06电镜 制样.docx

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06电镜制样

电子显微镜技术

1.电子显微镜样品制备技术:

利用电子显微镜进行研究，必须首先把观察的对象制备成特殊的样品，这种方法就叫做样品制备技术。

2.电子显微镜有它不同于光学显微镜的特殊性：

它是利用高速电子流作电子光源，照射在样品上，通过电子和样品发生各种作用之后而使样品成像的。

3.电子显微镜样品制备技术：

透射电镜样品制备技术，扫描电镜样品制备技术

第六章透射电子显微镜样品制备技术

1.透射电镜样品制备技术：

常规超薄切片技术，冷冻超薄切片技术，冷冻蚀刻（复型）技术，负染色技术，电镜细胞化学免疫电镜技术等

2.在制备生物样品的时候需要考虑的三个问题。

（1）．电子束的特点电子束的穿透能力是有限的，在常规透射电子显微镜的工作电压（50~100KV）的情况下，所观察的样品厚度最多不能超过0.1μm（1000埃）。

而一般的生物样品，象细胞的直径大约都在10μm以上；显然，电子束（除了在超高压电子显微镜之中）是穿透不过去的，那么也就无法研究它的内部结构。

（2）．生物组织的特点生物组织的主要成分之一是水，当生物样品放进电子显微镜的镜体的时候，镜体内的高真空必然使生物样品发生严重的脱水现象，这无疑地会改变组织内部的空间构型。

也就是说，这时候的样品已经不能代表原来生物组织的结构。

（3．）电子成像的机制在透射电子显微镜中，电子像的反差主要是由于样品散射电子能力之间的差别造成的。

但是构成生物样品的元素，如碳、氢、氧、氮、磷；这些元素之间散射电子的能力相差无几，所以说生物样品的固有反差总是很弱，观察起来会感到十分困难。

3.超薄切片的厚度在10-100nm之间。

它的制作过程与石蜡切片的制作过程很相似，也包括取材、固定（双固定）、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节。

而与石蜡切片不同的是，超薄切片操作过程更为细致与复杂，要求更为严格，而且所用的试剂及配方也不尽相同。

这成为电镜技术中最繁重、最艰难的工作，但又是最关键起决定作用的环节。

4.常规超薄切片取材要求

（1.材料新鲜"正常"生活状态下的组织

（2．快。

分离切取组织要迅速，尽快使组织与固定液作用，从而最大程度地保存组织在生活状态时的结构。

（3、小。

组织块大小主要决定于组织的性质和制备样品过程中要用到的溶液（包括固定液、缓冲液、脱水剂和包埋剂等溶液）的扩散和渗透能力。

一般样品块的大小不超过1立方毫米。

（4、准。

位置准确。

（5、取样时所用的器具必须干净，刀、剪等必须锋利，在操作时尽量避免拉、锯、压等动作对组织细胞造成的机械损伤。

5.常规超薄切片取材要求

（1）、动物组织：

大动物轻微麻醉，小动物绑牢并固定住，用锋利的刀、剪等暴露出取材部位，立即用吸管将配好的固定液滴到预定取材部位，然后用刀、剪、镊等准确而平稳地取下一块大小合适的组织块，置缓冲液中漂洗其表面之血液等捞出切成小于1立方毫米的小块，用牙签尖端挑起组织块，放入盛有冷却的固定液的小瓶中固定。

（2）、培养细胞、细菌等样品：

取足量的混悬液，离心，去上清液。

6.固定的作用（目的）：

就是在组织块从有机体中取出之后，终止细胞的生化过程，同时把细胞的超微结构改变控制在最小范围内，避免细胞自溶和造成人为假像。

7.目前，用于生物样品超薄切片技术的主要固定方法是化学固定法。

8．在化学固定法中，有两个很重要的过程：

一是形成稳定的蛋白胶体结构，这一结构的形成有赖于蛋白与蛋白之间稳定的交联作用，戊二醛、甲醛和四氧化锇都有很强的交联蛋白作用；另一个是稳定细胞以及细胞内部的膜结构，四氧化锇和醋酸铀都对膜结构的固定有重要作用，四氧化锇主要稳定不饱和脂类，而醋酸铀主要稳定磷脂。

9.常用的固定方式：

浸泡固定，灌注固定，培养细胞的固定。

10.浸泡固定

v这种方法比较简便，它适用于一些能允许在短时间内停止供血仍保持其功能和结构的器官或组织，以及一些病理检查的样品。

其方法是通过解剖（或手术）尽快从机体中取出所需的组织，并按取材的要求，把组织切成小块，进行常规的双重固定。

浸泡固定主要的缺点是易使离体组织发生自溶，且因固定剂穿透慢而导致组织深处固定不好。

一般的固定步骤包括：

前固定（一般使用醛类固定剂）→缓冲液洗涤→后固定（一般使用四氧化锇）→缓冲液洗涤。

11.灌注固定

v一些取材比较复杂或对缺氧比较敏感的器官或组织等，采用解剖取材浸泡固定得不到理想的结果，必须采用血管灌注固定。

所谓灌注固定就是将固定液通过血液循环的途径灌注到所需固定的组织中。

灌注固定时，首先必须把动物麻醉。

v全身灌注通常是直接用注射器（连接灌注液）通过左心室插入主动脉，并固定好针头。

当注入固定液时，此时则用小剪刀在右心房刺一小洞作灌注液回流，待组织已达适当硬度时（一般需要10-15分钟），取出所需组织，最后将组织块切成小块作常规浸泡双重固定。

血管灌注固定与浸泡固定比较，灌注固定操作较为复杂，而且对固定液的消耗也很大。

但它固定速度快，且固定均匀，因此，在保存细胞超微结果方面比浸泡固定优越得多

12.培养细胞的固定

v假如所固定的材料是微生物、单细胞原生动物、细胞提取物或组织培养的细胞，应先离心倒去上面的培养液（或上清液），然后才按常规方法进行双重固定。

对于试管或培养瓶培养的单层细胞，在倒去培养液之后，立即加入前固定液，用2000r/min离心15-20min使细胞成团，然后倒去上清液，缓慢加入前固定液，尽量避免细胞团被冲散，进行常规浸泡双重固定。

对于悬浮培养的细胞，可在培养液中直接加入前固定液，离心使细胞成团后，进行常规双重固定。

培养细胞的前固定液一般需预热到细胞的培养温度，在相同温度下进行固定。

13.使用戊二醛或戊二醛-多聚甲醛初步固定后再使用四氧化锇后固定的双重化学固定对大多数动物和植物组织都十分有效，因而成为目前大多数实验室常规的固定方法。

14.四氧化锇作为固定剂的优缺点

四氧化锇是一种很强的氧化剂，呈浅黄色结晶，其分子式OsO4，有极大毒性。

市售有密封的四氧化锇晶体和2%的四氧化锇水溶液两种。

四氧化锇晶体溶于水的速度很慢，必要时可以使用超声波设备来加速溶解。

四氧化锇作为固定剂有如下优点：

v1.四氧化锇可以与脂类、糖类和蛋白质反应。

其对脂类的固定作用可以补充醛类固定剂对脂类固定不足的缺点。

v2.能增加膜的反差，起到"电子染色"作用。

用四氧化锇固定的材料，往往细胞膜结构比较清晰。

这是由于被还原的锇沉积在细胞膜结构上，而锇是一种原子序数较高的元素，能加强它们的电子散射（质量密度大），所以四氧化锇作为固定剂的同时，又可作为电子染料，使被固定的样品图像有较好的反差。

v3.四氧化锇会破坏大部分细胞膜的半透膜特性，配制四氧化锇固定液不用考虑渗透压。

缺点

v1.四氧化锇渗透力弱，所以组织块要小（0.5～1mm3）。

否则，将从组织块表面到中间形成一个固定梯度，致使内部自溶过程继续进行引起组织块内部固定不好。

v2.不能保存糖原也不能有效固定核酸，而且对微管固定效果也不理想。

v3.固定的时间不宜太长。

时间过长，会使组织变脆，给切片带来困难。

此外四氧化锇与蛋白质、不饱和脂肪酸交联形成的复合体都是易溶于水的物质，特别是在长时间的固定后，更易溶解。

因此，使用四氧化锇固定样品，时间控制在1～2小时较为适宜。

v4.四氧化锇能与乙醇或醛类起氧化－还原反应，生成沉淀。

所以，醛类处理过的样品转入四氧化锇固定之前或四氧化锇固定之后转入乙醇溶液脱水之前都必须用相应的缓冲液充分漂洗干净。

14．醛类固定剂

v甲醛作为固定剂有如下特点：

v1.由于甲醛的分子量小，它的穿透能力比戊二醛强，反应温和，可用于细胞组织化学研究的前固定。

而且它不象戊二醛有两个醛基，引入较少的游离醛基到组织细胞中，因而在一些细胞组织化学研究中更有利。

但它的反应是部分可逆的，对细胞基质保存差，脱水后大部分基质丢失，所以不少实验室不单独使用甲醛来固定样品，而将它与戊二醛配制成混合固定液使用。

v2.甲醛对生物样品的作用与戊二醛相似，主要引起蛋白质交联。

v3.与戊二醛不同，甲醛既与DNA又与核蛋白反应，但这些反应都是部分可逆的。

另外，甲醛固定脂类的能力不强，可以与脂类相连的蛋白质作用。

戊二醛是一种五碳醛，含有两个醛基。

分子式为C5H8O2，分子量为100。

电镜固定通常用市售的（电镜专用）25％或50%的戊二醛水溶液稀释成需要的浓度。

戊二醛作为固定剂有如下特点：

v1.它的反应速度快，穿透力较强，是优良的前固定剂。

v2.它是蛋白质、糖原的强固定剂。

脂类固定较弱。

v3.用戊二醛前固定的样品不易变脆，可以进行长时间固定（但最好不要超过一个星期），因而适用于远离实验室或野外现场取材。

但戊二醛在稀释溶液中会自行发生一系列反应，因而固定液应尽可能新鲜配制，配制好的固定液和经戊二醛前固定后的样品应储存在4℃。

v4.戊二醛在固定过程中并不完全破坏细胞膜的半透膜特性，因而需要选择合适的固定液渗透压。

在实际操作中，1.0%-2.5%戊二醛（使用0.1M磷酸盐缓冲液或0.1M二甲胂酸盐缓冲液）在一般情况下，已经能提供理想的固定效果。

除非观察到明显的渗透压造成的假象，一般不对固定液专门进行渗透压调节。

15.固定方法

v1、2%~4%戊二醛预固定1-2小时或更长（单细胞或悬浮细胞的固定时间要适当缩短，前固定缩短为15-30分钟,植物材料有时可延长至数小时）。

v2、漂洗，用配制固定液用的缓冲液，数次更换漂洗，使样品在缓冲液中的时间保证在2小时至过夜。

v3、用1%锇酸后固定1.5-2小时。

（单细胞或悬浮细胞的固定时间要适当缩短，四氧化锇缩短为15-40分钟）。

v4、漂洗1小时以上，其间数次更换缓冲液。

16.常用的缓冲液

缓冲液在固定时主要是起着下列三方面的作用

v1.维持稳定的pH值，使固定液的pH保持在生理值上，一般选择7.0-7.4之间

v2.提供合适的渗透压，使细胞不发生肿胀或收缩

v3.提供适宜的离子成分。

缓冲液的种类很多，但目前电镜技术中最常用的缓冲液是磷酸盐和二甲胂酸盐缓冲液。

缓冲液的渗透压可通过改变缓冲液的体积克分子浓度或加入葡萄糖、蔗糖或氯化钠来调节，二价的正离子（Ca2+、Mg2+）也可以用来平衡离子成分。

v磷酸盐缓冲液的优点：

v·        无毒，容易操作

v·        价格便宜，容易获得

v·        能满足多数固定的需要

v缺点：

❿不能与Ca2+共存，容易产生沉淀

❿长期储存容易长菌。

磷酸缓冲的戊二醛固定液配方

v0.2mol/L缓冲液（ml）50505050  50

v25%戊二醛（ml）68101216

v双蒸水定容到（ml）100100100100100

v 戊二醛最终浓度1.5%2%2.5%3%4%

四氧化锇固定液的配制

v 2%四氧化锇储备水溶液：

v将装有1g四氧化锇的安瓿瓶连同用来存储四氧化锇储备液的棕色磨口瓶一起泡酸1-2天，充分冲水洗净酸液，并用蒸馏水冲洗几次。

取出安瓿瓶，用刻刀划几道刻痕，再用蒸馏水冲洗干净。

往棕色磨口瓶中加入50ml（若为0.5g四氧化锇则加入25ml）双蒸水，把安瓿瓶放入棕色磨口瓶内，盖上瓶塞，封闭瓶口，用力摇动棕色瓶，使安瓶与瓶壁碰撞破碎。

将棕色瓶存于4℃，放置1-2天后令其完全溶解即可使用。

v ·        1%四氧化锇固定液：

使用干净的5ml或10ml容量瓶，0.2M缓冲液和2%四氧化锇储备液（或市售的2%四氧化锇水溶液）以1：

1的比例定容

17.固定需要注意的问题

固定液的浓度一般戊二醛的浓度为2-4%之间，而四氧化锇常用的浓度为1-2%之间。

固定液的渗透压固定液的渗透压维持到接近生理值是必要的。

固定液的pH值固定液的pH值必须接近需要固定的组织或细胞的pH值。

由于大部分动物组织的平均pH值约为7.4，所以目前电镜固定液的pH值都选用中性（7.2-7.4）。

固定的温度一般来说，培养细胞固定时多使用培养温度，涉及免疫或细胞化学技术的样品多使用低温固定。

固定时间温度、固定剂和组织材料是固定时间长短的主要因素。

18．脱水

v脱水的目的及其影响

v因为绝大多数的包埋剂是不溶于水的，样品经双重固定及缓冲液冲洗后，在包埋之前必须彻底脱水，使既能与水又能与包埋剂互容的脱水剂替代水，以方便包埋剂渗透到组织或细胞中。

脱水过程对样品影响在于对脂类的抽提并引起组织细胞的收缩。

常用脱水剂及常用的脱水方案

v目前，常用的脱水剂有乙醇（ethanol）和丙酮（acetone），丙酮和酒精相比较而言，挥发性更强，脱水速度更快但更容易吸水而导致脱水不完全，且腐蚀性强，能抑制丙烯酸树脂的聚合。

一般来说，更倾向使用乙醇，因为它挥发性不强，毒性弱，与水的互溶性好。

v脱水过程逐级进行，一般的程序如下：

v（30%乙醇或丙酮5-10min）

v50%乙醇或丙酮5-10min

v70%乙醇或丙酮5-10min（或过夜）

v90%乙醇或丙酮10-15min

v100%乙醇或丙酮三次，每次10-15min

脱水过程中的注意事项

v脱水必须彻底

v脱水时间不宜过长，因为某些细胞成分如脂类等物质易被乙醇或丙酮溶解。

一般脱水的时间可根据组织的性质和组织块的大小而定。

v更换液体时动作要迅速

v经过常规双重固定的样品一般在室温下进行脱水

19.渗透和包埋

v渗透和包埋的目的

v渗透和包埋的目的是使包埋剂逐步渗透入组织细胞内，以便与细胞外的包埋剂同时聚合，保证能切出质量优良的超薄切片。

光学显微镜观察的切片一般是用石蜡包埋的，但电子显微镜观察的切片比石蜡切片要薄得多，因此，石蜡不适宜做超薄切片。

电镜用的包埋剂的特点：

1.对样品的伤害不大，聚合前后体积变化不大，环氧树脂聚合前后体积变化不大，而丙烯酸树脂收缩相对大一些

2.能经受电子束轰击

3.能溶于脱水剂或渗透的过渡试剂，并且有足够的低粘度，以保证能自由地渗入样品

4.透明度好，高倍电镜下不显示本身任何微细结构

5.毒性低，使用方便

常用包埋剂及配方

Epon812包埋剂

Epon812是一种进口树脂，它是一种长链的脂肪族环氧化合物，是目前国际上普遍采用的一种优良包埋剂，。

该包埋剂的配制方法甚多，但一般都按1961年Luft提出的配方进行。

其配方如下：

A液：

Epon81262ml

DDSA（软化剂）100ml

B液：

Epon812100ml

MNA（硬化剂）89ml

上述配方若改变A液和B液的比例则可调节聚合块硬度，A液多则软，B液多则硬。

通常冬天使用A:

B=2:

8；夏天使用A:

B=1:

9，可视组织的硬度和气候不同选择其比例。

配制时可先分别配制A液和B液，然后将A液和B液按一定比例混合后，再加入1\%-2\%的加速剂，边加边搅拌，使其充分混合。

为了方便操作，也有人将Epon812，DDSA，MNA三种成分按一定比例直接混合使用。

渗透和包埋的注意事项

1.包埋过程中，一切器材用品都要干净、干燥

2.配制包埋剂时，每加一种试剂都要充分搅拌均匀，并尽量防止产生气泡

3.若用Epon包埋，还要控制室内的湿度（最好相对湿度在60%左右），否则聚合不均匀，造成切片困难，甚至包埋完全失败

4.包埋块要保存在干燥器内，以防吸湿

渗透、包埋、聚合

v组织块（样品）在完全脱水后，即可进入渗透。

渗透最好是把盛有样品的小瓶装在旋转器中进行，以便使包埋剂能充分渗入细胞和组织。

渗透包括两步：

第一步将样品置于100\%脱水剂及等量包埋剂的混合液中（室温30分钟到几小时）；第二步将样品置于纯包埋剂中（室温几小时或过夜，中间一般更换两次新鲜的包埋剂）。

经过上述的渗透之后，即可进行包埋。

常规的包埋是把经渗透后的样品挑入已装有包埋剂的空心胶囊，或特制的椎形塑料囊，或多孔橡胶模板中，将包埋剂灌满，放入标签，然后根据包埋剂聚合时所需的温度及时间放进温箱聚合，制成包埋块。

vEpon812的聚合温度为：

37℃过夜，60℃24-36小时,或35℃12小时，45℃12小时，60℃24小时。

小样品的固定、脱水和包埋

v细胞悬浮液或颗粒状样品，如原生动物，血细胞，细菌，微藻等，可采用两种方法：

v1离心法

v离心（500-2000转/分钟），去上清液，加固定液或脱水液，每部离心。

v2琼脂预包埋法

固定后，离心去上清液，加入几滴熔化好的琼脂（2%，50℃），或牛血清蛋白（2%），进行所谓预包埋，小样品可以凝聚成团，当做组织块进行各种处理。

如果团块过大，可以切成小块。

对于这些小样品各种处理时间要缩短。

20.修块

v在进行超薄切片前，首先必须对包埋块进行修整。

修整可以用双面刀片手工修整，也可以使用修块机或者用玻璃刀或专门的修块刀在超薄切片机上进行修块，但它们的大致过程是相似的。

如图所示，首先依样品的位置，将包埋块顶端削平，露出组织，然后再削去周围的包埋剂及无关的部分，把要观察的部分修成四面锥体形（金字塔形），并将顶端的平面修成边界明显的平整的梯形（或方形），一般建议梯形的底边0.5mm，高小于0.5mm；正方形的表面每边在小于0.5mm比较合适。

21.超薄切片的制作

v超薄切片是在超薄切片机中进行的。

要切出比较理想的超薄切片除了有一台质量好的超薄切片机外，还要有渗透、包埋良好的包埋块，要有好的切片刀以及操作者的熟练技术等。

22.超薄切片的原理

v超薄切片机是一种贵重的精密仪器，根据不同的进刀系统（热膨胀式和机械进刀式）分为两类超薄切片机：

v热膨胀式超薄切片机是利用金属杆热胀冷缩产生长度变化的原理来进刀进行切片的，原理如下图所示，样品在样品杆的带动下快速通过锋利的刀刃，并削下样品突出刀刃的部分。

由于样品杆在电热丝的加热下稳定并极其缓慢地伸长，可以有控制地切下极薄（各个型号的切片机性能有所不同，一般能切出厚度为几纳米到上百纳米的切片）的切片。

切片的厚度取决于加热电流的大小，电流越大，膨胀越迅速，切片就越厚。

v机械进刀式超薄切片机是以微动螺旋和微动杠杆来提供微小进刀而切出切片的，它操作方便，而且可以切出较大面积的切片。

23.超薄切片的步骤

（1）安装包埋块；

（2）安装切片刀（玻璃刀或钻石刀）；

（3）调节刀与组织块的距离；

（4）调节水槽液面高度与灯光位置；

（5）调节切片速度和切片厚度，切片；

（6）将切片捞在有支持膜的载网上。

24.超薄切片前的准备工作

覆膜铜网的制备

v在电镜中，超薄切片必须置于一种金属网（如铜网等）上才能进行观察。

常用的铜网直径为3mm，铜网上的网孔大小和多少是不同的，可根据需要进行选择，常用的是200目的铜网。

有时为了使超薄切片能很好地贴附在铜网上并提高切片抵抗电子照射的能力，可以在铜网上铺上一层聚乙烯醇缩甲醛（Formvar）等材料的支持膜。

方法如下：

清洗铜网

v新铜网：

一般用无水乙醇清洗，便可使用。

旧的铜网：

可以经下列方法处理重新使用，先将旧铜网用载玻片压平，把压平的铜网放入小三角锥瓶中，倒入浓硫酸浸没铜网，并不断摇动三角锥瓶3-5min，倒去硫酸。

加入1mol/L氢氧化钠溶液中和硫酸，3-5min后倒去氢氧化钠，或直接用大量清水多次洗涤，再用蒸馏水冲洗4-5次，最后用无水酒精或丙酮洗几次，干燥备用。

支持膜的制备

把Formvar用氯仿配制成0.2%-0.3%制膜液

v把干净的玻片插入制膜液中静置片刻，取出后垂直放在一张滤纸上使其上的溶液晾干

v用锋利的刀片，沿膜四周划一刻痕后，将其缓慢地斜插入培养皿的双蒸水中，使膜与玻片分离，漂浮于水面上

v将洗干净的铜网排列于膜上，用一张稍大于膜面的滤纸覆盖其上，待滤纸刚湿润时，用镊子夹住滤纸一端，一边轻轻提引，一边翻转，将贴有铜网的滤纸取出水面，晾干备用

无碳方华膜膜厚度：

10-15nm

普通碳支持膜膜厚度：

10-20nm

纯碳膜膜总厚度：

20-35nm

微栅膜膜厚度：

15-20nm

制刀

目前用于超薄切片的刀有两种：

一是钻石刀（diamondknife），另一种是玻璃刀（glassknife）。

钻石刀虽然质量好，耐用，适用面广，但价格昂贵，而且容易损坏，需要小心保护。

玻璃刀虽然比较脆，不耐用，但价格低廉，适合初学者使用。

水槽制作

v经检查后的玻璃刀还须在刀上作一小水槽（trough），以便在切片时让切下来的超薄切片漂浮在液面上。

水槽制作的方法很多，但通常都是由预先成形的金属片、塑料水槽或胶带制成。

为了防止漏水，水槽和玻璃刀相接处须用石蜡或指甲油焊封。

在焊封时，应注意刀刃不要粘上石蜡或指甲油，以免损伤刀刃。

装块、装刀

v把修好的包埋块固定在定向头上，然后锁住样品杆，把定向头固定在样品杆上。

固定时，必须使组织块切面的底边成水平放置，若是修成梯形的切面要让长边在下方。

此外，夹持器夹着包埋块的位置应尽可能靠近样品面，以减少切片时的振动。

v把装有水槽的刀插入到刀夹，并固定于一合适的位置上。

对刀

对刀的步骤：

锁定样品杆和装刀后，先调整显微镜的位置及刀的位置，使其能看清刀刃以及能看到样品块的位置，调整样品面的位置让切面的两个平行边与刀刃平行。

然后选择好的刀刃段，用粗调进刀，并调整刀刃与样品面的角度，使刀刃与样品面完全平行。

最后用细调进刀，此时，若使样品面在刀刃上下运动，则可看到刀刃刚刚接触到样品面。

加水:

对完刀后，即可向刀槽内注入双蒸水或15%乙醇溶液。

开始可注入过量的液体并使液面成凸面，以保持浸湿刀刃，然后，在显微镜下吸回一些液体，当液面出现一反射光的亮面为止。

这个亮面不仅可以体现所需的水面，而且通过它还可以观察切片的质量及估计切片的厚度

25.切片厚度

v暗灰色40nm以下

v灰色40-60nm

v银白色60-80nm

v金黄色80-130nm

v紫色130-190nm

v蓝色190-240nm

v要获得较好的图象，一般需要银白色到淡黄色的切片。

26.捞片

v切片的捞取通常是用镊子夹住铜网，对准液面上的切片轻轻一沾（有支持膜时，膜面向下），使切片覆于铜网上，然后晾干切片。

此外，也可以用镊子夹住铜网，浸入水槽，先用眼睫毛或钢针固定切片条的位置或先让切片的一角轻轻贴附在铜网的一端，再把铜网自下而上提起。

此法操作难度较大，但有利于捞取连续切片。

26.

（1）组织块的下缘平行于刀刃时，形成了良好的连续切片带

v组织块修整面不正时，可能造成以下现象

v

（1）切片带向水槽一边弯曲而阻止切片前进

（2）切片不能互相接触而散开

27.超薄切片的注意事项

1.超薄切片过程中，切片成功与否，对刀很关键，所以对刀时，要仔细和耐心

2.刀槽中所用的蒸馏水可能是一个污染源。

所以尽可能用新鲜的蒸馏水（最好是双蒸水）。

此外，也应该注意切片时的碎屑等对水槽造成的污染

3.室内温度要相对稳定，室内要安静、清洁、无震动

4.固定刀时要注意不要损坏封固刀槽的石蜡，否则造成漏水，要重新作刀槽。

28.常见的超薄切片过程中的缺陷

颤痕颤痕是切片厚度的有规律的变化（厚薄交替变化）。

颤痕产生的一个原因可能是刀和样品相互作用时产生的高速振动

皱缩、刀痕

29.超薄切片的染色

生物样品主要由低原子序数的轻元素组成，如碳、氢、氧、氮等。

这些元素原子对电子的散射能力很弱，相互之间