记录吸光度值。

　　供试品紫外吸收峰的扫描精密量取１ｍｌ供试品，按“２．３”项下方法，在２００～６００ｎｍ扫描样品的紫外吸收峰。

　　标准曲线及可行性考察从芦丁母液中精密移取０．０，０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍｌ溶液，平行两份，第１份直接加入２ｍｌ０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＡｌＣｌ３显色２０ｍｉｎ；第２份加入２ｍｌ０．１ｍｏｌ／ＬＡｌＣｌ３，１ｍｌｐＨ为５．２的ＮａＡＣ－ＨＡＣ缓冲溶液，４０℃水浴显色１０ｍｉｎ，分别做标准曲线，并以金丝桃苷为样品，考察方法的可行性。

　　3结果

　　芦丁显色的紫外光谱图在黄酮类化合物的紫外光谱图上，主要有苯甲酰基部分引起的吸收带Ｉ和桂皮酰基部分引起的吸收带ＩＩ，加人铝盐可使黄酮类化合物与铝离子形成稳定的络合物，带Ｉ红移，吸光度明显增大。

当加入ＡｌＣｌ３充分显色后，芦丁吸收峰从３５９ｎｍ红移至４２１ｎｍ，且吸光度有所增加。

见图１。

　　图１芦丁加入ＡｌＣｌ３前后的紫外光谱图

　　ＡｌＣｌ３比色法专属性探讨在２００～６００ｎｍ对几种典型结构的黄酮类物质及多酚类物质ＡｌＣｌ３显色前后的紫外吸收峰进行比较，结果发现显色后金丝桃苷、异鼠李素、山柰奈酚的吸收峰位置和芦丁的相似，都在４２１ｎｍ左右，而其他物质的与芦丁的不同。

如图２为显色后各物质的紫外光谱图。

　　图２１４种物质显色后的紫外光谱图

　　显色条件的优化

　　ｐＨ值的影响采用ＮａＡｃ－ＨＡｃ缓冲盐溶液调节溶液的ｐＨ值，实验表明，当缓冲盐的ｐＨ值小于５．２时，芦丁的吸收峰在４０２ｎｍ左右，且吸光度值较小；当ｐＨ值在５．２～６．０时，吸收峰在４２１ｎｍ左右，吸光度值增大，如图３。

且当ｐＨ值为５．２时，吸光度值最大，因此选择ｐＨ为５．２的ＮａＡｃ－ＨＡｃ缓冲盐体系作为优化的显色条件之一。

　　ＡｌＣｌ３的浓度以２×１０－５ｇ／ｍｌ的芦丁溶液，ｐＨ值５．２的ＮａＡｃ－ＨＡｃ缓冲盐为条件，在６．６×１０－５～０．３３ｍｏｌ／Ｌ范围内讨论ＡｌＣｌ３浓度对芦丁吸收峰的位置及吸光度大小的影响，结果发现：

１∶６００≤n芦丁：

ｎＡｌＣｌ３≤１∶２时，即ＡｌＣｌ３浓度为３．３×１０－４～０．１ｍｏｌ／Ｌ时，吸收峰在４２１ｎｍ左右，且吸光度的值随ＡｌＣｌ３浓度的增加而变大。

如图３所示。

n芦丁：

ｎＡｌＣｌ３＞１：

２，即ＡｌＣｌ３浓度小于３．３×１０－４ｍｏｌ／Ｌ时，吸收峰在３６５ｎｍ左右，且吸光度减小。

n芦丁：

ｎＡｌＣｌ３＜１：

６００，即ＡｌＣｌ３浓度大于０．１ｍｏｌ／Ｌ，吸收峰移至４０４ｎｍ左右，且吸光度减小。

　　因此选择ＡｌＣｌ３浓度为０．１ｍｏｌ／Ｌ为芦丁显色的优化条件之一。

　　显色温度对吸光度的影响实验中由于显色时间较长，为了提高效率，采用水浴加热。

加热１０ｍｉｎ，考察水浴温度对吸收峰位置及吸光度大小的影响。

如图３。

结果表明，水浴温度４０℃是芦丁显色的优化条件之一。

　　图３显色条件对芦丁吸光度的影响

　　显色稳定性考察以２×１０－５ｇ／ｍｌ芦丁溶液，０．１ｍｏｌ／ＬＡｌＣｌ３，ｐＨ值５．２ＮａＡｃ－ＨＡｃ缓冲溶液为条件，考察显色的稳定性，结果表明，显色１５０ｍｉｎ，吸光度变化的RSD为２．８６２％，说明以芦丁为对照，ＡｌＣｌ３比色法显色稳定。

　　线性及可行性考察以一定浓度的金丝桃苷作为样品，直接加入２ｍｌ０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＡｌＣｌ３，显色２０ｍｉｎ，其标准方程：

Y＝０．００７７９＋２７３５１．１９０４８X，RＡ＝０．９９９２２，测得的金丝桃苷的浓度是２．７５×１０－４ｇ／ｍｌ，回收率为１２１．１５％；而优化后的方法：

２ｍｌ０．１ｍｏｌ／ＬＡｌＣｌ３，１ｍｌｐＨ为５．２的ＮａＡｃ－ＨＡｃ缓冲溶液，４０℃水浴显色１０ｍｉｎ，其线性方程为Y＝０．００１５３＋２９５９５．２０９３２X，RＢ＝０．９９９７２，测得的金丝桃苷浓度为２．３０６×１０－４ｇ／ｍｌ，回收率为１０１．５８％。

由此说明０．１ｍｏｌ／ＬＡｌＣｌ３，ｐＨ５．２的ＮａＡｃ－ＨＡｃ缓冲盐溶液，４０℃水浴显色１０ｍｉｎ，方法的准确度更高，为ＡｌＣｌ３比色法的优化方法。

　　4讨论

　　葛根素、蒙花苷、橙皮苷加入ＡｌＣｌ３，反应前后紫外吸收峰的位置没有发生改变，而其余物质的紫外吸收峰均发生红移。

从结构上分析，葛根素、蒙花苷、橙皮苷只存在５位羟基，不存在邻二酚羟基和３位羟基，由此可见ＡｌＣｌ３的显色反应主要发生在３位羟基、４位羰基和邻二酚羟基，只存在５位羟基、４位羰基时黄酮类物质与ＡｌＣｌ３不发生反应。

　　芦丁与ＡｌＣｌ３发生显色反应，生成黄色络合物，在４２１ｎｍ左右有较强吸收。

实验对几种常见的多酚类化合物紫外光谱图进行了扫描，结果表明对于含邻二酚羟基的非黄酮化合物：

２，３－二羟基苯甲酸、阿魏酸、和厚朴酚、绿原酸，ＡｌＣｌ３显色前后在４２１ｎｍ左右均没有吸收峰，消除了非黄酮类化合物对显色的干扰。

　　槲皮素为芦丁的苷元，显色后在４３７ｎｍ左右有较大吸收，而芦丁的最大吸收峰在４２１ｎｍ，说明黄酮的苷和苷元的极性相差较大，槲皮素３位羟基可能对反应有影响。

木犀草素的结构和芦丁相比，３位没有羟基，显色后在４１４ｎｍ有最大吸收，从而进一步说明３位羟基可能对ＡｌＣｌ３显色反应有影响。

　　具有典型结构的常见的黄酮类苷和苷元：

金丝桃苷，芦丁，异鼠李素，山柰奈酚，ＡｌＣｌ３显色前在４２１ｎｍ处无吸收，显色后均在芦丁的最大吸收峰４２１ｎｍ左右有较大的吸收。

在现今的实验条件下，对于大多数黄酮类中药材而言，多含有黄酮苷，常见的苷在此波长处有较强吸收，而非黄酮类物质在此处无吸收。

因此以芦丁作为对照，ＡｌＣｌ３比色法可以成为测定中药总黄酮含量的理想方法。

　　对于任一络合反应，溶液的酸碱度会影响金属离子的水解及存在形式，影响络合物的组成。

当采用盐酸调节显色溶液ｐＨ值时，因其酸性较强，破坏络合物的结构，无法测得中药总黄酮含量的真实值，而采用ＮａＡｃ－ＨＡｃ缓冲盐溶液时，加入前后芦丁的吸收峰位置不变，仍在３５９ｎｍ处，所以采用ＮａＡｃ－ＨＡｃ缓冲盐调节显色溶液的ｐＨ值。

　　从方法的可行性考察结果可以看出，以金丝桃苷为样品，采用２种方法考察回收率，优化的方法准确度更高，所以加入０．１ｍｏｌ／ＬＡｌＣｌ３，ｐＨ为５．２的ＮａＡｃ－ＨＡｃ缓冲溶液，４０℃水浴加热１０ｍｉｎ为ＡｌＣｌ３比色法的优化显色条件。

【参考文献】

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